Method Article

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż mitochondria posiadają własną maszynerię transkrypcyjną, tylko 1% białek mitochondrialnych jest syntetyzowanych wewnątrz organelli. Białka kodowane jądrowo są transportowane do mitochondriów kierowanych przez sekwencje ukierunkowane na mitochondria (MTS); jednak większość zlokalizowanych białek mitochondrialnych nie ma możliwego do zidentyfikowania MTS. Niemniej jednak fakt, że MTS może instruować białka, aby przedostały się do mitochondriów, stanowi cenne narzędzie do badania funkcji mitochondrialnych normalnie jądrowych i/lub cytoplazmatycznych białek. Niedawno zidentyfikowaliśmy kompleks kinazy cyklu komórkowego CyclinB1 / Cdk1 w mitochondriach. Aby dokładnie zbadać funkcje mitochondrialne tego kompleksu, niezbędna była nadekspresja mitochondriów i knockdown tego kompleksu bez ingerencji w jego funkcje jądrowe lub cytoplazmatyczne. Znakując CyclinB1 / Cdk1 za pomocą MTS, byliśmy w stanie osiągnąć nadekspresję mitochondrialną tego kompleksu, aby zbadać jego cele mitochondrialne, a także funkcje. Poprzez znakowanie dominująco-ujemnego Cdk1 za pomocą MTS, osiągnięto hamowanie aktywności Cdk1, szczególnie w mitochondriach. Potencjalne cele mitochondrialne kompleksu CyclinB1/Cdk1 zidentyfikowano przy użyciu podejścia proteomicznego opartego na żelu. W przeciwieństwie do tradycyjnej analizy żelowej 2D, zastosowaliśmy technologię dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej (2D-DIGE), a następnie barwienie fosfoprotein, aby fluorescencyjnie znakować różnie fosforylowane białka w mitochondrialnych komórkach eksprymujących Cdk1. Identyfikacja plam fosfoproteinowych, które zostały zmienione w typie dzikim w porównaniu z dominującymi ujemnymi mitochondriami zawierającymi Cdk1, ujawniła tożsamość mitochondrialnych celów Cdk1. Wreszcie, aby określić wpływ lokalizacji mitochondrialnej CyclinB1 / Cdk1 w progresji cyklu komórkowego, zastosowano test proliferacji komórek przy użyciu syntetycznego analogu tymidyny EdU (5-etynylo-2′-deoksyurydyny) w celu monitorowania komórek w trakcie cyklu komórkowego i replikacji ich DNA. W sumie zademonstrowaliśmy różne dostępne podejścia do badania lokalizacji mitochondriów i aktywności kinazy cyklu komórkowego. Są to zaawansowane, ale łatwe do naśladowania metody, które będą korzystne dla wielu badaczy biologii komórki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U ssaków postęp cyklu komórkowego zależy od wysoce uporządkowanych zdarzeń kontrolowanych przez cykliny i kinazy zależne od cyklin (Cdk)1. Dzięki swojej cytoplazmatycznej, jądrowej i centrosomalnej lokalizacji, CyclinB1 / Cdk1 jest w stanie synchronizować różne zdarzenia w mitozie, takie jak rozpad otoczki jądrowej i separacja centrosomów2. CyklinaB1/Cdk1 chroni komórki mitotyczne przed apoptozą3 i wspomaga rozszczepienie mitochondriów, co jest krytycznym krokiem dla równomiernego rozmieszczenia mitochondriów do nowo powstałych komórek potomnych4.

W proliferujących komórkach ssaków, mitochondrialn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja mitochondriów od hodowanych komórek

  1. Przygotowanie buforu izolacyjnego dla komórek (IBc)
    1. Przygotować 0,1 M Tris/MOPS (kwas tris(hydroksymetylo)aminometan/3-(N-morfolino)propanosulfonowy): Rozpuścić 12,1 g Tris w 800 ml wody destylowanej, doprowadzić pH do 7,4 za pomocą proszku MOPS, dodać wodę destylowaną do całkowitej objętości 1 l i przechowywać w temperaturze 4 oC.
    2. Przygotować 0,1 M EGTA (kwas bis(2-aminoetylowy)tetraoctowy glikolu etylenowego)/Tris): Rozpuścić 38,1 g EGTA w 800 ml wody destylowanej, doprowadzić pH do 7,4 za pomocą proszku Tris, dodać wodę destylowaną do całkowitej o....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Submitochondrialna lokalizacja CyclinB1 i Cdk1

