Artykuł metodologiczny

Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

DOI:

10.3791/53414

⸱

3 grudnia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, College of the Holy Cross

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do migracji jest kluczową funkcją wielu różnych typów komórek, w tym mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC). Ilościowe określenie zmian w zdolności migracyjnej po wystąpieniu szkód jest jednak trudne. Protokół ten opisuje łatwy do adaptacji test migracji, który wykorzystuje rygorystyczne statystyki do ilościowego określenia zmian w zdolności migracyjnej MSC po uszkodzeniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek jest niezbędna dla wielu procesów fizjologicznych i patologicznych, w tym rozwoju, naprawy i regeneracji tkanek, przerzutów nowotworowych i reakcji zapalnych. Biorąc pod uwagę obecne zainteresowanie rolą mezenchymalnych komórek zrębu w pośredniczeniu w naprawie tkanek, jesteśmy zainteresowani ilościowym określeniem zdolności migracyjnej tych komórek i zrozumieniem, w jaki sposób zdolność migracyjna może zostać zmieniona po uszkodzeniu. Optymalizacja rygorystycznie ilościowego testu migracji, który jest zarówno łatwy do dostosowania, jak i opłacalny w wykonaniu, jest kluczem do odpowiedzi na pytania dotyczące zmian w migracji komórek w odpowiedzi na różne bodźce. Obecne metody ilościowego określania migracji komórek, w tym testy scratch, testy migracji trans-well (komory Boydena), macierze mikrofilarowe i testy stref wykluczenia komórek, mają szereg ograniczeń w odtwarzalności, możliwości dostosowywania, kwantyfikacji i opłacalności. Pomimo swojego znaczącego zastosowania, test zarysowania jest zagmatwany przez problemy z odtwarzalnością związane z uszkodzeniem mikrośrodowiska komórki, przeszkodami w migracji komórek, wpływem sąsiednich komórek starczych i proliferacją komórek, a także brakiem rygorystycznej kwantyfikacji. Opisany tutaj zoptymalizowany test zarysowań wykazuje solidne wyniki, wymierne i oparte na obrazie możliwości analizy, opłacalność i możliwość dostosowania do innych zastosowań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek jest wysoce skoordynowana i niezbędna dla wielu procesów fizjologicznych, takich jak rozwój, naprawa i regeneracja tkanek, a także procesów patologicznych, takich jak przerzuty raka i miażdżyca 1. Zrozumienie migracji komórek jest szczególnie istotne dla pojawiających się terapii stosowanych do naprawy uszkodzonych tkanek i leczenia stanów patologicznych, w tym technologii przeszczepiania komórek i przeszczepiania sztucznych tkanek 2. Biorąc pod uwagę obecne zainteresowanie rolą mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) w pośredniczeniu w naprawie tkanek 3, interesujące jest ilościowe określenie zdolności migracyjnej tych komórek za pomocą testu, który jest rygorystycznie kwantyfikowalny, elastyczny i opłacalny. Co ważne, taki test musi być wystarczająco czuły, aby wykryć stosunkowo subtelne zmiany w zdolności migracji komórek po uszkodzeniu. Obecne metody ilościowego określania migracji komórek, w tym testy scratch, testy migracji trans-well (komory Boydena), macierze mikrofilarowe i testy stref wykluczenia komórek, mają szereg ograniczeń w odtwarzalności, możliwości dostosowywania, kwantyfikacji i opłacalności 1,4,5. Opisany tutaj zoptymalizowany test zarysowań wykazuje solidne wyniki, wymierne i oparte na obrazie możliwości analizy, opłacalność i możliwość dostosowania do innych zastosowań.

