Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53417

⸱

25 lutego 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Streszczenie

Chociaż mitochondria posiadają własną maszynerię transkrypcyjną, tylko 1% białek mitochondrialnych jest syntetyzowanych wewnątrz organelli. Białka kodowane jądrowo są transportowane do mitochondriów kierowanych przez sekwencje ukierunkowane na mitochondria (MTS); jednak większość zlokalizowanych białek mitochondrialnych nie ma możliwego do zidentyfikowania MTS. Niemniej jednak fakt, że MTS może instruować białka, aby przedostały się do mitochondriów, stanowi cenne narzędzie do badania funkcji mitochondrialnych normalnie jądrowych i/lub cytoplazmatycznych białek. Niedawno zidentyfikowaliśmy kompleks kinazy cyklu komórkowego CyclinB1 / Cdk1 w mitochondriach. Aby dokładnie zbadać funkcje mitochondrialne tego kompleksu, niezbędna była nadekspresja mitochondriów i knockdown tego kompleksu bez ingerencji w jego funkcje jądrowe lub cytoplazmatyczne. Znakując CyclinB1 / Cdk1 za pomocą MTS, byliśmy w stanie osiągnąć nadekspresję mitochondrialną tego kompleksu, aby zbadać jego cele mitochondrialne, a także funkcje. Poprzez znakowanie dominująco-ujemnego Cdk1 za pomocą MTS, osiągnięto hamowanie aktywności Cdk1, szczególnie w mitochondriach. Potencjalne cele mitochondrialne kompleksu CyclinB1/Cdk1 zidentyfikowano przy użyciu podejścia proteomicznego opartego na żelu. W przeciwieństwie do tradycyjnej analizy żelowej 2D, zastosowaliśmy technologię dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej (2D-DIGE), a następnie barwienie fosfoprotein, aby fluorescencyjnie znakować różnie fosforylowane białka w mitochondrialnych komórkach eksprymujących Cdk1. Identyfikacja plam fosfoproteinowych, które zostały zmienione w typie dzikim w porównaniu z dominującymi ujemnymi mitochondriami zawierającymi Cdk1, ujawniła tożsamość mitochondrialnych celów Cdk1. Wreszcie, aby określić wpływ lokalizacji mitochondrialnej CyclinB1 / Cdk1 w progresji cyklu komórkowego, zastosowano test proliferacji komórek przy użyciu syntetycznego analogu tymidyny EdU (5-etynylo-2′-deoksyurydyny) w celu monitorowania komórek w trakcie cyklu komórkowego i replikacji ich DNA. W sumie zademonstrowaliśmy różne dostępne podejścia do badania lokalizacji mitochondriów i aktywności kinazy cyklu komórkowego. Są to zaawansowane, ale łatwe do naśladowania metody, które będą korzystne dla wielu badaczy biologii komórki.

Wprowadzenie

U ssaków postęp cyklu komórkowego zależy od wysoce uporządkowanych zdarzeń kontrolowanych przez cykliny i kinazy zależne od cyklin (Cdk)1. Dzięki swojej cytoplazmatycznej, jądrowej i centrosomalnej lokalizacji, CyclinB1 / Cdk1 jest w stanie synchronizować różne zdarzenia w mitozie, takie jak rozpad otoczki jądrowej i separacja centrosomów2. CyklinaB1/Cdk1 chroni komórki mitotyczne przed apoptozą3 i wspomaga rozszczepienie mitochondriów, co jest krytycznym krokiem dla równomiernego rozmieszczenia mitochondriów do nowo powstałych komórek potomnych4.

W proliferujących komórkach ssaków, mitochondrialne ATP jest generowane przez maszynerię fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) (łańcuch transportu elektronów), która składa się z 5 kompleksów wielopodjednostkowych; kompleks I - kompleks V (CI-CV). Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH): oksydoreduktaza ubichinonu lub kompleks I (CI) jest największym i najmniej poznanym z pięciu kompleksów5. Kompleks składa się z 45 podjednostek, z których 14 tworzy rdzeń katalityczny. Po złożeniu kompleks przyjmuje strukturę w kształcie litery L, z jednym ramieniem wystającym w matrycę, a drugim ramieniem osadzonym w wewnętrznej membranie6,7. Mutacje w podjednostkach CI są przyczyną różnych zaburzeń mitochondrialnych8. Funkcjonalnie wydajny CI w OXPHOS jest wymagany nie tylko dla ogólnego oddychania mitochondrialnego9, ale także dla pomyślnej progresji cyklukomórkowego10. Odkrycie mechanizmów leżących u podstaw funkcjonowania tego związanego z błoną kompleksu enzymatycznego w zdrowiu i chorobie może umożliwić opracowanie nowych procedur diagnostycznych i zaawansowanych strategii terapeutycznych. W niedawnym badaniu odkryliśmy, że kompleks CyclinB1 / Cdk1 przemieszcza się do mitochondriów w fazie M (Gap 2) G2 / (Mitozy) i fosforyluje podjednostki CI w celu zwiększenia produkcji energii mitochondrialnej, potencjalnie w celu zrównoważenia zwiększonego zapotrzebowania komórek na energię podczas cyklu komórkowego11. Tutaj prezentujemy eksperymentalne procedury i strategie, które można wykorzystać do badania translokacji mitochondrialnej kinaz jądrowych / cytoplazmatycznych, ich substratów mitochondrialnych, a także funkcjonalnych konsekwencji ich lokalizacji mitochondrialnej na przykładzie CyclinB1 / Cdk1.