Ekstrakcja węglanu sodu służy do określenia, czy białko znajduje się wewnątrz mitochondriów, czy na zewnętrznej powierzchni, czyli na zewnętrznej błonie. Gdy okaże się, że białko lokalizuje się w mitochondriach, dalsze określenie lokalizacji submitochondrialnej można przeprowadzić za pomocą mitoplastingu w połączeniu z trawieniem proteazy. Aby określić submitochondr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak białka przeznaczone dla innych organelli subkomórkowych, białka docelowe mitochondriów posiadają sygnały celujące w swojej pierwotnej lub drugorzędowej strukturze, które kierują je do organelli za pomocą skomplikowanych maszyn do translokacji i zwijania białek21,22. Sekwencje ukierunkowane na mitochondria (MTS) uzyskane z wyłącznie białek rezydujących w mitochondriach, takich jak COX8, można dodać do N-końca dowolnej sekwencji genu, aby skierować określone białka do mitochondriów11,23,24

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH CA133402, CA152313 i Departament Energii Biuro Nauki DE-SC0001271. Dziękujemy Laboratorium Wspólnych Zasobów Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, które otrzymało finansowanie z CA0933730 NCI P30 oraz granty NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 i S10 RR 026825 oraz z pomocą techniczną Pani Bridget McLaughlin i Pana Jonathana Van Dyke'a za pomoc w eksperymentach z cytometrią przepływową.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Przeciwciało wtórne przeciw myszomInvitrogen A-11003Alexa-546 sprzężone
drugorzędowe przeciwciało anty-króliczeInvitrogen A11029Alexa-488 sprzężony
ATPResearch Organics1166ADo testu kinazy in vitro
Przeciwciało Cdk1Technologia sygnalizacji komórkowej9112
Bufor kinazy Cdk1New England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Zestaw do obrazowaniaLife TechnologiesC10337Do analizy cyklu komórkowego z oznakowaniem
EdUTechnologiasygnalizacji komórkowej4844SDo mitochondrialnego barwienia immunologicznego
Przeciwciało cykliny B1Santa Cruz Biotechsc-752
Kompleks enzymatyczny cyklinB1 / Cdk1New England BiolabsP6020SUnikaj zamrażania/rozmrażania
CyDye DIGE Zestaw do znakowania fluorówGE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE Gel i zestaw buforowy DIGEGE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze28-9480-26 AA
Dimetyloformamid Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce
Dpn I enzymStratagene200519-53Do mutagenezy ukierunkowanej
Suchy płyn do pokrywania paskówGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Stosowany jako olej mineralny
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge KoncentratorFisher Scientific07-748-13Używany jako koncentrator wirówki próżniowej
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Rozwiązanie montażowe zapobiegające blaknięciu
Cytometr przepływowy FortessaBD Biosciences649908Do cyklu komórkowego analiza z oznakowaniem EdU
Histone H1Calbiochem382150Do testu kinazy in vitro
Zestaw do ekstrakcji żelem QIAquickQiagen28704Do oczyszczania fragmentów DNA z żeli agarozowych
Immobiline DryStrip GelsGE Healthcare Life Sciences18-1016-61Paski IEF (izoelektryczne ogniskowanie)
Unieruchomiony GlutationThermo Scientific15160Koraliki glutationowo-agarozowe
JodoacetamidSigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 Izoelektryczna jednostka ogniskującaGE Healthcare Life Sciences11-0033-64Uchwyty pasków IPGphor
Izopropylo-b-D-tio-galaktopionozyd RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783Do buforu do lizy komórek
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Odczynnik do transfekcji
LizynaSigma AldrichL5501Do etykietowania CyDye
LizozymEMD Chemicals5960
Mitoctracker Czerwono-ZielonyInvitrogen M7512/M7514Mitochondrialne barwniki fluorescencyjne
MOPSEMD Chemikalia6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1Wektor wyrażający GFP
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53Wektor wyrażający GST
Fluorek fenylometylosulfonyluShelton ScientificIB01090PMSF
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 rurki do dializySpectrum Labs132700jako porowata rurka membranowa do dializy
Pro-Q Diamentowa substancja fosfoproteinowa w żeluLife TechnologiesP-33300Do barwienia fosfoprotein na żelach 2D
Koktajl inhibitorów proteinazCalbiochem539134Do buforu do lizy komórek
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej QuikChangeStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep Zestawizolacji plazmiduQiagen27104
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Inhibitor Cdk1
RotenonMP Biomedicals150154Inhibitor kompleksu I
Węglan soduFisher ScientificS93359
Chlorek soduEMD ChemicalsSX0420-5Do buforu do lizy komórek
Ortowanadan soduMP Biomedicals159664Do buforu do lizy komórek
Pirofosforan sodu dekahydratAlfa Aesar33385Do buforu do lizy komórek
Sód β-glicerofosforanAlfa AesarL03425Do buforu do lizy komórek
SpectraMax M2e Urządzenia molekularneM2ECzytnik mikropłytek
SacharozaFisher Scientific57-50-1
Tłuczek do mielenia tkanekKimble Chase885301-0007Do izolacji mitochondriów
Rurka do mielenia tkanekKimble Chase885303-0007Do izolacji mitochondriów
Roztwór kwasu trichlorooctowegoSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsynaCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09Laserowy skaner żelowy do 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956
przeciwciała COX IV do MiniPrep

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

Related Articles