Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Porphyromonas gingivalis jako organizm modelowy do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza

25.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53408

⸱

17 grudnia 2015

 , 
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia dwa protokoły: jeden do pomiaru bakterii beztlenowych, które mogą z powodzeniem zaatakować i przetrwać w organizmie gospodarza, a drugi do wizualizacji bakterii beztlenowych oddziałujących z komórkami gospodarza. Badanie to można zastosować do każdego uprawianego beztlenowca i dowolnego typu komórek eukariotycznych.

Streszczenie

Bakterie beztlenowe znacznie przewyższają liczebnie tlenowe w wielu ludzkich niszach, takich jak jelita, usta i pochwa. Ponadto infekcje beztlenowe są powszechne i często pochodzenia rodzimego. Zdolność niektórych patogenów beztlenowych do inwazji komórek ludzkich daje im środki adaptacyjne do ucieczki przed odpornością wrodzoną, a także do modulowania zachowania komórek gospodarza. Jednak zapewnienie, że bakterie beztlenowe są żywe podczas eksperymentalnego badania zdarzeń, może stanowić wyzwanie. Porphyromonas gingivalis, Gram-ujemny beztlenowiec, jest zdolny do inwazji różnych eukariotycznych komórek niefagocytarnych. W tym artykule opisano, jak skutecznie hodować i oceniać zdolność P. gingivalis do inwazji na ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Opracowano dwa protokoły: jeden do pomiaru bakterii, które mogą z powodzeniem zaatakować i przetrwać w organizmie gospodarza, a drugi do wizualizacji interakcji bakterii z komórkami gospodarza. Techniki te wymagają użycia komory beztlenowej w celu zapewnienia P. gingivalis środowiska beztlenowego w celu optymalnego wzrostu.

Pierwszy protokół opiera się na teście ochrony antybiotykowej, który jest głównie używany do badania inwazji bakterii na komórki gospodarza. Jednak test ochrony antybiotykowej jest ograniczony; Mierzone są tylko bakterie wewnątrzkomórkowe, które są zdolne do hodowli po leczeniu antybiotykami i lizie komórek gospodarza. Aby ocenić wszystkie bakterie wchodzące w interakcje z komórkami gospodarza, zarówno żywymi, jak i martwymi, opracowaliśmy protokół, który wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do zbadania interakcji gospodarz-patogen. Bakterie są znakowane fluorescencyjnie estrem 2',7'-bis-(2-karboksyetylo)-5-(i-6)-karboksyfluoresceiny acetoksymetylowej (BCECF-AM) i wykorzystywane do infekowania komórek eukariotycznych w warunkach beztlenowych. Po utrwaleniu paraformaldehydem i permeabilizacji 0,2% Triton X-100, komórki gospodarza znakuje się falloidyną TRITC i DAPI w celu znakowania odpowiednio cytoszkieletu i jądra komórkowego. Uzyskuje się wiele obrazów wykonanych w różnych punktach ogniskowych (stos Z) w celu czasowo-przestrzennej wizualizacji bakterii. Metody zastosowane w tym badaniu można zastosować do każdego uprawnego beztlenowca i dowolnego typu komórek eukariotycznych.

Wprowadzenie

Bakterie beztlenowe kolonizują prawie wszystkie powierzchnie ludzkiego ciała. Chociaż dominują we florze dróg moczowych i moczowo-płciowych, gdzie stężenie tlenu jest niskie, występują również w dużych stężeniach na skórze, ustach, nosie i gardle1. Bakterie beztlenowe są częstą przyczyną infekcji endogennych i często są izolowane z chorych miejsc. Jednak ze względu na ich wybredną naturę beztlenowce mogą być trudne do wyizolowania i hodowli. Badania z udziałem bakterii beztlenowych muszą być przeprowadzane w ograniczonych warunkach. Nowoczesne techniki hodowli beztlenowej pozwalają naukowcom naśladować warunki beztlenowe wymagane do badania wielu beztlenowych szczepów laboratoryjnych, a nawet izolatów klinicznych2,3.