Testy scratch były używane w wielu możliwościach do oceny migracji i proliferacji komórek w różnych warunkach eksperymentalnych 5. Test polega na wysiewie wyznaczonych komórek, wyhodowaniu ich do całkowitego lub bliskiego zbiegania się i zadrapaniu powstałej monowarstwy sterylną igłą lub końcówką pipety 6. Analizę najczęściej przeprowadza się poprzez porównanie szerokości rysy w wielu punktach czasowych w losowo wybranych miejscach 7-9. Pomimo swojego znaczącego zastosowania, test zarysowania jest zagmatwany przez problemy z odtwarzalnością i kwantyfikacją. Zmienność w generowaniu rysy nie tylko zmienia mikrośrodowisko komórek, ale może również utrudniać migrację komórek poprzez uszkodzenie powierzchni płytki i leżącej pod nią macierzy zewnątrzkomórkowej 5. Testy są często przeprowadzane w ciągu 7 do 12 godzin, jednak w przypadku linii komórkowych wykazujących wolniejszą migrację i dłuższy czas testu, proliferacja staje się zmienną zakłócającą 7,10. Wreszcie, komórki starcze generowane w procesie drapania mogą uwalniać czynniki, które zakłócają sygnalizację zewnątrzkomórkową wymaganą do zamknięcia luki w monowarstwie 1. Optymalizacja testu zarysowania wymaga stworzenia spójnej szczeliny, która nie ingeruje we właściwości powierzchni, minimalizując czas trwania testu i zapobiegając niepożądanej śmierci komórki podczas manipulacji. Test oparty na zatyczce jest optymalizacją testu strefy wykluczenia komórek. Test ten wykorzystuje korek umieszczony w środku studzienki, który wyklucza wzrost komórek, ale umożliwia posiew komórek wokół centralnej strefy wykluczenia. Aby ocenić migrację, korek jest usuwany, a wynikowa strefa wykluczenia stanowi powierzchnię do przeprowadzenia migracji. Jednak test ten jest trudny do dostosowania lub dostosowania 10, a w przypadku niektórych zastosowań technika ta może być również zbyt kosztowna.

W przeciwieństwie do testów scratch i ich pochodnych, testy migracji trans-well (lub testy komory Boydena) oceniają migrację poprzez ilościowe określenie liczby komórek, które przemieszczają się z jednej komory, przez mikroporowatą membranę filtracyjną, do komory zawierającej czynniki chemotaktyczne 8,11,12. Technika ta ma ograniczoną użyteczność w przypadku komórek przylegających, takich jak MSC, ponieważ po migracji przez porowatą błonę komórki przylegają do strony błony wystawionej na działanie czynników chemotaktycznych i mogą być trudne do dokładnego określenia ilościowego. Chociaż test jest w stanie zbadać niektóre trójwymiarowe wzorce migracji, ograniczone typy komórek, dla których jest w stanie dokładnie określić ilościowo migrację komórek, ograniczają jego użyteczność 10. Inną alternatywą dla testów zarysowania jest matryca mikrofilarowa, która mierzy ruchliwość komórek w przestrzeni trójwymiarowej, wykorzystując zdolność komórek do deformacji i migracji do macierzy jako substytutu. Elastomery polidimetyliloksanu (PDMS) utwardzone na precyzyjnej formie i poddane działaniu ozonu i fibronektyny wytwarzają jednorodne i nieulegające degradacji mikrośrodowisko. Odstępy między mikrofilarami można również zmieniać w zależności od potrzeb, aby ocenić zdolność komórek do wejścia do tablicy 4. Forma jest tworzona przez głębokie reaktywne trawienie jonowe płytek krzemowych w celu stworzenia ujemnej wersji tablicy 13 o wysokim współczynniku proporcji. Chociaż test jest wzmocniony przez możliwość dostosowania, możliwość modelowania trójwymiarowej migracji i analizę poprzez bezpośrednią wizualizację migrujących komórek, trudności w tworzeniu macierzy mikrofilarów ekonomicznie utrudniają jego powszechne stosowanie.

Zoptymalizowany test zadrapań opisany w tym protokole zapewnia efektywną i opłacalną metodę tworzenia spójnych rys, które mogą być analizowane za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania. Zamiast prostych pomiarów szerokości wykonywanych w poprzek rysy przed i po migracji komórek, oprogramowanie umożliwia użytkownikowi określenie całkowitych obszarów zarysowania przed i po migracji. Ten postęp ogranicza kwestię prób określenia, gdzie należy wykonać pomiary szerokości zadrapania i czy szerokość zadrapania jest jednolita na całej jego długości. Ponadto omówiono staranną optymalizację liczby komórek, zbiegania się komórek oraz rodzaju i stopnia uszkodzeń zadanych komórkom w celu dalszej optymalizacji testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: W tym badaniu, mezenchymalne komórki zrębu płuc (LR-MSC) z dystalnej tkanki płucnej zostały wyizolowane albo na podstawie ich ekspresji markerów powierzchniowych komórek (CD45neg, CD31neg, Sca-1high, Epcamneg) 14,15, przy użyciu explant-out-growth 16, albo przy użyciu trawienia enzymatycznego 17. Przylegające LR-MSC hodowano w DMEM z wysoką glukozą i bez glutaminy, 15% FBS, 1x antybiotyku/antybiotyku i 2 mM glutaminy (odtąd kompletne pożywki) i inkubowano w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . LR-MSC pasażowano 3-4 razy, aby zapewnić populację komórek o stosunkowo jednorodnej charakterystyce wzrostu dla testu migracji.