Odkrycie, że kompleks CyclinB1/Cdk1 przemieszcza się do mitochondriów, gdy jest to potrzebne, skłoniło do podjęcia badań nad specyficzną dla mitochondriów nadekspresją i knockdownem tego kompleksu. Aby osiągnąć ekspresję białek specyficzną dla mitochondriów, można dodać sekwencję ukierunkowaną na mitochondria (MTS) w N-końcu białka będącego przedmiotem zainteresowania. Sekwencje ukierunkowane na mitochondria umożliwiają sortowanie białek mitochondrialnych do mitochondriów, w których normalnie się znajdują12. Użyliśmy sekwencji ukierunkowanej na mitochondria 87 zasad pochodzącej z prekursora ludzkiej podjednostki 8A oksydazy cytochromu c (COX8) i sklonowaliśmy ją do cykliny B1 znakowanej zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub Cdk1 znakowanej czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) zawierającej plazmidy w ramce. Ta metoda pozwoliła nam skierować cyklinę B1 i Cdk1 do mitochondriów, w szczególności zmieniając ekspresję mitochondrialną tych białek bez wpływu na ich pulę jądrową. Dzięki fluorescencyjnemu znakowaniu tych białek byliśmy w stanie monitorować ich lokalizację w czasie rzeczywistym. Podobnie, wprowadziliśmy MTS do plazmidu zawierającego znakowany przez RFP dominujący ujemny Cdk1, co pozwoliło nam specyficznie obniżyć ekspresję mitochondrialną i funkcje Cdk1. Konieczne jest rozróżnienie między mitochondrialnymi i jądrowymi funkcjami kinaz, które mają podwójną lokalizację, taką jak Cdk1. Inżynieria MTS w N-końcu tych podwójnie funkcjonalnych kinaz oferuje świetną strategię, która jest łatwa do zastosowania i skuteczna.

Ponieważ Cdk1 jest kinazą cyklu komórkowego, kluczowe jest określenie przebiegu cyklu komórkowego, gdy Cdk1 jest zlokalizowany w mitochondriach. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy nową metodę monitorowania zawartości DNA w komórkach. Tradycyjne metody obejmują użycie BrdU (bromodeoksyurydyny), syntetycznego analogu tymidyny, który włącza się do nowo zsyntetyzowanego DNA podczas fazy S cyklu komórkowego w celu zastąpienia tymidyny. Następnie komórki, które aktywnie replikują swoje DNA, można wykryć za pomocą przeciwciał anty-BrdU. Jedną z wad tej metody jest to, że wymaga ona denaturacji DNA, aby zapewnić dostęp do przeciwciała BrdU za pomocą ostrych metod, takich jak obróbka kwasowa lub cieplna, co może skutkować niespójnością wyników13,14. Alternatywnie, zastosowaliśmy podobne podejście do monitorowania aktywnie dzielących się komórek za pomocą innego analogu tymidyny, EdU. Detekcja EdU nie wymaga ostrej denaturacji DNA, ponieważ łagodna obróbka detergentem umożliwia odczynnikowi detekcyjnemu dostęp do EdU w nowo zsyntetyzowanym DNA. Metoda EdU okazała się bardziej wiarygodna, spójna i może być przeprowadzana w celu przeprowadzenia analizy o wysokiej przepustowości15.

Na koniec, aby określić mitochondrialne substraty Cdk1, użyliśmy narzędzia proteomicznego o nazwie 2D-DIGE, które jest zaawansowaną wersją klasycznej dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Elektroforeza dwuwymiarowa rozdziela białka zgodnie z ich punktem izoelektrycznym w pierwszym wymiarze i masą cząsteczkową w drugim. Ponieważ modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja, wpływają na punkt izoelektryczny i masę cząsteczkową białek, żele 2D mogą wykrywać różnice między stanami fosforylacji białek w różnych próbkach. Wielkość (obszar i intensywność) plamek białkowych zmienia się wraz z poziomem ekspresji białek, co pozwala na ilościowe porównanie wielu próbek. Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie zróżnicować fosforylowane białka w komórkach eksprymujących Cdk1 typu dzikiego i zmutowanych, ukierunkowanych na mitochondria. Specyficzne plamki białkowe, które występowały w typie dzikim, ale brakowało ich w zmutowanym preparacie Cdk1 ukierunkowanym na mitochondria, wyizolowano i zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas.

W tradycyjnych żelach 2D, barwniki trifenylometanowe są używane do wizualizacji białek na żelu. 2D-DIGE używa fluorescencyjnych etykiet białkowych z minimalnym wpływem na ruchliwość elektroforetyczną białka. Różne próbki białek mogą być znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, mieszanymi ze sobą i rozdzielanymi przez identyczne żele, co pozwala na koelektroforezę wielu próbek na jednym żelu16. Minimalizuje to różnice między żelami, co jest krytycznym problemem w badaniach proteomicznych opartych na żelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja mitochondriów od hodowanych komórek