Chorobotwórcze bakterie beztlenowe rozwinęły dynamiczną relację i współewolucję z komórkami gospodarza, w których przebywają. Większość beztlenowców jest podatna na zabicie przez odpowiedź immunologiczną gospodarza przed osiągnięciem poziomu zakaźnego. Jednak niektóre bakterie chorobotwórcze rozwinęły mechanizmy ucieczki lub osłabienia odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Osiągają ten cel poprzez takie mechanizmy, jak unikanie rozpoznania immunologicznego, neutralizacja mediatorów immunologicznych, zmiana odporności komórkowej, inwazja komórek gospodarza i zmiana sygnalizacji immunologicznej4. Porphyromonas gingivalis, Gram-ujemny beztlenowcowiec biorący udział zarówno w chorobach jamy ustnej, jak i zewnątrzustnych, jest jednym z przykładów wysoce przystosowanego patogenu bakteryjnego zdolnego do wywoływania zmian patogennych w gospodarzu5-7.

Kieszenie płytki nazębnej nagromadzone w głębokich szczelinach powstałych między zębami a tkanką błony śluzowej dziąseł mogą być siedliskiem bakterii beztlenowych, które są chronione przed tlenem atmosferycznym8. Te kieszonki przyzębne służą jako nisza dla różnych patogenów beztlenowych, takich jak P. gingivalis9. P. gingivalis jest kluczowym patogenem, który jest zdolny do przebudowy społeczności drobnoustrojów jamy ustnej w sposób sprzyjający rozwojowi i postępowi chorób przyzębia10. Wytwarza dużą liczbę czynników wirulencji, które są aktywne przeciwko szerokiemu spektrum białek gospodarza i zapewniają mechanizmy unikania mechanizmów obronnych gospodarza11. Jest również zdolny do infiltracji komórek nabłonka, śródbłonka, fibroblastów i więzadeł przyzębia in vitro12-14 i in vivo15. Skutecznie atakując komórki gospodarza, P. gingivalis może uciec przed odpornością gospodarza. Skuteczna inwazja komórek gospodarza nie tylko pozwala bakterii uciec przed obroną gospodarza, ale także służy jako rezerwuar dla przyszłej ponownej infekcji, a także zmienia komórkę gospodarza. Potrzebne są badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w adhezję i internalizację bakterii przez komórki gospodarza. Badania w kilku laboratoriach koncentrują się na zrozumieniu zdarzeń molekularnych związanych z internalizacją P. gingivalis przez komórki gospodarza, a także mechanizmów wykorzystywanych do tłumienia i przejmowania odpowiedzi immunologicznej oraz przetrwania wrogich mechanizmów obronnych gospodarza.

