Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Hydrofobowe pigmenty, takie jak chlorofile (Chls), bakteriochlorofile (BChls) i karotenoidy, są głównymi kofaktorami w centrach reakcji fotosyntezy i białkach zbierających światło, które przeprowadzają transport elektronów oraz wychwytywanie i transfer energii świetlnej. Centra reakcji i większość kompleksów zbierających światło wiążące Chl to białka transbłonowe. Białko Fenna-Matthews-Olson (FMO) nietlenowych fotosyntetycznych bakterii zielonosiarkowych ^1,2 oraz białko perydyniny-Chl (PCP) bruzdnic3 ^są wyjątkowymi przykładami rozpuszczalnych w wodzie białek zbierających światło. Rozpuszczalne w wodzie białka wiążące chlorofil (WSCP) roślin Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae i Amaranthaceae ^4,5 są kolejnym unikalnym przykładem, jednak w przeciwieństwie do FMO i PCP, nie biorą one udziału w zbieraniu światła ani w żadnej z pierwotnych reakcji fotosyntezy, a ich dokładne funkcje fizjologiczne są jeszcze niejasne ^5-8. Ich wysokie powinowactwo do wiązania Chl doprowadziło do sugerowania funkcji jako przejściowych nośników Chls i pochodnych Chl ^9,10. Alternatywnie postawiono hipotezę, że WSCP odgrywa rolę w wymiataniu Chls w uszkodzonych komórkach i chroni przed uszkodzeniem fotooksydacyjnym wywołanym przez Chl ^7,11-13. Niedawno zasugerowano, że WSCP działa jako inhibitor proteazy i odgrywa rolę podczas odporności roślinożerców, a także reguluje śmierć komórek podczas rozwoju kwiatów ¹⁴. WSCP dzielą się na dwie główne klasy w zależności od ich właściwości fotofizycznych. Pierwsza klasa (klasa I, np. z albumu Chenopodium) może ulegać fotokonwersji po oświetleniu. WSCP klasy II z roślin kapustnych, które nie są poddawane fotokonwersji ^5,10, są dalej dzielone na klasę IIa (np. z Brassica oleracea, Raphanus sativus) i IIb (np. z Lepidium virginicum). Strukturę WSCP klasy IIb z Lepidium virginicum rozwiązano metodą krystalografii rentgenowskiej z rozdzielczością 2,0 A ⁸. Ujawnia symetryczny homotetramer, w którym podjednostki białkowe tworzą hydrofobowy rdzeń. Każda podjednostka wiąże pojedynczy Chl, co powoduje ścisły układ czterech ciasno upakowanych Chl w rdzeniu. Ten prosty układ wszystkich Chl sprawia, że WSCP są potencjalnie użytecznym systemem modelowym do badania wiązania i składania kompleksów Chl-białko oraz wpływu sąsiednich Chls i środowisk białkowych na właściwości spektralne i elektroniczne poszczególnych Chl. Co więcej, może dostarczyć szablonów do konstruowania sztucznych białek wiążących Chl, które mogą być wykorzystane w modułach zbierających światło w sztucznych urządzeniach do fotosyntezy.

Rygorystyczne badania rodzimych WSCP nie są wykonalne, ponieważ kompleksy oczyszczone z roślin zawsze zawierają niejednorodną mieszaninę tetramerów z różnymi kombinacjami Chl a i Chl b ⁹. W związku z tym wymagana jest metoda łączenia rekombinowanych ekspresji WSCP z Chls in vitro. Jest to wyzwaniem ze względu na znikomą rozpuszczalność Chls w wodzie, co uniemożliwia złożenie kompleksu in vitro poprzez proste zmieszanie rozpuszczalnych w wodzie apoprotein z pigmentami w roztworach wodnych. Wykazano składanie in vitro przez zmieszanie apoprotein z błonami tylakoidów ¹⁵, ale metoda ta jest ograniczona do natywnych Chls obecnych w tylakoidach. Schmidt i wsp. doniesiono o połączeniu kilku pochodnych Chl i BChl z WSCP z kalafiora (CaWSCP) poprzez rekombinacyjną ekspresję białka znakowanego histydyną w E. coli, unieruchamiając je na kolumnie powinowactwa do Ni i wprowadzając pochodne Chl rozpuszczone w detergentach ¹¹. Zgłoszono również pomyślne odtworzenie rekombinowanych WSCP z A. thaliana ⁶ oraz brukselki (BoWSCP), dzikiej rzodkwi japońskiej (RshWSCP) i pieprzu wirginijskiego (LvWSCP) za pomocą podobnej metody.

