Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje prostą i wysokoprzepustową metodę łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek z hydrofobowymi pigmentami, która opiera się na emulsjach typu woda w oleju. Wykazano skuteczność metody w łączeniu natywnych chlorofili z czterema wariantami rekombinowanych rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil (WSCP) roślin kapustnych ulegających ekspresji w E. coli.

Streszczenie

Chlorofile (Chls) i bakteriochlorofile (BChls) są głównymi kofaktorami, które przeprowadzają fotosyntetyczne zbieranie światła i transport elektronów. Ich funkcjonalność zależy krytycznie od ich specyficznej organizacji w dużych i skomplikowanych wielopodjednostkowych kompleksach białek transbłonowych. Aby zrozumieć na poziomie molekularnym, w jaki sposób kompleksy te ułatwiają konwersję energii słonecznej, konieczne jest zrozumienie interakcji białko-pigment i pigment-pigment oraz ich wpływu na dynamikę wzbudzoną. Jednym ze sposobów uzyskania takiego zrozumienia jest konstruowanie i badanie kompleksów Chls z prostymi, rozpuszczalnymi w wodzie rekombinowanymi białkami. Jednak włączenie lipofilowych Chls i BChl do białek rozpuszczalnych w wodzie jest trudne. Co więcej, nie istnieje ogólna metoda, którą można by zastosować do łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek z pigmentami hydrofobowymi. Demonstrujemy tutaj prosty i wysokoprzepustowy system oparty na emulsjach typu woda w oleju, który umożliwia łączenie rozpuszczalnych w wodzie białek z hydrofobowymi Chls. Nowa metoda została zwalidowana poprzez połączenie rekombinowanych wersji rozpuszczalnego w wodzie białka wiążącego chlorofil roślin Brassicaceae (WSCP) z Chl a. Pokazujemy udane składanie Chl a przy użyciu surowych lizatów WSCP eksprymujących komórkę E. coli, które mogą być wykorzystane do opracowania genetycznego systemu przesiewowego dla nowych rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących Chl oraz do badań interakcji i procesów składania Chl-białko.

Wprowadzenie

Hydrofobowe pigmenty, takie jak chlorofile (Chls), bakteriochlorofile (BChls) i karotenoidy, są głównymi kofaktorami w centrach reakcji fotosyntezy i białkach zbierających światło, które przeprowadzają transport elektronów oraz wychwytywanie i transfer energii świetlnej. Centra reakcji i większość kompleksów zbierających światło wiążące Chl to białka transbłonowe. Białko Fenna-Matthews-Olson (FMO) nietlenowych fotosyntetycznych bakterii zielonosiarkowych ^1,2 oraz białko perydyniny-Chl (PCP) bruzdnic3 ^są wyjątkowymi przykładami rozpuszczalnych w wodzie białek zbierających światło. Rozpuszczalne w wodzie białka wiążące chlorofil (WSCP) roślin Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae i Amaranthaceae ^4,5 są kolejnym unikalnym przykładem, jednak w przeciwieństwie do FMO i PCP, nie biorą one udziału w zbieraniu światła ani w żadnej z pierwotnych reakcji fotosyntezy, a ich dokładne funkcje fizjologiczne są jeszcze niejasne ^5-8. Ich wysokie powinowactwo do wiązania Chl doprowadziło do sugerowania funkcji jako przejściowych nośników Chls i pochodnych Chl ^9,10. Alternatywnie postawiono hipotezę, że WSCP odgrywa rolę w wymiataniu Chls w uszkodzonych komórkach i chroni przed uszkodzeniem fotooksydacyjnym wywołanym przez Chl ^7,11-13. Niedawno zasugerowano, że WSCP działa jako inhibitor proteazy i odgrywa rolę podczas odporności roślinożerców, a także reguluje śmierć komórek podczas rozwoju kwiatów ¹⁴. WSCP dzielą się na dwie główne klasy w zależności od ich właściwości fotofizycznych. Pierwsza klasa (klasa I, np. z albumu Chenopodium) może ulegać fotokonwersji po oświetleniu. WSCP klasy II z roślin kapustnych, które nie są poddawane fotokonwersji ^5,10, są dalej dzielone na klasę IIa (np. z Brassica oleracea, Raphanus sativus) i IIb (np. z Lepidium virginicum). Strukturę WSCP klasy IIb z Lepidium virginicum rozwiązano metodą krystalografii rentgenowskiej z rozdzielczością 2,0 A ⁸. Ujawnia symetryczny homotetramer, w którym podjednostki białkowe tworzą hydrofobowy rdzeń. Każda podjednostka wiąże pojedynczy Chl, co powoduje ścisły układ czterech ciasno upakowanych Chl w rdzeniu. Ten prosty układ wszystkich Chl sprawia, że WSCP są potencjalnie użytecznym systemem modelowym do badania wiązania i składania kompleksów Chl-białko oraz wpływu sąsiednich Chls i środowisk białkowych na właściwości spektralne i elektroniczne poszczególnych Chl. Co więcej, może dostarczyć szablonów do konstruowania sztucznych białek wiążących Chl, które mogą być wykorzystane w modułach zbierających światło w sztucznych urządzeniach do fotosyntezy.