  1. Przygotowanie buforu izolacyjnego dla komórek (IBc)
    1. Przygotować 0,1 M Tris/MOPS (kwas tris(hydroksymetylo)aminometan/3-(N-morfolino)propanosulfonowy): Rozpuścić 12,1 g Tris w 800 ml wody destylowanej, doprowadzić pH do 7,4 za pomocą proszku MOPS, dodać wodę destylowaną do całkowitej objętości 1 l i przechowywać w temperaturze 4 oC.
    2. Przygotować 0,1 M EGTA (kwas bis(2-aminoetylowy)tetraoctowy glikolu etylenowego)/Tris): Rozpuścić 38,1 g EGTA w 800 ml wody destylowanej, doprowadzić pH do 7,4 za pomocą proszku Tris, dodać wodę destylowaną do całkowitej objętości 1 l i przechowywać w temperaturze 4 oC.
    3. Przygotować 1 M sacharozy: Rozpuścić 34,23 g sacharozy w 100 ml wody destylowanej, przygotować 20 ml podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 oC.
    4. Przygotować bufor IBc: Przygotować 100 ml buforu IBc, dodając 10 ml 0,1 M Tris/MOPS i 1 ml 0,1 M EGTA/Tris do 20 ml 1 M sacharozy. Dodaj wodę destylowaną do całkowitej objętości 100 ml. Dostosuj pH do 7,4.
  2. Przygotowanie buforu do lizy komórek
    1. Przygotować bufor do lizy zawierający 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM pirofosforan sodu, 1 mM β-glicerofosforan, 1 mM ortowanadan sodu. Bezpośrednio przed użyciem dodać inhibitory proteinaz 1 μg/ml leupeptyny i 1 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu).
  3. Izolacja mitochondriów
    1. Zebrać 3 x 107 komórek z lodowatym 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) o pH 7,4 i odwirować komórki przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml lodowatego buforu IBc.
    2. Homogenizować komórki za pomocą młynka do tkanek szklanych/szklanych przez około 10 minut. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC. W przypadku funkcjonalnych mitochondriów użyj sprzężenia szkło/teflon, ponieważ jest ono mniej szkodliwe dla mitochondriów niż młynek do tkanek szklanych/szklanych.
    3. Zebrać sklarowany osad do probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy sile 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i zachować jako białko cytozolowe.
    4. Przepłukać osad (mitochondria) dwukrotnie 200 μl lodowatego buforu IBc i odwirować przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do lizy komórek i natychmiast go zużyć lub przechowywać w temperaturze -80 oC do wykorzystania w przyszłości. Jeśli potrzebne są funkcjonalne mitochondria, po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w pozostałym buforze. Dalsze rozcieńczanie frakcji mitochondrialnej może spowodować utratę funkcji mitochondriów. Przechowywać na lodzie i zużyć preparat w ciągu 1 - 3 godzin, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
    6. Sonikować zawieszony osad przez trzydzieści 3-sekundowych serii w łaźni lodowej, odwirowywać przy 10 000 x g przez 5 minut i zachować supernatant jako frakcję mitochondrialną.

2. Współimmunologiczne barwienie Cdk1, CyclinB1 i COXIV, mitochondrialnego białka rezydentnego

  1. Hoduj 5 x 104 komórki na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach O/N lub do 70% konfluencji. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki 500 μl lodowatego środka 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Utrwalić komórki za pomocą 500 μl lodowatego 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odessać roztwór utrwalający i przemyć komórki 500 μl 1 x PBS 3 razy, po 5 minut każdy, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  3. Przepuszczalność komórek 0,2% Triton X-100 w 500 μl PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór i przemyć komórki 3 razy, po 5 minut każdy, 500 μl PBS. Dodać roztwór blokujący (500 μl, 1% BSA (albumina surowicy bydlęcej) w PBS zawierającym 1% Tween 20) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w stosunku 1:250 (v:v) w 500 μl roztworu blokującego i inkubować komórki z pożądanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi wyhodowanymi u różnych gatunków, aby uniknąć sygnalizacji krzyżowej (Cyklina B1 (mysz) i COXIV (królik) lub Cdk1 (mysz) i COXIV (królik) w RT przez 30 - 60 minut lub O/N w temperaturze 4 oC.
  5. Przemyć szkiełka nakrywkowe 500 μl 1 x PBS 3 razy po 5 minut każdy, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:1 000 w 500 μl roztworu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przemyć 500 μl PBS 3 razy po 5 minut każdy.
  6. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą 20 μl roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu i uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci. Preparaty należy od razu zobrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub przechowywać w ciemności w temperaturze 4 oC przez 1 - 2 tygodnie.

3. Ekstrakcja nienaruszonych mitochondriów węglanem sodu

  1. Wyhoduj około 20 x 107 komórek, zbierz, przemyj raz PBS i wyizoluj mitochondria, jak opisano w sekcji 1. Podzielić izolaty mitochondrialne na dwie części przed ostatnim wirowaniem w celu osadzenia mitochondriów (przed krokiem 1.3.4); Zachowaj połowę do wykorzystania jako całkowite mitochondria (krok 3.2), drugą połowę użyj do ekstrakcji węglanu sodu (zgodnie z krokami 3.3-3.6), aby oddzielić białka rozpuszczalne i związane z błoną.
  2. Poddać lizie całkowity osad mitochondriów za pomocą 30 μl buforu do lizy komórek i przechowywać lizat w temperaturze -80 oC do czasu wykorzystania w immunoblottingu.
  3. Dodać 250 μl 0,1 M Na2CO3 (węglan sodu) o pH 11,0 do drugiej połowy osadu mitochondrialnego i inkubować na lodzie przez 30 minut.
  4. Wirować przy 100 000 x g przez 20 minut. Zebrać supernatant i przejść do kroku 3.5. Poddać lizie osad przy użyciu 30 μl buforu do lizy komórek i dokonać sonikacji jak w kroku 1.3.6. Przechowywać w temperaturze -80 oC do czasu użycia w immunoblottingu.
  5. Dodać równą objętość 20% świeżo przygotowanego kwasu trójchlorooctowego (TCA) do supernatantu, aby wytrącić białka i trzymać na lodzie przez 30 minut.
  6. Wirować przy 15 000 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant, rozpuścić osad w 80 μl buforu do lizy komórek i przechowywać w temperaturze -80 oC do czasu wykorzystania w immunoblottingu.

4. Separacja wewnętrznych i zewnętrznych błon mitochondriów (izolacja mitoplastów)

  1. Wyhoduj około 20 x 107 komórek, zbierz, przemyj raz PBS i wyizoluj mitochondria, jak opisano w sekcji 1. Rozdzielić frakcje mitochondrialne na 10 równych porcji przed ostatnim wirowaniem w celu osadzenia mitochondriów (przed krokiem 1.3.4).
  2. Rozpuścić każdą osadkę w 30 μl wskazanego stężenia hipotonicznego buforu sacharozy (1 mM EDTA, 10 mM MOPS/KOH (wodorotlenek potasu), pH 7,2; stężenie sacharozy w zakresie 25 - 200 mM) z lub bez 50 μg/ml trypsyny (patrz tabela 1) i inkubować 30 minut na lodzie.
  3. Dodać 3 μl 10 mM PMSF (aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mM PMSF) do fiolek zawierających trypsynę, aby zatrzymać trawienie trypsyny i inkubować na lodzie przez 10 minut.
  4. Wirować w temperaturze 14 000 x g w temperaturze 4 oC przez 10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki, poddać lizie osad w 30 μl buforu do lizy komórek, dokonać sonikacji jak w kroku 1.3.6 i przechowywać w temperaturze -80 oC.