1. Przygotowanie monowarstwy konfluentnej

  1. Aby odłączyć MSCs od standardowych naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm, umyj komórki 10 ml wstępnie ogrzanego PBS o temperaturze 37 °C, odessać PBS i dodać 4 ml trypsyny (0,25%). Inkubować przez 3-5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odessać komórki do stożkowej probówki, dodać równą objętość kompletnej pożywki i odwirować przy 300 g przez 5 minut, aby rozpruć komórki.
    Uwaga: Dłuższa inkubacja w trypsynie może zmienić receptory na powierzchni komórki i potencjalnie wpłynąć na migrację.
  2. Zasysanie pożywek i ponowne zawieszanie komórek w świeżych, kompletnych pożywkach. Policz komórki, z wyłączeniem martwych komórek, stosując wykluczenie błękitu trypanowego i umieść 500 000 mezenchymalnych komórek zrębu w 4 ml kompletnej pożywki na 60-milimetrowej naczyniu do hodowli komórek.
    Uwaga: W zależności od źródła komórek mogą być konieczne testy w celu określenia optymalnej liczby potrzebnych komórek.
  3. Inkubuj komórki, aż płytki zlewają się w 90%, aby uzyskać optymalne przyłączanie i proliferację komórek, zwykle 48-72 godziny w przypadku MSCs.
    Uwaga: 100% konfluencja nie jest zalecana, ponieważ wiele komórek zależnych od zakotwiczenia doświadcza zahamowania kontaktowego, co może zmienić ich zdolność migracyjną. Płyty z konfluencją mniejszą niż 80% spowodują, że zdjęcia staną się bezużyteczne, ponieważ oprogramowanie do analizy obrazu zinterpretuje przerwy między komórkami jako część obwodu rysy (patrz rysunek 1D).
  4. Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, uszkodzić komórki zgodnie z potrzebami aplikacji. Aby ocenić uszkodzenie komórek po ekspozycji na rozpuszczalny ekstrakt dymu papierosowego (CSE), wygeneruj 100% CSE, wciągając dym z 1 papierosa badawczego Uniwersytetu Kentucky (3R4F) przez 25 ml kompletnej pożywki w kolbie Büchnera przez 2 minuty 18.
  5. Inkubować komórki przez 24 godziny w 4 ml 1-4% CSE rozcieńczonych w kompletnych pożywkach. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 4 ml ciepłego sterylnego PBS, a następnie zastąpić 4 ml świeżej, kompletnej pożywki.
    Uwaga: Uszkodzenie komórek wysokim stężeniem ekstraktu z dymu papierosowego (>5%) może znacznie zmniejszyć konfluencję.

2. Tworzenie rysy

  1. W sterylnym środowisku zdejmij wieczko z 60-milimetrowej płytki uszkodzonych MSC i połóż prostą krawędź (na przykład wysterylizowaną plastikową linijkę) na górnej krawędzi płytki. Nie wyjmując podłoża, należy użyć sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl, prowadzonej przez sterylną krawędź prostą, aby wykonać od jednego do czterech równoległych rys na płytce w odległości około 5 mm od siebie i długości 50 mm.
    Uwaga: Prosta krawędź minimalizuje ilość regulacji obrotu płytki, gdy znajduje się ona na stoliku mikroskopu. Konieczne jest, aby rysy były całkowicie pionowe (lub poziome) na ekranie. Generowanie wielu rys na płytce o średnicy 60 mm nie zmienia mikrośrodowiska w sposób, który wpływa na migrację komórek (dane nie są pokazane), ale może być brane pod uwagę w przypadku innych typów komórek. Nie zaleca się stosowania mniejszych studzienek, ponieważ zmienność komórek rosnących blisko krawędzi studzienki staje się bardziej wyraźna i może wpływać na równomierne generowanie rys.
  2. Zassać podłoże i delikatnie umyć płytki 2 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża, aby zapobiec przywieraniu komórek do środka zadrapania i usunąć komórki, które zostały poluzowane przez drapanie. Zastąp 4 ml świeżej, kompletnej pożywki.
  3. Za pomocą sterylnego markera permanentnego oznacz każde zadrapanie od 1 do 4 na spodniej stronie płytki w miejscu, które nie będzie przeszkadzać w obrazowaniu zadrapań.
    Uwaga: Ważne jest, aby obrazy z tego samego szkicu były porównywane przed i po migracji, ponieważ mogą występować różnice w szerokości zadrapania.