Rygorystyczne badania rodzimych WSCP nie są wykonalne, ponieważ kompleksy oczyszczone z roślin zawsze zawierają niejednorodną mieszaninę tetramerów z różnymi kombinacjami Chl a i Chl b ⁹. W związku z tym wymagana jest metoda łączenia rekombinowanych ekspresji WSCP z Chls in vitro. Jest to wyzwaniem ze względu na znikomą rozpuszczalność Chls w wodzie, co uniemożliwia złożenie kompleksu in vitro poprzez proste zmieszanie rozpuszczalnych w wodzie apoprotein z pigmentami w roztworach wodnych. Wykazano składanie in vitro przez zmieszanie apoprotein z błonami tylakoidów ¹⁵, ale metoda ta jest ograniczona do natywnych Chls obecnych w tylakoidach. Schmidt i wsp. doniesiono o połączeniu kilku pochodnych Chl i BChl z WSCP z kalafiora (CaWSCP) poprzez rekombinacyjną ekspresję białka znakowanego histydyną w E. coli, unieruchamiając je na kolumnie powinowactwa do Ni i wprowadzając pochodne Chl rozpuszczone w detergentach ¹¹. Zgłoszono również pomyślne odtworzenie rekombinowanych WSCP z A. thaliana ⁶ oraz brukselki (BoWSCP), dzikiej rzodkwi japońskiej (RshWSCP) i pieprzu wirginijskiego (LvWSCP) za pomocą podobnej metody.

Tutaj prezentujemy nowatorską, ogólną, prostą metodę łączenia Chls z WSCP, która nie wymaga znakowania ani immobilizacji białek. Polega ona na przygotowaniu emulsji z ich wodnych roztworów rozpuszczalnych w wodzie apoprotein w oleju mineralnym. Białka są zatem zamknięte w mikrokropelkach typu woda w oleju (W/O) o bardzo wysokim stosunku powierzchni do objętości ¹⁶. Kofaktory hydrofobowe są następnie rozpuszczane w oleju i są łatwo wprowadzane do kropelek z fazy olejowej. Opisano zastosowanie metody składania kilku wariantów apoprotein WSCP rekombinowanych wyrażanych w E. coli z Chl a. Pokazujemy składanie z surowego lizatu bakterii z nadekspresją WSCP, które mogą być wykorzystane jako system przesiewowy do opracowania nowych białek wiążących Chl.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów magazynowych