5. Budowa wektorów cyklinB1/Cdk1 oznaczonych mitochondriami GFP/RFP i potwierdzenie ich lokalizacji mitochondrialnej

  1. Sklonuj sekwencję ukierunkowaną na mitochondria (MTS; pochodzącą z prekursora ludzkiej podjednostki 8A oksydazy cytochromu c (COX8) między nukleotydami 76 - 161) w ramce do N-końca GFP lub RFP w miejscach NheI i BamHI wektorów pEGFP-N1 lub pERFP-N1 przy użyciu standardowych technik klonowania molekularnego.
  2. Projektując startery PCR dla genów CyclinB1 i Cdk1, dodaj miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych BamHI (pogrubiona) do 5' starterów PCR.
    Naprzód Cdk1 BamH1 5' CAG TGG ATC CAA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Rewers Cdk1 BamH1 5' CTG TGG ATC CTG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Forward CyclinB1 BamH1 5' ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Odwrócona cyklinaB1 BamH1 5' ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Amplifikuj geny Cdk1 i CyclinB1 za pomocą tych starterów zgodnie ze standardowymi technikami. Trawić produkty PCR za pomocą 1 μl enzymu restrykcyjnego BamHI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Uruchom produkty trawienne na 1% żelu agarozowym. Za pomocą żyletki wytnij fragmenty DNA o odpowiedniej wielkości i oczyść DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
  4. Trawić 1 μg plazmidów MTS-pEGFP-N1 i MTS-pERFP-N1 z 1 μl enzymu BamHI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Dodawać 1 μl fosfatazy alkalicznej cielęcej () przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Uruchomić produkty trawienia na 1% żelu agarozowym i oczyść liniowe plazmidy z żelu, jak w kroku 5.3.
  5. Ustawić reakcję ligacji, dodając 1 μl plazmidu z kroku 5.4 i 5 μl Cdk1 lub cyklinB1 z kroku 5.3 do 3 μl buforu ligazy, 0,5 μl ligazy T4 i 20,5 μl dH2O. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
  6. Przekształć kompetentne komórki Escherichia coli DH5α za pomocą 10 μl mieszaniny ligacyjnej zgodnie ze standardowymi technikami i hodować bakterie na płytkach agarowych LB zawierających 10 mg / ml kanamycyny O / N w temperaturze 37 °C w celu uzyskania kolonii.
  7. Wybrać kolonię z płytek wyhodowanych przez O/N za pomocą sterylnej końcówki pipety, włożyć końcówkę do 5 ml probówki zawierającej kanamycynę-LB i inkubować O/N. Wyizolować plazmid za pomocą zestawów miniprep zgodnie z protokołem producenta i zsekwencjonować plazmid przy użyciu standardowych technik.
  8. Transfekcja wykładniczo rosnących komórek MCF10A (1,5 x 104 komórek wysianych na 96-dołkowych płytkach) plazmidami MTS-Cdk1-RFP lub MTS-CyclinB1-GFP z kroku 5.7, przygotowując stosunek plazmidu do odczynnika do transfekcji 1:2 (w:v, 100 ng: 0,2 μl) w 100 μl surowicy wolnej od antybiotyków.
  9. Inkubować komórki w mieszaninie plazmidu i odczynnika przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 z kontrolą wilgotności (5% CO2, 95% wilgotności względnej).
  10. Przygotować 1 mM roztwór podstawowy mitochondrialnych czerwonych i zielonych barwników fluorescencyjnych, rozpuszczając 50 μg proszku w 100 μl DMSO. Rozcieńczyć roztwory podstawowe w stosunku 1:400 w 1x PBS, aby uzyskać roztwory robocze 2,5 μM. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez rok.
  11. Zmieszać 2 μl z 2,5 μM czerwonego barwnika z 98 μl pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 nM.
  12. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej komórek CyclinB1-GFP zawierających MCF10A (wygenerowanych w kroku 5.8) pożywką zawierającą czerwony barwnik przez 2 minuty. Powtórz tę samą procedurę z zielonym barwnikiem dla komórek MCF10A zawierających Cdk1-RFP.
  13. Przemyć dwukrotnie 100 μl 1 x PBS Aby pozbyć się nadmiaru roztworu barwiącego, dodać 100 μl 1x PBS do płytki 96-dołkowej.
  14. Wizualizacja mitochondriów i cykliny B1-GFP (wzbudzenie przez 488 nm i emisja przy 494 - 536 nm) oraz Cdk1-RFP (wzbudzenie przez 560 nm i emisja przy 565 - 620 nm) na 96-dołkowych płytkach pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 40-krotnym powiększeniu.