Istnieje wiele testów zdolnych do identyfikacji i charakteryzowania patogenów, które są zdolne do inwazji na komórki gospodarza. Jednak badania in vitro z patogenami beztlenowymi stwarzają wiele problemów eksperymentalnych dla badacza, głównie dlatego, że trudno jest przeprowadzić badania, które opierają się na nieporęcznych instrumentach przy braku tlenu. Sytuację pogarsza fakt, że komórki eukariotyczne potrzebują tlenu do wzrostu, a zatem muszą być przygotowywane oddzielnie w inkubatorach do hodowli tkankowych. Jednym ze sposobów na uniknięcie takich przeszkód byłoby przeprowadzenie badań w atmosferze tlenu, ale uniemożliwiłoby to rozwój bakterii beztlenowych. Inną metodą byłoby użycie bakterii zabitych termicznie do infekcji i badania interakcji między komórkami gospodarza. Istnieją jednak różnice między bakteriami zabitymi termicznie a żywymi, które zmniejszają znaczenie interakcji gospodarz-patogen16. Kluczowe znaczenie ma badanie żywotnych bakterii o niezmienionej ekspresji, oddziałujących z komórkami gospodarza; w związku z tym podano metody hodowli P. gingivalis w warunkach beztlenowych. Zademonstrowano również dwa proste, opłacalne protokoły oceny zdolności P. gingivalis do internalizacji przez ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Pierwszy protokół opiera się na popularnym teście ochrony antybiotykowej. Chociaż test jest prosty, podano pod uwagę przy stosowaniu mikroorganizmów beztlenowych. Drugi protokół wymaga użycia fluorescencyjnego mikroskopu skaningowego do wizualizacji oddziałujących i zinternalizowanych P. gingivalis. Każdy test ma swoje ograniczenia i zalety, które zostaną omówione, aby zapewnić badaczowi zarys badania inwazyjności bakterii beztlenowych. Chociaż obecny manuskrypt bada P. gingivalis i HUVEC, protokoły te mogą być stosowane w przypadku wielu innych bakterii beztlenowych, a także w przypadku innych typów komórek gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższe protokoły opisują metody hodowli oraz badania inwazji beztlenowego gatunku P. gingivalis; jednakże protokoły te mogą być stosowane w przypadku wielu innych patogenów beztlenowych. Mimo że w pracy wykorzystano komórki HUVEC, protokół ten może być stosowany do innych komórek eukariotycznych, zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych.

1. Użytkowanie i konserwacja komory beztlenowej

Uwaga: P. gingivalis jest beztlenowcem wrażliwym na normalne poziomy tlenu występujące w powietrzu otoczenia. Kontrolowane środowisko beztlenowe jest niezbędne do hodowli P. gingivalis.

  1. W tym kroku należy utrzymać sztuczną atmosferę określaną jako mieszana gazowa atmosfera beztlenowa (80% N2, 10% H2, 10% CO2) w winylowej komorze beztlenowej (Ryc. 1A). Do przenoszenia przedmiotów ze środowiska laboratoryjnego do komory beztlenowej należy używać śluzy (Ryc. 1B). Śluza obsługiwana jest ręcznie i wymaga dwukrotnego przepłukania gazem N2 przed wprowadzeniem mieszanki gazów beztlenowych.
  2. Aby bezobsługowo usuwać niepożądany siarkowodór, należy zastosować kolumnę do usuwania siarkowodoru (Ryc. 1C). Wewnątrz komory należy umieścić osuszacz w celu usunięcia H2O powstającej w wyniku działania katalizatora oraz aby uniknąć powstawania aerozoli ułatwiających rozprzestrzenianie się zanieczyszczeń.
    Uwaga: Siarkowodór jest naturalnym produktem metabolicznym wielu bakterii beztlenowych, a jego akumulacja jest toksyczna dla bakterii i może prowadzić do uszkodzenia elektroniki oraz skrócenia żywotności katalizatora.
  3. Należy użyć skrzynki z wentylatorem do cyrkulacji atmosfery komory przez katalizator palladowy, który usuwa tlen w obecności wodoru (Ryc. 1D).
    Uwaga: Recyrkulacyjny filtr atmosferyczny (HEPA) usuwa z powietrza zanieczyszczenia o rozmiarze 0.22 µm lub większe.
  4. Bakterie beztlenowe należy hodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C, znajdującym się wewnątrz komory beztlenowej. Podczas pracy w komorze beztlenowej należy stosować standardowe techniki aseptyczne.