1. ETAP KRYTYCZNY: Wykonaj wszystkie etapy przygotowania chlorofilu w kapturze chemicznym, w zielonym świetle (520 nm) lub w ciemności, aby zminimalizować fotouszkodzenia. Zawsze dodawaj azot lub argon przed zamrożeniem pigmentów do przechowywania. Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki są klasy analitycznej.
2. Zważyć około 5 mg liofilizowanych komórek Spirulina platensis lub innych komórek cyjanobakterii zawierających tylko Chl a w błonach tylakoidów i rozdrobnić za pomocą moździerza i tłuczka.
3. Rozdrobnione komórki załadować na szklaną kolumnę i przemyć około 50-100 ml 100% acetonu w celu usunięcia karotenoidów. Wyrzuć eluowaną frakcję pomarańczowo-zieloną.
   Uwaga: Jeśli frakcja pomarańczowa nie zostanie wymyta 100 ml acetonu, kontynuuj mycie komórek acetonem, aż zielona frakcja zacznie się wymywać.
4. Zamień aceton na 100% metanol i zbierz zieloną frakcję zawierającą Chl a. Objętość eluowanej frakcji może wahać się w granicach 50-100 ml. Na początku eluowana frakcja ma ciemnozielony kolor, który pod koniec elucji zmienia się w bladozielony. Gdy kolor eluowanej frakcji zmieni się w bladozielony, zatrzymaj elucję.
5. Odparować metanol za pomocą wyparki obrotowej, aż ekstrakt całkowicie wyschnie. Nie podgrzewaj roztworu; upewnić się, że temperatura łaźni wodnej parownika nie przekracza 30 °C.
   Uwaga: Czas parowania zależy od objętości odparowywanej frakcji metanolu i może wynosić od 10 do 60 minut. Ważne jest, aby całkowicie wysuszyć ekstrakt.
6. Rozpuść pigmenty z wysuszonego ekstraktu w niewielkiej objętości eteru dietylowego (około 5-10 ml) i przefiltruj przez watę. Upewnij się, że pigmenty są całkowicie rozpuszczone w eterze przed filtrowaniem.
7. Odparować eter dietylowy aż do całkowitego wyschnięcia pigmentów (10-30 min).
   Uwaga: Suche pigmenty można oczyścić i przechowywać w azocie lub argonie w temperaturze -20 °C, w ciemności do czasu dalszej obróbki.
8. Suche pigmenty należy rozpuścić w jak najmniejszej objętości 100% metanolu (około 1 ml), nawet jeśli nie wszystko jest całkowicie zawieszone. Dodać 4 ml acetonu do roztworu i delikatnie strzepnąć szklankę, aby całkowicie rozpuścić pigmenty.
9. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie załadować próbkę na kolumnę sefarozy DEAE zrównoważoną w 100% acetonie.
10. Elute karotenoidy (pomarańczowo-żółte pasmo) 100% acetonem. Następnie eluować Chl a (zielony pasek) mieszaniną acetonu i metanolu 3:1 v/v.
    Uwaga: Objętość acetonu i mieszaniny acetonu/metanolu jest w przybliżeniu równoważna objętości sefarozy DEAE załadowanej na kolumnę.
11. Sprawdzić czystość Chl a za pomocą chromatografii cienkowarstwowej przy użyciu mieszaniny 68:25:5:2 dichlorometan/n-heksan/izopropanol/metanol (v/v) jako eluent ¹⁷.
12. Odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aż Chl a całkowicie wyschnie (10-60 min).
    Uwaga: Suchy Chl a można przedmuchnąć azotem lub argonem i przechowywać w atmosferze argonu w temperaturze -20 °C w ciemności.
13. Przygotować Chl roztwór podstawowy, ponownie rozpuszczając suchy Chl a w 2-4 ml 100% etanolu.
    Uwaga: Współczynnik ekstynkcji Chl a przy 663 nm wynosi 74 400 ^{cm-1 M-1} (83,3 ^cm-1 (mg/ml)^-1) w etanolu. Typowy roztwór podstawowy powinien mieć OD 1,860, co odpowiada stężeniu 25 mM (23 mg/ml). Dodanie 20 μl tego bulionu do emulsji zawierającej 5 ml fazy organicznej i 1 mg WSCP w 1 ml fazy wodnej daje mieszaninę z 10-krotnym nadmiarem molowym Chl a w porównaniu z WSCP.

2. Przygotowanie fazy organicznej emulsji

Uwaga: Faza organiczna emulsji składa się z oleju mineralnego zawierającego 4,5% (v/v) Span 80 i 0,4% (v/v) Tween 80.

1. Odważ w probówce o pojemności 50 ml 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 i 38 g oleju mineralnego. Dobrze wymieszaj wszystkie składniki i ostudź na lodzie.
   Uwaga: Faza organiczna może być przechowywana w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.

3. Przygotowanie fazy wodnej emulsji

Uwaga: Faza wodna emulsji może składać się albo z oczyszczonego WSCP, albo z surowego ekstraktu bakterii z nadekspresją WSCP.

1. Przygotowanie fazy wodnej zawierającej oczyszczony WSCP.
   1. Hodować bakterie E.coli BL21 zawierające plazmid WSCP ¹² w 1 l pożywki LB w temperaturze 37 °C do OD 0,3-0,6.
   2. Indukuj ekspresję białka przez dodanie 1 mM IPTG. Po indukcji rozmnażaj bakterie w temperaturze 30 °C przez 12-16 godzin.
   3. Zbierać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Rozpuść osad w buforze wiążącym i poddaj sonikacji na lodzie (30 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia, pięć razy). Użyć 10 ml buforu do osadu otrzymanego z odwirowania 250 ml pożywki LB z komórkami z nadekspresją białka.
      Uwaga: W zależności od metody oczyszczania, bufor wiążący może składać się ze 100 mM buforu fosforanowego o pH 7,2 lub 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.
   5. Odwirowywać lizat komórkowy w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Oczyść WSCP metodą chromatografii powinowactwa. W zależności od znacznika połączonego z WSCP, należy oczyścić rekombinowane białka przy użyciu odpowiedniego dostępnego na rynku systemu chromatografii powinowactwa do oczyszczania białek zgodnie z instrukcjami producenta.
   7. Do przygotowania emulsji należy użyć oczyszczonego WSCP w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,8. Upewnić się, że końcowa ilość białka użytego do rozpuszczenia wynosi 0,5-1,0 mg na 1 ml buforu.
2. Przygotowanie fazy wodnej zawierającej surowy lizat bakteryjny za pomocą WSCP.
   1. Hodować komórki E.coli BL21 zawierające WSCP wykazujące ekspresję plazmidu w 250 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C do OD 0,3-0,6.
   2. Indukuj ekspresję białka za pomocą 1 mM IPTG i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 30 °C.
   3. Komórki bakteryjne zbierać przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Rozpuścić osad w 1-2 ml 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,8, dokonać sonikacji (30 sekund włączenia, 15 sekund wyłączenia, trzy razy) i odwirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Przygotować fazę wodną emulsji, mieszając 0,125 ml supernatantu z 0,875 ml 50 mM buforu fosforanowego o pH 7.8.