6. Identyfikacja różnie fosforylowanych białek za pomocą 2D-DIGE

  1. Przygotowanie próbki
    1. Wyizoluj mitochondria i zjonizuj frakcje mitochondrialne, jak w kroku 1.3. Dodać równą objętość 20% TCA (kwas trichlorooctowy w wodzie) do każdej próbki i wirować przez 15 sekund. Próbki należy inkubować na lodzie przez 30 minut, gdy białka wytrącają się z roztworu.
    2. Odwirować próbki przy 9 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, usunąć supernatant i dodać 60 μl zimnego acetonu (100%), a następnie odwirować przy 9 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    3. Powtórzyć etap płukania acetonem (etap 6.1.2) jeszcze raz, usunąć supernatant i ponownie zawiesić próbki w 50 μl buforu do znakowania DIGE (7 M mocznik, 2 M tiomocznik, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
  2. Przygotuj barwniki fluorescencyjne
    1. Przygotować roztwór podstawowy: Rozpuścić barwniki (5 nmol) w 5 μl świeżego dimetyloformamidu (DMF) do końcowego stężenia 1 nmol/μl. Przechowywać podstawowy roztwór barwnika w temperaturze -20 oC do czasu użycia przez kilka miesięcy.
    2. Przygotować roztwór roboczy: Pozostawić barwniki do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Rozcieńczyć 1 μl barwnika z 4 μl DMF do końcowego stężenia 200 pmol/μl. Podczas użycia przechowywać na lodzie. Uwaga: Roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze -20 oC przez 3 tygodnie.
  3. Etykieta Białka
    1. Wymieszać 1 μl roztworu barwnika roboczego na 12,5 μg białka. Skaluj w górę zgodnie z potrzebami. W przypadku zbiorczych wzorców dodać 6 μl roztworu roboczego Cy2 do 300 μg białka zbiorczego.
    2. Wirować przez 30 sekund i wirować w temperaturze 4 °C przez 30 sekund przy 12 000 x g. Inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut. Przerwać etykietowanie, dodając 1 μl 10 mM lizyny na 1 μl użytego roztworu roboczego. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie w ciemności przez 10 minut.
    3. Zebrać indywidualnie oznakowane próbki i wymieszać z buforem nawadniającym (7 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, błękit bromofenolowy). Całkowita objętość wyniesie 125 μl.
    4. Wirować próbki przez 30 sekund i pozostawić próbki do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Załadować 125 μl próbek na paski izoelektryczne do ogniskowania (IEF) o pH 4 - 9 o średnicy 7 cm.
  4. Elektroforeza pierwszego wymiaru
    1. Umieść uchwyty pasków (trumny) na płytce elektrody, upewniając się, że uchwyty pasków są całkowicie czyste i suche. Pobrać pipetę 125 μl próbek do trumny, równomiernie rozprowadzając ją po całej trumnie.
    2. Za pomocą pęsety podnieś pasek IEF, ostrożnie zdejmij plastikową osłonę ochronną i umieść go (żelową stroną do dołu) w trumnie/buforze nawadniającym. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza. Powoli napełnij trumnę (1 - 1,5 ml) olejem mineralnym i umieść pokrowce na trumny.
    3. Rozpocznij ogniskowanie izoelektryczne zgodnie z protokołem w tabeli 2:
      Uwaga: Po zakończeniu cyklu paski mogą być przechowywane w plastikowych tubach w temperaturze -80 oC lub bezpośrednio przenoszone do równoważenia i drugiego wymiaru.
  5. Drugi wymiar - elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE)
    1. Równowagi
      1. Rozmrozić bufor równoważący SDS (8 ml na pasek, 6 M mocznika, 30% glicerolu, 2% SDS). Odważyć ditiotreitol (DTT; 10 mg DTT na 1 ml buforu równoważącego SDS). Rozpuścić naziemną telewizję cyfrową w 4 ml buforu równoważącego SDS.
      2. Odważyć IAA (jodoacetamid, 25 mg IAA na 1 ml buforu równoważącego SDS). Rozpuścić IAA w 4 ml buforu równoważącego SDS.
      3. Rozpuść 1 ml uszczelniającego roztworu agarozy w łaźni wodnej do późniejszego użycia.
      4. Jeśli paski zostały zamrożone, pozwól im całkowicie się rozmrozić. Umieść paski żelową stroną do góry w tacce do pęcznienia. Do każdego paska dodać 4 ml buforu równoważącego SDS z naziemną teleterapią (DTT) i inkubować przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
      5. Odlać cały bufor równowagi SDS za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej. Dodać 4 ml buforu równoważącego SDS z IAA do każdego paska i inkubować przez kolejne 15 minut, delikatnie wstrząsając. Po zrównoważeniu z buforem IAA wlać bufor równoważący SDS.
    2. STRONA SDS
      1. Rozwiń mini żele, wyjmij grzebień i spłucz żel oraz studzienki ddH2O. Usuń białą taśmę na dole żelu przed uruchomieniem. Prawidłowo ustaw pasek na żelu, orientacja żelu ma kluczowe znaczenie dla cięcia punktowego.
      2. Umieść żel płasko na blacie z małą płytką do góry i eksperymentatorem skierowanym do góry żelu. Połóż pasek na wysokiej płytce z anodowym końcem (++ koniec z kodem kreskowym) skierowanym w lewą stronę żelu. Za pomocą linijki powoli dociśnij pasek do powierzchni żelu. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza między paskiem a żelem. Umieść żel w szklanym stojaku na talerz.
      3. Dodać 1 ml gorącego roztworu agarozy uszczelniającej do otworu kasety. Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały wyciśnięte za pomocą płaskiej linijki. Zmontuj aparat i uruchom żel ze stałym napięciem 125 V przez 90 minut.
      4. Gdy żel zakończy pracę, umieść żel na obrazie biomolekularnym z 2 ml ddH2O i zeskanuj żel w trybie akwizycji fluorescencji za pomocą lasera wzbudzającego 635 nm i filtra emisyjnego 665 nm.
    3. Barwienie fosfoproteinami
      1. Utrwalić żel 50% mieszaniną metanolu i 10% kwasu octowego (10 ml) przez 30 minut dwukrotnie. Płukać 10 ml wody przez 10 minut trzy razy i barwić 10 ml barwnika fosfoproteinowego przez 60 - 90 minut, a następnie trzykrotnie odbarwiać 10 ml roztworu odbarwiającego przez 30 minut.
      2. Przemyć 10 ml wody przez 5 minut dwa razy i zobrazować żel za pomocą laserowego skanera żelu przy 532 nm/560 nm wzbudzenie/emisja.
    4. Trawienie i identyfikacja białek
      1. Wyciąć wszystkie plamki białkowe o zróżnicowanej ekspresji z żelu do dołków mikropłytkowych za pomocą zrobotyzowanego zbieracza punktowego zgodnie ze specyfikacją producenta i dodać 100 mM wodorowęglanu amonu (2 ml) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu odbarwienia kawałków żelu. Odwodnić 2 ml 100% acetonitrylu przepłukać dwukrotnie i wysuszyć w koncentratorze próżniowym przez 30 minut.
      2. Ponownie uwodnić kawałki żelu 100 μl modyfikowanej trypsyny wieprzowej o stężeniu 13 ng/μl w 50 mM wodorowęglanie amonu przez 16 godzin w temperaturze 37 °C. Zebrać supernatanty i dalej ekstrahować białka za pomocą 100 μl 5% kwasu trifluorooctowego w 50% acetonitrylu przez 30 min.
      3. Zagęścić peptydy do 5 μl za pomocą koncentratora wirówki próżniowej i przeanalizować za pomocą jonizacji z desorpcją laserową wspomaganą matrycą - czas przelotu - analiza spektrometrii mas w tandemie (MALDI TOF-MS/MS)17.