Tutaj prezentujemy nowatorską, ogólną, prostą metodę łączenia Chls z WSCP, która nie wymaga znakowania ani immobilizacji białek. Polega ona na przygotowaniu emulsji z ich wodnych roztworów rozpuszczalnych w wodzie apoprotein w oleju mineralnym. Białka są zatem zamknięte w mikrokropelkach typu woda w oleju (W/O) o bardzo wysokim stosunku powierzchni do objętości ¹⁶. Kofaktory hydrofobowe są następnie rozpuszczane w oleju i są łatwo wprowadzane do kropelek z fazy olejowej. Opisano zastosowanie metody składania kilku wariantów apoprotein WSCP rekombinowanych wyrażanych w E. coli z Chl a. Pokazujemy składanie z surowego lizatu bakterii z nadekspresją WSCP, które mogą być wykorzystane jako system przesiewowy do opracowania nowych białek wiążących Chl.

1. Przygotowanie roztworów magazynowych

1. ETAP KRYTYCZNY: Wykonaj wszystkie etapy przygotowania chlorofilu w kapturze chemicznym, w zielonym świetle (520 nm) lub w ciemności, aby zminimalizować fotouszkodzenia. Zawsze dodawaj azot lub argon przed zamrożeniem pigmentów do przechowywania. Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki są klasy analitycznej.
2. Zważyć około 5 mg liofilizowanych komórek Spirulina platensis lub innych komórek cyjanobakterii zawierających tylko Chl a w błonach tylakoidów i rozdrobnić za pomocą moździerza i tłuczka.
3. Rozdrobnione komórki załadować na szklaną kolumnę i przemyć około 50-100 ml 100% acetonu w celu usunięcia karotenoidów. Wyrzuć eluowaną frakcję pomarańczowo-zieloną.
   Uwaga: Jeśli frakcja pomarańczowa nie zostanie wymyta 100 ml acetonu, kontynuuj mycie komórek acetonem, aż zielona frakcja zacznie się wymywać.
4. Zamień aceton na 100% metanol i zbierz zieloną frakcję zawierającą Chl a. Objętość eluowanej frakcji może wahać się w granicach 50-100 ml. Na początku eluowana frakcja ma ciemnozielony kolor, który pod koniec elucji zmienia się w bladozielony. Gdy kolor eluowanej frakcji zmieni się w bladozielony, zatrzymaj elucję.
5. Odparować metanol za pomocą wyparki obrotowej, aż ekstrakt całkowicie wyschnie. Nie podgrzewaj roztworu; upewnić się, że temperatura łaźni wodnej parownika nie przekracza 30 °C.
   Uwaga: Czas parowania zależy od objętości odparowywanej frakcji metanolu i może wynosić od 10 do 60 minut. Ważne jest, aby całkowicie wysuszyć ekstrakt.
6. Rozpuść pigmenty z wysuszonego ekstraktu w niewielkiej objętości eteru dietylowego (około 5-10 ml) i przefiltruj przez watę. Upewnij się, że pigmenty są całkowicie rozpuszczone w eterze przed filtrowaniem.
7. Odparować eter dietylowy aż do całkowitego wyschnięcia pigmentów (10-30 min).
   Uwaga: Suche pigmenty można oczyścić i przechowywać w azocie lub argonie w temperaturze -20 °C, w ciemności do czasu dalszej obróbki.
8. Suche pigmenty należy rozpuścić w jak najmniejszej objętości 100% metanolu (około 1 ml), nawet jeśli nie wszystko jest całkowicie zawieszone. Dodać 4 ml acetonu do roztworu i delikatnie strzepnąć szklankę, aby całkowicie rozpuścić pigmenty.
9. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie załadować próbkę na kolumnę sefarozy DEAE zrównoważoną w 100% acetonie.
10. Elute karotenoidy (pomarańczowo-żółte pasmo) 100% acetonem. Następnie eluować Chl a (zielony pasek) mieszaniną acetonu i metanolu 3:1 v/v.
    Uwaga: Objętość acetonu i mieszaniny acetonu/metanolu jest w przybliżeniu równoważna objętości sefarozy DEAE załadowanej na kolumnę.
11. Sprawdzić czystość Chl a za pomocą chromatografii cienkowarstwowej przy użyciu mieszaniny 68:25:5:2 dichlorometan/n-heksan/izopropanol/metanol (v/v) jako eluent ¹⁷.
12. Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aż Chl a całkowicie wyschnie (10-60 min).
    Uwaga: Suchy Chl a można przedmuchnąć azotem lub argonem i przechowywać w atmosferze argonu w temperaturze -20 °C w ciemności.
13. Przygotować Chl roztwór podstawowy, ponownie rozpuszczając suchy Chl a w 2-4 ml 100% etanolu.
    Uwaga: Współczynnik ekstynkcji Chl a przy 663 nm wynosi 74 400 ^{cm-1 M-1} (83,3 ^cm-1 (mg/ml)^-1) w etanolu. Typowy roztwór podstawowy powinien mieć OD 1,860, co odpowiada stężeniu 25 mM (23 mg/ml). Dodanie 20 μl tego bulionu do emulsji zawierającej 5 ml fazy organicznej i 1 mg WSCP w 1 ml fazy wodnej daje mieszaninę z 10-krotnym nadmiarem molowym Chl a w porównaniu z WSCP.