3. Wykonywanie początkowych zdjęć rysy

Uwaga: Jeśli test zarysowania jest wykonywany na wielu płytach, zaleca się, aby początkowe obrazy wszystkich rys na jednej płycie zostały wykonane przed wykonaniem rys na następnej płycie.

  1. Użyj mikroskopu z kontrastem odwróconej fazy z kamerą, aby wygenerować obrazy potrzebne do analizy.
  2. Umieść płytkę hodowlaną na mikroskopie i użyj obiektywu o małej mocy (10X), aby zlokalizować rysę #1. Jeżeli kondensacja pary wodnej na pokrywie płytki hodowlanej utrudnia uzyskanie wyraźnego obrazu komórek, należy użyć podgrzewanego stolika ustawionego na 37 °C.
  3. Utrzymując rysę całkowicie poziomo i w środku pola widzenia, uzyskaj tyle obrazów, ile potrzeba, aby objąć 90% długości rysy. Uzyskaj obrazy wyraźnych części rysy bez nakładania się obrazów.
    Uwaga: Załamanie światła na krawędziach naczynia hodowlanego powoduje prześwietlenie obrazów, uniemożliwiając ich analizę. Dlatego nie rób zdjęć z pierwszych i ostatnich 5% długości rysy.
  4. Zapisz obrazy z każdej podstawki w osobnym folderze.
  5. Powtórz kroki 3.2-3.4 dla zadrapań 2, 3 i 4.
  6. Płytki należy umieścić z powrotem w inkubatorze natychmiast po wstępnym obrazowaniu. Pozwól komórkom migrować przez 4-7 godzin.
    Uwaga: 7 godzin jest optymalne przy ocenie MSC uszkodzonych za pomocą CSE. Nie zaleca się inkubacji komórek trwającej dłużej niż 7 godzin, ponieważ proliferacja komórek może działać jako zmienna zakłócająca migrację komórek (patrz uwaga opcjonalna 8.2 poniżej).

4. Analiza początkowych obrazów rys

  1. Pobierz ImageJ i zainstaluj wtyczkę Wound Healing Tool (patrz Tabela materiałów/sprzętu).
  2. Otwórz plik obrazu w ImageJ, a następnie kliknij "Proces" i "Znajdź krawędzie", aby podświetlić komórki otaczające rysę, aby narzędzie do gojenia ran obliczyło obszar zadrapania (Rysunek 2B). Następnie kliknij "Obraz", "Dostosuj", "Próg koloru" iw menu rozwijanym oznaczonym "Kolor progu" zmień wartość na "Czarno-biały".
  3. W menu "Próg koloru" dostosuj oba suwaki progu jasności, aż do uzyskania optymalnego kontrastu między rysą a frontem komórki. Aby zapewnić największy zakres podczas próby utworzenia kontrastu na obrazie, przesuń dolny suwak całkowicie w prawo (całkowicie obraz), a następnie dostosuj górny suwak, aby wygenerować maksymalny kontrast.
  4. Powoli przesuwaj górny suwak jasności od lewej do prawej, aż obraz będzie wyraźnie wyświetlał kontur rysy (Rysunek 2C). Po zidentyfikowaniu krawędzi rysy kliknij "Więcej narzędzi" na pasku narzędzi ImageJ, wybierz "MRI_Wound_Healing_Tool" z menu rozwijanego i naciśnij przycisk "m" (który pojawi się na pasku narzędzi ImageJ), aby podświetlić obszar rysowania i wyświetlić obliczony obszar w wyskakującym oknie wyników (Rysunek 2D).
  5. Skopiuj i wklej wszystkie liczby z okna wyników (Rysunek 2E) do arkusza kalkulacyjnego programu Excel. Upewnij się, że oddzieliłeś dane od poszczególnych zadrapań.

5. Wykonywanie końcowych zdjęć rysy

  1. Po migracji komórek (4-7 godzin) powtórz kroki 3.2-3.4. Wyobraź sobie płytki w tej samej kolejności, w jakiej zostały porysowane, tak aby komórki na każdej płytce miały równy czas na migrację.
    Uwaga: Komórki mogą być obrazowane w wielu punktach czasowych, w zależności od ich wrażliwości zarówno na zmiany temperatury, jak i pH. Alternatywnie, obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do śledzenia komórek w czasie rzeczywistym podczas ich migracji.