7. Test kinazy in vitro

  1. Przygotowanie podłoży
    1. Podjednostki podklonu kompleksu I (CI) (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 i NDUFA12), które są identyfikowane jako różnie fosforylowane cele Cdk1, do wektora pGEX-5X-1 w celu wytworzenia plazmidów o ekspresji bakteryjnej znakowanej glutationem-S-transferazą (GST)11. Oczyść podjednostki CI za pomocą kolumn glutationu o wysokim powinowactwie zgodnie z poniższym protokołem.
      1. Podjednostka CI znakowana GST zawierająca szczep Escherichia coli BL-21 w bulionie Luria-Bertani (LB) z 50 μg/ml ampicyliny w wytrząsarce w temperaturze 37 oC do osiągnięcia gęstości optycznej (OD) 0,6. Dodać izopropylo-b-D-tio-galaktopiranozyd (IPTG) do kultury w końcowym stężeniu 0,1 mM i inkubować przez dodatkowe 3 godziny.
      2. Wirować przy 600 x g przez 10 minut, aby zebrać bakterie i ponownie zawiesić w 5 ml 1 x bufor PBS zawierający 5 mM DTT, 1 x koktajl inhibitorów proteinaz i 0,1% lizozymu. Lizować komórki przez sonikację przez dwadzieścia 5 seriów i usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 600 x g przez 10 minut.
      3. Zebrać supernatant i inkubować z kulkami glutationowo-agarozowymi 4B w stosunku objętościowym 4:1 (supernatant: kulka) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      4. Eluować białka fuzyjne GST z kulek za pomocą 3 ml buforu elucyjnego glutationu (10 mM zredukowany glutation w 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) i poddać wymyte białka dializie w molekularnej porowatej rurce membranowej (odcięcie masy cząsteczkowej 12-14 kilodaltonów) za pomocą 1 x PBS / 1 mM EDTA. Oczyszczone białka przechowywać w temperaturze -80 oC.
  2. Test kinazy Cdk1
    1. Przed rozpoczęciem testu kinazy należy ustawić bloki grzewcze na 30 °C i 100 °C. Rozmrozić komercyjny kompleks enzymatyczny CyclinB1/Cdk1 i substraty na lodzie.
    2. Przygotuj mieszaninę reakcyjną na lodzie. Ponieważ w grę wchodzi izotop 32P ATP, wszystkie mieszaniny reakcyjne należy przygotować w probówkach o pojemności 1,5 ml z nakrętkami zawierającymi O-ring, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się radioaktywności.
      Uwaga: Przestrzegać zasad ochrony materiałów promieniotwórczych. Użyj osłony z pleksiglasu o grubości 8 mm i pracuj co najmniej na odległość ramienia. Wytrzyj zanieczyszczony obszar wodą.
    3. Przygotować 30 μl buforu reakcyjnego zawierającego 1 x bufor Cdk1 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM zimnego ATP, 0,1 μCi 32P ATP, 2 jednostki CyclinB1/Cdk1 i 6 μg białka substratowego. Ustaw głośność na 30 μl za pomocą ddH2O. W przypadku pozytywnej reakcji kontroli zastąp substrat 0,01 mM histonem H1, dobrze znanym substratem CyclinB1 / Cdk1.
      1. W przypadku reakcji kontroli ujemnej (1) zastąp substrat samym białkiem GST i (2) zastąp substrat 0,01 mM histonem H1 + 0,5 μM RO-3306, selektywnym inhibitorem Cdk1.
    4. Dobrze wymieszaj pipetą i wirówką, aby sprowadzić cały płyn na dno probówki, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 60 minut.
    5. Dodać 6 μl 5-krotnego buforu do próbek SDS, aby zatrzymać reakcję i denaturować w temperaturze 100 oC przez 10 minut. Próbki należy przetworzyć na 10% żelu SDS-PAGE pod napięciem 160 V przez 2 godziny lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do końca żelu. Przenieść żel na bibułę chromatograficzną i owinąć folią.
      Ostrzeżenie: Wszystkie ciecze mające kontakt z izotopami promieniotwórczymi powinny być traktowane jako odpady radioaktywne i utylizowane w 5-galonowym balonie polietylenowym dostarczonym przez służby zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    6. Żel należy wystawić na działanie kliszy rentgenowskiej przez 1 dzień lub do 1 tygodnia w temperaturze -20 oC, w zależności od specyficznej aktywności użytego radioizotopu i enzymu.