2. Przygotowanie fazy organicznej emulsji

Uwaga: Faza organiczna emulsji składa się z oleju mineralnego zawierającego 4,5% (v/v) Span 80 i 0,4% (v/v) Tween 80.

1. Odważ w probówce o pojemności 50 ml 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 i 38 g oleju mineralnego. Dobrze wymieszaj wszystkie składniki i ostudź na lodzie.
   Uwaga: Faza organiczna może być przechowywana w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.

3. Przygotowanie fazy wodnej emulsji

Uwaga: Faza wodna emulsji może składać się albo z oczyszczonego WSCP, albo z surowego ekstraktu bakterii z nadekspresją WSCP.

1. Przygotowanie fazy wodnej zawierającej oczyszczony WSCP.
   1. Hodować bakterie E.coli BL21 zawierające plazmid WSCP ¹² w 1 l pożywki LB w temperaturze 37 °C do OD 0,3-0,6.
   2. Indukuj ekspresję białka przez dodanie 1 mM IPTG. Po indukcji rozmnażaj bakterie w temperaturze 30 °C przez 12-16 godzin.
   3. Zbierać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Rozpuść osad w buforze wiążącym i poddaj sonikacji na lodzie (30 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia, pięć razy). Użyć 10 ml buforu do osadu otrzymanego z odwirowania 250 ml pożywki LB z komórkami z nadekspresją białka.
      Uwaga: W zależności od metody oczyszczania, bufor wiążący może składać się ze 100 mM buforu fosforanowego o pH 7,2 lub 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.
   5. Odwirowywać lizat komórkowy w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Oczyść WSCP metodą chromatografii powinowactwa. W zależności od znacznika połączonego z WSCP, należy oczyścić rekombinowane białka przy użyciu odpowiedniego dostępnego na rynku systemu chromatografii powinowactwa do oczyszczania białek zgodnie z instrukcjami producenta.
   7. Do przygotowania emulsji należy użyć oczyszczonego WSCP w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,8. Upewnić się, że końcowa ilość białka użytego do rozpuszczenia wynosi 0,5-1,0 mg na 1 ml buforu.
2. Przygotowanie fazy wodnej zawierającej surowy lizat bakteryjny za pomocą WSCP.
   1. Hodować komórki E.coli BL21 zawierające WSCP wykazujące ekspresję plazmidu w 250 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C do OD 0,3-0,6.
   2. Indukuj ekspresję białka za pomocą 1 mM IPTG i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 30 °C.
   3. Komórki bakteryjne zbierać przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Rozpuścić osad w 1-2 ml 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,8, dokonać sonikacji (30 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia, trzy razy) i odwirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Przygotować fazę wodną emulsji, mieszając 0,125 ml supernatantu z 0,875 ml 50 mM buforu fosforanowego o pH 7.8.