4. Montaż WSCP z Chl a w emulsji

1. Przenieść 5 ml mieszaniny oleju i środka powierzchniowo czynnego do szklanej fiolki i ostudzić na lodzie. Przed pipetowaniem należy sprawdzić, czy wszystkie składniki fazy organicznej są dokładnie wymieszane i czy nie ma separacji faz między środkami powierzchniowo czynnymi a olejem mineralnym.
2. Dodać 1 ml lodowatej fazy wodnej przygotowanej zgodnie z sekcją 3 do 5 ml fazy organicznej.
3. Mieszać obie fazy za pomocą homogenizatora tkankowego przez 2 minuty przy 9 500 obr./min na lodzie.
4. KROK KRYTYCZNY: Od tego etapu wykonuj wszystkie dalsze kroki w zielonym świetle (520 nm), aby zminimalizować fotouszkodzenia. Dodać 20 μl z 25 mM Chl roztworu podstawowego (patrz sekcja 1.13) do emulsji. Rozproszyć przez strzepnięcie i odwrócenie szklanej fiolki. Upewnij się, że Chl jest równomiernie rozprowadzony w emulsji.
5. Inkubuj emulsję przez 1-2 godziny na lodzie w ciemności.
6. W celu rozbicia emulsji i oddzielenia kropelek wody od fazy organicznej, należy przenieść emulsję do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Jeśli montaż się powiedzie, dolna faza wodna powinna mieć zielony kolor.
7. Wylej górną fazę olejową i dodaj 1 ml oleju mineralnego. Dobrze wymieszaj olej mineralny z granulowaną emulsją przez wir lub dokładnie obracając rurkę. Odwirowywać próbkę o wymiarach 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtarzać ten krok, aż do uzyskania przezroczystego menisku oddzielającego fazę wodną i olejową bez żadnej emulsji pośredniej.
8. Wykonaj ten krok w okapie chemicznym. Po wyraźnym oddzieleniu fazy wodnej i oleju mineralnego usunąć olej mineralny i dodać 1 ml nasyconego wodą eteru dietylowego. Wirować i wirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwukrotnie.
9. Po drugim odwirowaniu usuń eter dietylowy i pozostaw otwarte probówki na 5-20 minut w okapie.
10. Na koniec załadować fazę wodną zawierającą kompleks WSCP/Chl do kolumny odsalającej i wymyć buforem odpowiednim do dalszych eksperymentów.
    Uwaga: Białko jest stabilne w fosforanowych i Tris w szerokim zakresie pH (6,0-7,5). Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C, chroniona przed światłem przez okres do jednego miesiąca.

Wyniki

Rekombinowane apobiałka WSCP zostały zmontowane z Chl a w emulsjach W/O zgodnie z protokołem opisanym w poprzedniej sekcji. Protokół wdrożono przy użyciu faz wodnych zawierających albo czyste WSCPs, albo lizaty komórek E.coli nadekspresujących WSCP (Rycina 1). Protokół jest prosty, szybki i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu poza homogenizatorem tkankowym.

Widma absorbancji i CD kompl...

Dyskusja

Naszym celem było opracowanie nowego ogólnego systemu łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi. Pokazano tutaj, że nowy system rekonstytucji oparty na emulsji W/O jest ogólnym podejściem, które sprawdziło się w przypadku składania apoprotein WSCP z brukselki, kalafiora, chrzanu japońskiego i pieprzu Virginia rekombinowanych w E. coli. Przedstawiono wyniki po rozpuszczeniu 1 mg WSCP z 10-krotnym nadmiarem molowym Chl a. Możliwe jest jednak również stosowanie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Olej mineralny	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Chromatografia powinowactwa do oczyszczania WSCP z natywną sekwencją.
Jego kolumna Pułapka HF	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Chromatografia powinowactwa do oczyszczania WSCP z His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Pożywka chromatograficzna do oczyszczania chlorofilu