8. Mutageneza ukierunkowana na miejsce w celu wygenerowania dominującego ujemnego Cdk1 (D146N)

  1. Zaprojektuj startery mutagenezy; dwa startery, komplementarne względem siebie, zawierające zmutowane miejsce (G zostanie zastąpione przez nukleotyd A kodujący N zamiast aminokwasu D) otoczone 20 zasadami z każdej strony11.
  2. Przygotuj 50 μl mieszaniny reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zawierającej 1x bufor reakcyjny, 2,5 mM dNTP, 10 μM starterów (zarówno do przodu, jak i do tyłu), 40 ng matrycy i ddH2O. Dodaj 2,5 U polimerazy DNA do reakcji.
  3. Uruchom następujący program PCR: 95 °C 3 min, 95 °C 30 sekund, 55 °C 30 min, 68 °C 6 min; 16 cykli (Uwaga: czas inkubacji 68 °C zależy od wielkości DNA. 1 min/kb jest wymagany dla DNA ≤ 10 kb. W przypadku większego DNA, 2 min/kb plus 10 sekund na cykl). Następnie w temperaturze 68 °C 7 minut i przytrzymaj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do użycia.
  4. Dodać 2 μl enzymu restrykcyjnego Dpn I (10 j./μl) i 5,7 μl buforu Dpn I, dobrze wymieszać delikatnym stuknięciem palcem i inkubować reakcję w temperaturze 37 oC przez 1 godzinę.
  5. Przenieś 10 μl produktów PCR poddanych działaniu Dpn I do 50 μl komórek DH5α kompetentnych do transformacji. Inkubować na lodzie przez 30 minut, następnie przez 45 sekund szok termiczny w temperaturze 42 oC i 5 minut na lodzie. Dodać 500 μl LB i wstrząsać w temperaturze 37 oC przez 1 godzinę przed posiewem na płytkach LB-agar. Inkubować O/N w temperaturze 37 oC.
  6. Pobrać kolonię z płytek agarowych wyhodowanych przez O/N za pomocą sterylnej żółtej końcówki pipety, wrzucić końcówkę do probówki zawierającej 5 ml LB i wyhodować O/N w shakerze o temperaturze 37 oC. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu miniprep i zsekwencjonuj plazmid, aby potwierdzić mutację zgodnie z protokołem producenta.

9. Wyznaczanie długości faz cyklu komórkowego za pomocą testu inkorporacji EdU

  1. Sortowanie komórek
    1. Transfekcja 2 x 105 komórek ze wskazanymi wektorami (MTS-GFP/RFP, MTS-CyclinB1-GFP/Cdk1-wt-RFP lub MTS-Cdk1-dn-RFP) na płytce 6-dołkowej przy użyciu stosunku 1:2 (w:v, 2,5 μg: 5 μl) DNA:Transfekcja Mieszanina odczynników przygotowana w 2,5 ml pożywki hodowlanej wolnej od surowicy i antybiotyków przez 48 godzin. Żywe komórki sortują stabilnie eksprymujące białka Cdk1 i RFP znakowane RFP za pomocą cytometru przepływowego.
      1. Umyć komórki 1 x PBS, dodać 100 μl trypsyny do naczynia i inkubować w temperaturze 37 oC przez 5 minut. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej, aby zebrać komórki i przepuścić je przez filtr 70 μm, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Przemyć zawiesinę jednokomórkową 500 μl 1% płodowej surowicy cielęcej w PBS (FCS/PBS) przed załadowaniem jej do cytometru przepływowego.
      2. Ustaw parametry sortowania zgodnie z ustalonymi protokołami18 bramkowanie dla podwójnie dodatnich komórek wybarwionych zarówno GFP, jak i RFP. Zebrać posortowane komórki wychodzące z cytometru do probówki zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych i użyć tych komórek do analizy progresji cyklu komórkowego z oznakowaniem impulsowym EdU, jak w protokole 9.2.
  2. Pomiar długości cyklu komórkowego za pomocą testu cytometrii przepływowej EdU
    1. Nasiona: posortowane komórki na płytkach 6-dołkowych o gęstości 2,5 x 10,5 komórek na studzienkę i hodowla O/N w temperaturze 37 oC w inkubatorze CO2 . Dodać EdU do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 25 μM. Inkubować w temperaturze 37 oC w inkubatorze CO2 przez 1 godzinę.
    2. Umyj komórki 1% BSA w 500 μl PBS i zbieraj je do probówki o pojemności 1,5 ml w odstępach 2-godzinnych, w sumie przez 10 - 12 godzin.
    3. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant. Usunąć osad, dodając 100 μl roztworu utrwalającego (dostarczonego przez producenta w zestawie do etykietowania EdU) przez 15 minut w temperaturze pokojowej i dobrze wymieszać.
    4. Umyć komórki trzykrotnie 1 ml 1% BSA w PBS. Ponownie utrwalić komórki za pomocą 0,5 ml 70% etanolu O/N o stężeniu 4 oC.
      Uwaga: Wiązanie etanolu ma kluczowe znaczenie dla wygaszenia wewnętrznej fluorescencji GFP/RFP ze względu na ekspresję białka znakowanego rekombinantem.
    5. Ponownie odwirować komórki przy stężeniu 350 x g przez 5 minut i przemyć osad 1 ml 1% BSA w PBS jeden raz. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu permeabilizacyjnego (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg/ml RNazy A w PBS) na 20 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Jednokrotnie przemyć komórki 1 ml 1% BSA w PBS. Dodaj 0,5 ml koktajlu reakcyjnego do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
    7. Przemyć 1 ml 1% BSA w PBS i zabarwić DNA 50 μg/ml jodku propidyny (PI) w 1 ml 1% BSA w PBS.
    8. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, aby śledzić populację EdU-dodatnią. Przedstaw wykres punktowy rozproszenia komórek znakowanych EdU wybarwionych pod kątem zawartości DNA (barwienie PI, oś X) i EdU (barwienie Alexa 647, oś Y).
      1. Użyj kanału APC dla Alexa647-EdU, wykorzystując filtr pasmowy 670/30, w którym całe światło obecne poniżej 685 nm uderza w ten filtr; oraz kanał fikoerytryny (PE) dla PI z filtrem pasmowym 581/15 przed nim, gdy całe światło obecne poniżej 600 nm uderza w ten filtr.
      2. Wprowadzić pierwszą probówkę zawierającą komórki do cytometrii przepływowej i zastosować standardową strategię bramkowania do akwizycji: Wykreśl obszar FSC X obszar SSC dla morfologii, a następnie PI (kanał PE) X Alexa647-EdU (kanał APC) dla barwienia komórek. Rejestruj dane dla wszystkich probówek jedna po drugiej, uzyskując 10 000 zdarzeń na próbkę.
      3. Określ rozkład fazowy cyklu komórkowego komórek i długości faz za pomocą oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej zgodnie z ustalonymi protokołami11,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Submitochondrialna lokalizacja CyclinB1 i Cdk1