4. Montaż WSCP z Chl a w emulsji

1. Przenieść 5 ml mieszaniny oleju i środka powierzchniowo czynnego do szklanej fiolki i ostudzić na lodzie. Przed pipetowaniem należy sprawdzić, czy wszystkie składniki fazy organicznej są dokładnie wymieszane i czy nie ma separacji faz między środkami powierzchniowo czynnymi a olejem mineralnym.
2. Dodać 1 ml lodowatej fazy wodnej przygotowanej zgodnie z sekcją 3 do 5 ml fazy organicznej.
3. Mieszać obie fazy za pomocą homogenizatora tkankowego przez 2 minuty przy 9 500 obr./min na lodzie.
4. KROK KRYTYCZNY: Od tego etapu wykonuj wszystkie dalsze kroki w zielonym świetle (520 nm), aby zminimalizować fotouszkodzenia. Dodać 20 μl z 25 mM Chl roztworu podstawowego (patrz sekcja 1.13) do emulsji. Rozproszyć przez strzepnięcie i odwrócenie szklanej fiolki. Upewnij się, że Chl jest równomiernie rozprowadzony w emulsji.
5. Inkubuj emulsję przez 1-2 godziny na lodzie w ciemności.
6. W celu rozbicia emulsji i oddzielenia kropelek wody od fazy organicznej, należy przenieść emulsję do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Jeśli montaż się powiedzie, dolna faza wodna powinna mieć zielony kolor.
7. Wylej górną fazę olejową i dodaj 1 ml oleju mineralnego. Dobrze wymieszaj olej mineralny z granulowaną emulsją przez wir lub dokładnie obracając rurkę. Odwirowywać próbkę o wymiarach 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtarzać ten krok, aż do uzyskania przezroczystego menisku oddzielającego fazę wodną i olejową bez żadnej emulsji pośredniej.
8. Wykonaj ten krok w okapie chemicznym. Po wyraźnym oddzieleniu fazy wodnej i oleju mineralnego usunąć olej mineralny i dodać 1 ml nasyconego wodą eteru dietylowego. Wirować i wirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwukrotnie.
9. Po drugim odwirowaniu usuń eter dietylowy i pozostaw otwarte probówki na 5-20 minut w okapie.
10. Na koniec załadować fazę wodną zawierającą kompleks WSCP/Chl do kolumny odsalającej i wymyć buforem odpowiednim do dalszych eksperymentów.
    Uwaga: Białko jest stabilne w fosforanowych i Tris w szerokim zakresie pH (6,0-7,5). Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C, chroniona przed światłem przez okres do jednego miesiąca.

Rekombinowane apoproteiny WSCP zostały połączone z Chl a w emulsjach W/O zgodnie z protokołem opisanym w poprzedniej sekcji. Protokół został wdrożony przy użyciu faz wodnych zawierających albo czyste WSCP, albo lizaty komórek E. coli z nadekspresją WSCP (ryc. 1). Protokół jest prosty, szybki i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu poza homogenizatorem tkankowym.