Układ komory beztlenowej do badania wzrostu drobnoustrojów, obejmuje śluzę i jednostki filtracyjne.
Rycina 1. Winylowa komora beztlenowa i jej elementy. (A) Winylowa komora beztlenowa, całkowicie odizolowana od tlenu atmosferycznego, zapewnia miejsce pracy dla dwóch osób jednocześnie (32 in x 78 in). Zawiera inkubator ustawiony na 37 °C (z tyłu, na środku). (B) Śluza służy do przenoszenia przedmiotów ze środowiska laboratoryjnego do komory beztlenowej. Przedstawiono automatyczną śluzę obsługiwaną przez kontroler, który można zaprogramować do automatycznego wykonywania procedur próżniowania i płukania niezbędnych do stworzenia środowiska beztlenowego. (C) Kolumna do usuwania siarkowodoru zapewnia bezobsługowe, wysokowydajne usuwanie niepożądanego siarkowodoru. (D) W komorze beztlenowej rozmieszczono dwa wentylatory z katalizatorem, które pomagają cyrkulować atmosferę komory przez katalizator palladowy, który w obecności wodoru usuwa tlen. Komora beztlenowa została skonfigurowana zgodnie z instrukcjami producenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie bakterii beztlenowych

Uwaga: P. gingivalis jest organizmem aerotolerancyjnym i może być przechowywany w warunkach tlenowych, jednak nie będzie rósł w obecności tlenu na poziomie wyższym niż 6%17,18. Do właściwej hodowli P. gingivalis oraz innych gatunków beztlenowych niezbędna jest komora beztlenowa (Rysunek 1). Przed rozpoczęciem pracy z mikroorganizmami beztlenowymi wymagane jest odpowiednie przeszkolenie i instruktaż z zakresu obsługi komory beztlenowej19.

  1. Wszystkie pożywki płynne i płytki należy doprowadzić do stanu równowagi w warunkach beztlenowych przez co najmniej 12 hr przed rozpoczęciem eksperymentu, aby usunąć pozostały tlen.
  2. Przenieść P. gingivalis z zamrażarki -80 °C do komory beztlenowej i pozostawić do rozmrożenia.
  3. Wysiać P. gingivalis metodą kreskową na płytkach z agarem triptykaso-sojowym z krwią (TSA II z 5% krwią owczą). Owinąć płytki parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze beztlenowym przez 4-7 dni.
  4. Za pomocą sterylnych pętelek zaszczepić P. gingivalis do 3 ml bulionu brain heart infusion (BHI) uzupełnionego heminą i menadionem, który jest wzbogaconą, nieselektywną pożywką płynną do izolacji i hodowli drobnoustrojów beztlenowych i wymagających.
    Uwaga: Do długoterminowego przechowywania kultury bakteryjne przygotowane w BHI należy zmieszać z glicerolem lub DMSO (stężenie końcowe 10-20%) i umieścić w zamrażarce -80 °C.
  5. Przygotować kulturę startową P. gingivalis, wykonując rozcieńczenie 1:10 i pozwalając bakteriom rosnąć do średniej fazy logarytmicznej.

Uwaga: Wyznacza się gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej i dostosowuje stężenie bakterii dla każdego badanego szczepu. Dla P. gingivalis zawiesina o OD660 wynoszącej 0,7 odpowiada środkowej fazie logarytmicznej i stężeniu ~7 x 108 komórek/ml. Warunki hodowli opisane w powyższym protokole są specyficzne dla P. gingivalis i mogą wymagać dostosowania dla innych szczepów bakteryjnych.