Ekstrakcję węglanem sodu stosuje się w celu ustalenia, czy białko znajduje się wewnątrz mitochondriów, czy na ich powierzchni zewnętrznej, a konkretnie w błonie zewnętrznej. Po wykazaniu lokalizacji białka wewnątrz mitochondriów, dalsze określenie lokalizacji submitochondrialnej można przeprowadzić poprzez mitoplastykę w połączeniu z trawieniem proteazą. Aby określi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podobnie jak białka przeznaczone dla innych organelli subkomórkowych, białka docelowe mitochondriów posiadają sygnały celujące w swojej pierwotnej lub drugorzędowej strukturze, które kierują je do organelli za pomocą skomplikowanych maszyn do translokacji i zwijania białek21,22. Sekwencje ukierunkowane na mitochondria (MTS) uzyskane z wyłącznie białek rezydujących w mitochondriach, takich jak COX8, można dodać do N-końca dowolnej sekwencji genu, aby skierować określone białka do mitochondriów11,23,24

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH CA133402, CA152313 i Departament Energii Biuro Nauki DE-SC0001271. Dziękujemy Laboratorium Wspólnych Zasobów Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, które otrzymało finansowanie z CA0933730 NCI P30 oraz granty NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 i S10 RR 026825 oraz z pomocą techniczną Pani Bridget McLaughlin i Pana Jonathana Van Dyke'a za pomoc w eksperymentach z cytometrią przepływową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Przeciwciało wtórne przeciw myszomInvitrogen A-11003Alexa-546 sprzężone
drugorzędowe przeciwciało anty-króliczeInvitrogen A11029Alexa-488 sprzężony
ATPResearch Organics1166ADo testu kinazy in vitro
Przeciwciało Cdk1Technologia sygnalizacji komórkowej9112
Bufor kinazy Cdk1New England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Zestaw do obrazowaniaLife TechnologiesC10337Do analizy cyklu komórkowego z oznakowaniem
EdUTechnologiasygnalizacji komórkowej4844SDo mitochondrialnego barwienia immunologicznego
Przeciwciało cykliny B1Santa Cruz Biotechsc-752
Kompleks enzymatyczny cyklinB1 / Cdk1New England BiolabsP6020SUnikaj zamrażania/rozmrażania
CyDye DIGE Zestaw do znakowania fluorówGE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE Gel i zestaw buforowy DIGEGE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze28-9480-26 AA
Dimetyloformamid Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce
Dpn I enzymStratagene200519-53Do mutagenezy ukierunkowanej
Suchy płyn do pokrywania paskówGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Stosowany jako olej mineralny
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge KoncentratorFisher Scientific07-748-13Używany jako koncentrator wirówki próżniowej
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Rozwiązanie montażowe zapobiegające blaknięciu
Cytometr przepływowy FortessaBD Biosciences649908Do cyklu komórkowego analiza z oznakowaniem EdU
Histone H1Calbiochem382150Do testu kinazy in vitro
Zestaw do ekstrakcji żelem QIAquickQiagen28704Do oczyszczania fragmentów DNA z żeli agarozowych
Immobiline DryStrip GelsGE Healthcare Life Sciences18-1016-61Paski IEF (izoelektryczne ogniskowanie)
Unieruchomiony GlutationThermo Scientific15160Koraliki glutationowo-agarozowe
JodoacetamidSigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 Izoelektryczna jednostka ogniskującaGE Healthcare Life Sciences11-0033-64Uchwyty pasków IPGphor
Izopropylo-b-D-tio-galaktopionozyd RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783Do buforu do lizy komórek
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Odczynnik do transfekcji
LizynaSigma AldrichL5501Do etykietowania CyDye
LizozymEMD Chemicals5960
Mitoctracker Czerwono-ZielonyInvitrogen M7512/M7514Mitochondrialne barwniki fluorescencyjne
MOPSEMD Chemikalia6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1Wektor wyrażający GFP
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53Wektor wyrażający GST
Fluorek fenylometylosulfonyluShelton ScientificIB01090PMSF
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 rurki do dializySpectrum Labs132700jako porowata rurka membranowa do dializy
Pro-Q Diamentowa substancja fosfoproteinowa w żeluLife TechnologiesP-33300Do barwienia fosfoprotein na żelach 2D
Koktajl inhibitorów proteinazCalbiochem539134Do buforu do lizy komórek
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej QuikChangeStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep Zestawizolacji plazmiduQiagen27104
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Inhibitor Cdk1
RotenonMP Biomedicals150154Inhibitor kompleksu I
Węglan soduFisher ScientificS93359
Chlorek soduEMD ChemicalsSX0420-5Do buforu do lizy komórek
Ortowanadan soduMP Biomedicals159664Do buforu do lizy komórek
Pirofosforan sodu dekahydratAlfa Aesar33385Do buforu do lizy komórek
Sód β-glicerofosforanAlfa AesarL03425Do buforu do lizy komórek
SpectraMax M2e Urządzenia molekularneM2ECzytnik mikropłytek
SacharozaFisher Scientific57-50-1
Tłuczek do mielenia tkanekKimble Chase885301-0007Do izolacji mitochondriów
Rurka do mielenia tkanekKimble Chase885303-0007Do izolacji mitochondriów
Roztwór kwasu trichlorooctowegoSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsynaCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09Laserowy skaner żelowy do 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956
przeciwciała COX IV do MiniPrep

Bibliografia

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341(2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kinaza Cdk1nadekspresja mitochondrialnaanaliza 2D-DIGEtest znakowania EdUcytometria przepływowaekstrakcja węglanem sodufrakcjonowanie submitochondrialnesekwencja kierująca do mitochondriówtest proliferacji komórek
Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.