Absorbancja i widma CD kompleksów Chl a czterech rekombinowanych wariantów WSCP, a mianowicie RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP i LvWSCP są pokazane na rysunku 2. Są one podobne pod względem kształtu pasma i położenia do wcześniej opisywanych widm odpowiednich natywnych kompleksów 10,18,19. Wyniki te jednoznacznie wskazują, że kompleksy WSCP/Chl odtworzone w układzie emulsyjnym W/O przypominają kompleksy natywne.

Aby zademonstrować potencjał emulsji W/O jako systemu szybkiego przesiewania do pozytywnego łączenia WSCP z Chls, jako fazę wodną emulsji użyto surowych lizatów komórek E.coli wyrażających WSCPs. Jako kontrolę ujemną zastosowano lizaty bakterii, które nie wykazywały ekspresji WSCP. Dodatnie złożenie WSCP z Chl a jest łatwo obserwowane przez zielony kolor fazy wodnej, ale tylko w lizatach komórek eksprymujących WSCP (ryc. 3). Kropelki zawierające te lizaty wykazują wyraźną fluorescencję Chl a na obrazach mikroskopu konfokalnego. Oznacza to, że pomyślne składanie kompleksów WSCP/Chl można wykryć bezpośrednio w kropelkach wody, co może stanowić podstawę dla systemów przesiewowych opartych na emulsji W/O.

Rysunek 1: Montaż WSCP z Chls w emulsjach W/O. (A) W protokole przygotowawczym fazę organiczną miesza się z fazą wodną, która zawiera oczyszczone lizaty komórek WSCP lub E. coli wykazujące ekspresję WSCP. Gdy emulsja jest gotowa, do emulsji dodaje się Chls. Po rozpuszczeniu kropelki wody są oddzielane od fazy organicznej przez odwirowanie. (B) System emulsji W/O może być stosowany do szybkich i wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu pozytywnej rekonstytucji WSCP z Chls. Fluorescencję kompleksu WSCP/Chl można wykryć bezpośrednio z mikrokropelek wody za pomocą mikroskopu konfokalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Absorbancja i widma CD kompleksów WSCP/CHL A. Apoproteiny czterech wariantów WSCP odtworzono z 10-krotnym nadmiarem molowym Chl a. Widma absorbancji (a) znormalizowano do 1 przy 673 nm dla BoWSCP (), CaWSCP (zielony) i RshWSCP (niebieski) oraz 663 nm dla LvWSCP (czerwony). Te same współczynniki normalizacyjne zastosowano do CD (b). Przedruk za zgodą 16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Skaningowa mikroskopia fluorescencyjna i wizualne badania przesiewowe zespołu kompleksu WSCP/CHL. (A) SDS-PAGE lizatów komórkowych E. coli BL21 przed i po rozpuszczeniu z Chl a w emulsjach W/O. Tor 1: komórki BL21 bez plazmidu WSCP, tor 2: komórki BL21 z plazmidem WSCP bez indukcji przez IPTG, tor 3: komórki BL21 z plazmidem WSCP indukowanym IPTG. Tory 4, 5 i 6 są tymi samymi próbkami, co odpowiednio pasy 1, 2 i 3, ale po oddzieleniu fazy wodnej od fazy organicznej emulsji. Małe porcje każdej próbki badano na żelu białkowym SDS. Pas M: znacznik wielkości białka. Zdjęcia próbek przed i po separacji faz są pokazane na górze każdego toru. (B) Obrazy mikroskopu konfokalnego kropelek W/O przygotowanych z Chl a w fazie olejowej. Kropelki na zdjęciu po lewej stronie nie zawierały żadnego białka, podczas gdy te na obrazie po prawej stronie zawierały białko WSCP. Fluorescencję monitorowano przy długości fali 682 nm. Przedruk za zgodą 16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.