3. Hodowla komórek śródbłonka

Uwaga: Należy zakupić pulę pierwotnych HUVEC i hodować je w pożywce podstawowej zawierającej czynniki wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Wysiać komórki HUVEC w kolbach T-75 w zagęszczeniu 2.5 x 105 komórek/kolba w 15 ml pożywki VEGF.
    Uwaga: Żywotność należy sprawdzić poprzez rozcieńczenie 1:1 z 4,0% błękitem trypanu. Komórki z uszkodzoną błoną zatrzymają błękit trypanu, natomiast zdrowe komórki z nienaruszoną błoną będą białe podczas obserwacji pod binokularowym mikroskopem świetlnym. Należy policzyć 100 komórek i upewnić się, że ponad 80% z nich jest żywotnych20.
  2. Wymieniać pożywkę co 2 dni na świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę VEGF, aż komórki osiągną ok. 80% konfluencji.
  3. Przemyć komórki raz ogrzanym PBS. Odseparować komórki z kolby T75, inkubując je z 2 ml trypsyny-EDTA (0,25%) przez 5 min, a następnie dodać 2 ml roztworu neutralizującego trypsynę.
  4. Zebrać zawiesinę komórek HUVEC do probówki stożkowej 50 ml. Wypłukać pozostałe komórki z kolb T-75 za pomocą PBS i przenieść je do probówek stożkowych 50 ml.
  5. Wirować komórki przy 200 x g przez 10 min.
  6. Usunąć nadsącz, a osad komórkowy zawiesić w 10 ml ogrzanej pożywki VEGF.
  7. Wyznaczyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub podobnego urządzenia do liczenia komórek.
  8. Obliczyć objętość zawiesiny komórkowej do dodania do płytki 6-dołkowej (400 000/dołek) lub płytki 12-dołkowej z szkiełkami podstawowymi (50 000/dołek). Komórki HUVEC będą gotowe do eksperymentów następnego dnia.

4. Test przeżywalności w inwazji/interakcji (wysiewanie)

Uwaga: Podczas wykonywania tego testu należy przygotować dwie płytki 6-dołkowe z komórkami endotelialnymi wysianymi w zagęszczeniu 400,000 cells/well. Jedna płytka posłuży do oceny bakterii przytwierdzonych do komórek gospodarza oraz zinternalizowanych przez nie. Druga płytka posłuży do określenia liczby bakterii wewnątrzkomórkowych. Płytka 6-dołkowa umożliwia wykonanie trzech powtórzeń dla dwóch próbek w jednym doświadczeniu. Aby zapoznać się ze schematem tego protokołu, należy odnieść się do schematu blokowego testu przeżywalności (Rycina 2).