6. Analiza obrazów Final Scratch

  1. Powtórz kroki 4.2-4.5, aby uzyskać ostateczne obrazy zadrapań.

7. Obliczanie obszaru szkicowania w celu ilościowego określenia migracji

  1. Oblicz średnią powierzchnię przed migracją, uśredniając początkowe wartości powierzchni odpowiednich rys.
  2. Oblicz łączną kwotę migracji, odejmując końcowy obszar migracji dla każdego obrazu, obliczony w kroku 6, od średniego obszaru przed migracją (krok 7.1). Wygeneruj listę wartości dla każdego elementu bazowego reprezentującego zmianę migracji.
  3. Połącz dane z wielu zadrapań w tej samej grupie testowej (tj. wszystkie płytki i wszystkie rysy na komórkach narażonych na 0% CSE). Użyj testu analizy wariancji, aby przeanalizować różnice między grupami eksperymentalnymi.
  4. Jeśli komórki migrują wolno i wymagają dłuższego czasu inkubacji po drapaniu (powyżej 10-12 godzin), należy przeprowadzić test inkorporacji BrDU lub EdU 19 w celu ustalenia, czy komórki ulegają proliferacji w okresie, w którym odbywa się test migracji. Wybierz czas testu migracji, aby uniknąć znacznej proliferacji komórek.

8. Opcjonalnie

  1. Aby ocenić, czy w wyniku procedury drapania następuje znaczące starzenie się komórek, należy wykonać test beta-galaktozydazy związany ze starzeniem się na płytce testowej w określonym czasie po zadrapaniu 19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj testy scratch zostały przeprowadzone przy użyciu mysich komórek zrębu rezydujących w płucach myszy (LR-MSC) i wyizolowane, jak wspomniano w notatkach do protokołu. LR-MSC wysiano w gęstości 500 000 komórek w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i wyhodowano do 90% konfluencji w ciągu 48 godzin. Aby wygenerować uszkodzenia, 4% CSE (opisany powyżej) inkubowano z komórkami przez 24 godziny po początkowym okresie wysiewu, ale przed testem zadrapania. Dla każdego testu rysa została wygenerowana z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół zapewnia ilościowo solidną, ustandaryzowaną metodę wykonywania i analizowania testów zarysowań. Proste testy zarysowania są rutynowo stosowane w wielu różnych dziedzinach nauki w celu zbadania migracji komórek. Jednak tradycyjnie w teście zarysowania brakowało ustandaryzowanego protokołu konfiguracji i kwantyfikacji, co prowadziło do problemów z odtwarzalnością 7,10. Wiele modyfikacji i optymalizacji mających na celu ulepszenie testu zarysowania zmniejszyło te problemy, w tym obrazowanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni pozostałym członkom laboratorium za ich pomoc techniczną w opracowaniu testu uszkodzeń CSE, a także za ich wsparcie i porady podczas opracowywania tego testu. Ponadto jesteśmy wdzięczni Komitetowi Naukowemu Holy Cross Fenwick za wsparcie dla Nicholasa Cormiera oraz programowi Holy Cross College Honors za wsparcie Alexandra Yeo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM (wysoki poziom glukozy, bez dodatku glutaminy)Life Technologies31053-036
Surowica bydlęca płodu, Thermo Scientific HyCloneFisher ScientificSH3091002
Antybiotyk/przeciwgrzybiczy, Thermo Scientific HyClone Fisher ScientificSV3007901
Glutamina, 200 mM, Thermo Scientific HyCloneFisher ScientificSH3003401
Odczynnik do dysocjacji komórek TypeLELife Technologies12563-01
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, Thermo Scientific HyClone Fisher Scientific SH3002802
Falcon standardowe 60 mm naczynia do hodowli tkankowychFisher Scientific08-772B
Fisherbrand Sterylne 200 μ l końcówki do pipetFisher Scientific02-707-502
Mikroskop ze światłem odwróconym z przystawką do kameryOprogramowanie Variable
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing pluginhttp://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Oprogramowanie do analizy statystycznejMicrosoft Excel

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
  2. Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
  3. Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
  4. Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
  5. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  6. Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
  7. Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  9. Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
  10. Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
  11. Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
  12. Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
  13. Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
  14. Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
  15. McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
  16. Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
  17. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963(2014).
  18. Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
  19. Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mesenchymal Stromal CellsImage J AnalysisMurine Lung MSCsConfluence OptimizationQuantitative MigrationScratch Area MeasurementLung Regenerative Biology

Powiązane artykuły