  1. Przygotować bakterie beztlenowe zgodnie z opisem powyżej (patrz sekcja 1), aż osiągną średnią fazę wzrostu logarytmicznego (OD660 0,5-0,7).
  2. Odwiruwać bakterie przy 5 000 x g przez 10 min.
    Uwaga: Jeśli wirówka znajduje się poza komorą beztlenową, próbki bakterii należy transportować w szczelnie zamkniętej probówce 15 ml, owijając zakrętkę parafilmem, aby zapobiec przeciekowi tlenu.
  3. Osad P. gingivalis przenieść z powrotem do komory, a nadsącz odrzucić. Przemyć PBS i ponownie odwiruwać bakterie przed resuspensją w pożywce VEGF. Przygotować zawiesiny dla wszystkich testowanych szczepów bakterii przy OD660 wynoszącej 0,7, co odpowiada średniej fazie logarytmicznej (~7 x 108 komórek/ml). Bakterie są teraz gotowe do zakażenia.
  4. Przenieść płytki 6-dołkowe zawierające HUVEC z inkubatora do hodowli tkankowych do komory beztlenowej. Usunąć pożywkę i przemyć trzy razy beztlenowym PBS. Do każdego dołka dodać 2 ml beztlenowej pożywki VEGF i umieścić płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze beztlenowym na 20 min, aby wyrównać temperaturę przed zakażeniem.
    Uwaga: Wysiać bakterie na płytki z agarem krwawym, aby upewnić się, że szczepy użyte do zakażenia są homogeniczne i nie są zanieczyszczone w momencie zakażania.
  5. Zakażać komórki gospodarza bakteriami przy wielokrotności zakażenia (MOI bakterie: gospodarz) wynoszącej 100:1.
    Uwaga: Liczbę komórek HUVEC określa się poprzez wykonanie testu wykluczania trypanu w pojedynczym dołku przed zakażeniem. Liczbę komórek bakteryjnych określa się za pomocą gęstości optycznej (np. OD 0,5 = 5 x 108 komórek/ml). Stężenie bakterii dostosowuje się do odpowiedniego MOI na podstawie stężenia HUVEC21.
  6. Umieścić płytki 6-dołkowe z zakażonymi HUVEC w inkubatorze beztlenowym i pozostawić bakterie w interakcji z komórkami gospodarza na 30 min.
  7. Przygotować saponinę w BHI (1,0% w/v) wewnątrz komory beztlenowej i przefiltrować przez filtr 0,2 µm.
  8. Przeżywalność bakterii przytwierdzonych i zinternalizowanych.
    1. Wyjąć płytki z inkubatora, odessać pożywkę, przemyć trzy razy beztlenowym PBS i dodać 2 ml przefiltrowanej 1,0% saponiny (przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 4.8). Inkubować przez 15 min, aby umożliwić lizę komórek gospodarza.
    2. Zeskrobać dno każdego dołka skrobakiem do komórek. Zebrać mieszaninę komórkową z każdego dołka i wykonać rozcieńczenie 1:1 w BHI.
    3. Przystąpić do wykonania rozcieńczeń seryjnych próbki. W zależności od gatunku i stężenia bakterii dostosować rozcieńczenia seryjne. Rozpocząć od rozcieńczeń 1:100 lub 1:1 000.
    4. Wysiać 200 µl wybranego rozcieńczenia na płytki z agarem krwawym. Owinąć płytki parafilmem i umieścić w inkubatorze beztlenowym w temperaturze 37 °C.
    5. Po siedmiu dniach inkubacji w 37 °C wyjąć płytki i policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU), korzystając z pulpitu świetlnego do ręcznego zliczania kolonii.
      Uwaga: Wylicza się CFU. W przypadku większych ilości CFU można wykonać zdjęcia i użyć oprogramowania komputerowego, aby ułatwić zliczanie CFU.
  9. Przeżywalność bakterii zinternalizowanych.
    1. Wyjąć płytki z inkubatora. Przemyć trzy razy beztlenowym PBS i dodać 2 ml pożywki VEGF z dodatkiem antybiotyków (300 µg/ml gentamycyny i 400 µg/ml metronidazolu).
    2. Inkubować przez 1 h. Należy przetestować antybiotyki, aby upewnić się, że są one w 100% skuteczne w zabijaniu danego szczepu bakterii oraz że nie przenikają do komórek gospodarza22,23.
    3. Odessać pożywkę, dodać 2 ml przefiltrowanej 1,0% saponiny. Inkubować przez 15 min, aby umożliwić lizę komórek gospodarza.
    4. Zeskrobać dno każdego dołka skrobakiem do komórek. Zebrać mieszaninę komórkową z każdego dołka i wykonać rozcieńczenie 1:1 w BHI.
    5. Przygotować rozcieńczenia seryjne próbki (1:100, 1:1 000).
    6. Wysiać 200 µl wybranego rozcieńczenia na płytki z agarem krwawym. Owinąć płytki parafilmem i umieścić w inkubatorze beztlenowym.
    7. Po siedmiu dniach inkubacji w 37 °C wyjąć płytki i policzyć CFU.

Schemat procesu hodowli komórek śródbłonka; interakcja bakterii, inwazja, analiza CFU na płytkach BHI.
Rycina 2. Schematyczny przedstawienie protokołu stosowanego do badania przeżywalności bakterii beztlenowych w obecności komórek eukariotycznych. Obie analizy – całkowitej przeżywalności bakterii oraz przeżywalności bakterii zinternalizowanych – mogą być przeprowadzane jednocześnie. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

5. Internalizacja bakterii do komórek gospodarza (mikroskopia fluorescencyjna)

Uwaga: P. gingivalis jest znakowany 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester (BCECF-AM). BCECF-AM to niefluorescencyjny barwnik przenikający przez błonę komórkową; jego konwersja do fluorescencyjnego BCECF pod wpływem wewnątrzkomórkowych esteraz może wskazywać na żywotność komórek. P. gingivalis jest znakowany barwnikiem BCECF-AM, a następnie wykorzystywany do zakażenia komórek eukariotycznych. Po zakażeniu komórki są utrwalane i znakowane DAPI oraz TRITC-faloidyną. Barwnik DAPI, użyty do barwienia jądra komórki eukariotycznej, znakuje również jądro komórki bakteryjnej, co stanowi środek kontrolny do identyfikacji bakterii nieżywotnych, które nie są w stanie metabolicznie rozszczepić BCECF-AM. Komórki gospodarza są uwidocznione za pomocą TRITC-faloidyny, czerwonego barwnika do aktyny.

  1. Autoklawować szkiełka nakrywkowe. Aseptycznie umieścić szkiełka nakrywkowe w płytkach 12-dołkowych przed wysianiem komórek śródbłonka w zagęszczeniu 5 x 104 komórek/dołek. (Przygotować dzień przed eksperymentem)
  2. Przygotować komórki śródbłonka na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 18 mm (grubość #1.5) w płytkach 12-dołkowych zgodnie z powyższym opisem.
  3. Przygotować bakterie beztlenowe wyhodowane do środkowej fazy logarytmicznej (OD660 = 0,5-0,7) zgodnie z opisem w sekcji 1.
  4. Przemyć bakterie 2x beztlenowym PBS, wirując przy 5,000 x g i resuspendując osad w PBS do stężenia 5-7 x 108 komórek/ml.
  5. Do 2 ml zawiesiny bakteryjnej (5-7 x 108 komórek/ml) dodać 20 µl 0,2 mM BCECF-AM, aby uzyskać końcowe stężenie BCECF-AM wynoszące 2 µM.
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min w ciemności.
  7. Przenieść płytki z komórkami śródbłonka wysianymi na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 18 mm (grubość #1.5) z inkubatora do hodowli tkankowych do komory beztlenowej. Przemyć PBS i wymienić medium na beztlenowe medium z VEGF.
    Uwaga: Zweryfikować żywotność komórek HUVEC pod mikroskopem świetlnym. HUVEC powinny osiągnąć konfluencję ~80%, a ich morfologia powinna być zgodna z opisem producenta.
  8. Wirować oznakowane bakterie przy 5,000 x g przez 10 min w celu usunięcia pozostałości barwnika BCECF-AM. Resuspendować w 2 ml beztlenowego medium z VEGF.
  9. Zainfekować komórki gospodarza oznakowanymi bakteriami przy MOI 100:1 (bakterie: gospodarz).
  10. Inkubować w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  11. Po infekcji przemyć komórki PBS trzy razy i utrwalić w świeżo przygotowanej 4,0% paraformaldehydzie przez 10 min.
    Uwaga: Po utrwaleniu komórek eksperyment można kontynuować poza komorą beztlenową.
  12. Przemyć szkiełka nakrywkowe PBS trzy razy.
  13. Dodać 1 ml 0,2% Triton X-100 na 10 min.
  14. Przemyć szkiełka nakrywkowe PBS trzy razy.
  15. Dodać do szkiełek nakrywkowych 50 µl falloidyny TRITC (50 µg/ml) na 45 min.
  16. Przemyć szkiełka nakrywkowe trzy razy, wyjąć je z płytki 12-dołkowej i umieścić na szkiełku przedmiotowym w miękkim medium montażowym zawierającym DAPI. Zabezpieczyć krawędzie lakierem do paznokci.
    Uwaga: Preparaty na szkiełkach można przechowywać przez kilka miesięcy w ciemności. Należy unikać ekspozycji na światło, aby zapobiec fotowyblakaniu.
  17. Obejrzeć preparaty za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    1. W tym celu użyć 34-kanałowego systemu spektralnego (32-kanałowy detektor matrycowy i dwa boczne detektory PMT oraz detektor światła przechodzącego) skonfigurowanego na statywie AxioObserver (odwróconym) z zmotoryzowanym stolikiem XY. System posiada pięć laserów: niebieską diodę (405 nm), wieloliniowy argon (458, 488, 514 nm), zieloną diodę (561 nm), czerwony HeNe (633 nm) oraz laser impulsowy 440 nm. Wyposażyć system w obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) z 2 hybrydowymi detektorami GaAsP (dla FRET-FLIM).
    2. Wykryć fluorescencję DAPI i TRITC w jednym kanale, używając filtra dwupasmowego z długościami fali wzbudzenia 340-380 nm i 540-560 nm oraz filtrów emisyjnych odpowiednio 435-485 nm i 570-590 nm. Fluorescencję BCECF-AM wykryć za pomocą filtra z długością fali wzbudzenia 440-500 nm i filtra emisyjnego 510-590 nm.
      Uwaga: Kontrole dla BCECF-AM należy przeprowadzić dla każdego badanego szczepu bakterii, aby zapewnić prawidłowe oznakowanie żywych bakterii. Najpierw należy potwierdzić, że bakterie nieżywe są DAPI-dodatnie i BCECF-ujemne. Po drugie należy upewnić się, że żywe bakterie mogą metabolizować BCECF-AM do fluoresceiny BCECF. W celu optymalizacji oznakowania może być konieczne przetestowanie różnych stężeń bakterii lub barwnika BCECF-AM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane powyżej protokoły zostały wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen pomiędzy P. gingivalis a komórkami śródbłonka. W badaniu wykorzystano szczepy P. gingivalis W83 oraz P. gingivalis V3150 z delecją PG0228. Przewiduje się, że PG0228 koduje białko, które może zmieniać poziomy RNA i białek, co w konsekwencji może wpływać na interakcję P. gingivalis z komórkami gospodarza. Aby zbadać wpływ PG0228 na zdolność P. gingivalis do interakcji z komórkami gospodarza, p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wszystkie powyższe metody można wykorzystać do zaprojektowania specyficznych testów do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami eukariotycznymi. Istnieje jednak kilka kwestii, które należy wziąć pod uwagę, aby pomyślnie przeprowadzić eksperymenty. Pierwszym z nich są szczepy drobnoustrojów, które mają być wykorzystane w badaniu.

Kluczowe znaczenie ma porównanie dwóch szczepów zarówno z testem przeżycia, jak i analizą mikroskopową, aby znajdowały się one w podobnych fazach wzrostu i o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scottowi Hendersonowi, Dr. Toddowi Kittenowi, Dr. Justinowi Hutchersonowi, Dr. Catherine Jauregui i Collinowi R. Berry'emu. Praca ta była wspierana przez granty NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 i R01DE023304 dla J.P. Lewisa.

Mikroskopia została wykonana w Zakładach Mikroskopii Wydziału Anatomii i Neurobiologii VCU, częściowo wspieranych przez finansowanie z grantu NIH-NINDS Center (5P30NS047463).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Typ BCoy Laboratory Products 
TSA II Tryptikaza Agar sojowy z 5% krwią owcząBBL221261
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej 10 dawców Pula 10 dawców TechnologiaLifeLineFC-0044
VascuLife VEGF Medium Kompletny zestawLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinaRiedel-de Haen16109
Sól siarczanu gentamycynySigma-AldrichG-1264
MetronidazolSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Falloidyna Sigma-AldrichP1951
18 mm Okrągłe szkiełka nakrywkoweMikroskopia elektronowa Sciences72222-01
Medium montażowe VectaShield z DAPIVector LaboratoriesH-1200
Inkubator Inkubator Winylowo-Beztlenowy

Bibliografia

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787(2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. III C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039(2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616(2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226(2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcja z kom rk gospodarzatest ochrony antybiotykowejmikroskopia fluorescencyjnakomora beztlenowainfekcja HUVECznakowanie BCECF AMliczenie CFUmikroskopia konfokalna
Porphyromonas gingivalis jako organizm modelowy do oceny interakcji bakterii beztlenowych z komórkami gospodarza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.