Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Podsumowanie

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Streszczenie

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku (EGL) jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu i doskonałym modelem do badania proliferacji i różnicowania neuronów. Ponadto ewolucyjne modyfikacje jego zdolności proliferacyjnych były odpowiedzialne za dramatyczne rozszerzenie rozmiaru móżdżku u owodniowców, co czyni móżdżek doskonałym modelem do badań evo-devo mózgu kręgowców. Komórki składowe EGL, przodkowie ziarnistości móżdżku, stanowią również istotną komórkę pochodzenia rdzeniaka, najczęstszego nowotworu neuronalnego u dzieci. Po amplifikacji tranzytu prekursory granulek migrują promieniście do wewnętrznej warstwy ziarnistej móżdżku, gdzie reprezentują największą populację neuronów w dojrzałym mózgu ssaków. U piskląt szczyt proliferacji EGL przypada na koniec drugiego tygodnia ciąży. Aby ukierunkować modyfikację genetyczną na tę warstwę w szczytowym momencie proliferacji, opracowaliśmy metodę manipulacji genetycznej poprzez elektroporację ex vivo wycinków móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14. Metoda ta podsumowuje kilka ważnych aspektów rozwoju neuronów ziarnistych in vivo i będzie przydatna w generowaniu dokładnego zrozumienia proliferacji i różnicowania komórek ziarnistych móżdżku, a tym samym rozwoju, ewolucji i choroby móżdżku.

Wprowadzenie

Móżdżek znajduje się na przednim końcu tyłomózgowia i jest odpowiedzialny za integrację przetwarzania sensorycznego i motorycznego w dojrzałym mózgu, a także za regulację wyższych procesów poznawczych¹. U ssaków i ptaków ma skomplikowaną morfologię i jest silnie ulistniony, co jest produktem rozległej amplifikacji tranzytowej przodków podczas rozwoju, która wytwarza ponad połowę neuronów w dorosłym mózgu. Móżdżek jest przedmiotem badań neurobiologów od wieków, a w erze molekularnej również otrzymał znaczną uwagę. Odnosi się to nie tylko do jego z natury interesującej biologii, ale także do faktu, że jest silnie związany z chorobami ludzkimi, w tym z genetycznymi zaburzeniami rozwojowymi, takimi jak zaburzenia ze spektrum autyzmu² i przede wszystkim z rakiem móżdżku, rdzeniakiem^{zarodkowym 3}, który jest najbardziej rozpowszechnionym guzem mózgu u dzieci. Co ważne, jest to doskonały system modelowy, w ramach którego można badać alokację losu i neurogenezę podczas rozwoju mózgu⁴. W ostatnich latach został również uznany za system modelowy do badań porównawczych rozwoju mózgu, ze względu na ogromną różnorodność form móżdżku obserwowanych w filogenezie kręgowców^5-10.

Móżdżek rozwija się z grzbietowej połowy rombomeru 1 w tyłomózgowiu¹¹ i rozwojowo składa się z dwóch głównych populacji progenitorów, rombowej wargi i strefy komorowej. Warga rombowa rozciąga się wokół grzbietowej części nabłonka nerwowego tyłomózgowia na granicy z płytą dachową. Jest to miejsce narodzin glutaminergicznego neuronów pobudzających móżdżku^12-14. Strefa komorowa daje początek hamującym neuronom móżdżku GABA-ergicznym, przede wszystkim dużym neuronom Purkinjego^14,15. W późniejszym okresie rozwoju (od około 13,5 dnia embrionalnego u myszy; e6 u piskląt¹⁶), przodkowie glutaminergiczny migrują stycznie z rombowej wargi i tworzą warstwę przodków: drugorzędową strefę progenitorową zwaną zewnętrzną warstwą ziarnistą (EGL). To właśnie ta warstwa ulega rozległemu wzmocnieniu tranzytu, co prowadzi do ogromnej liczby neuronów ziarnistych znajdujących się w dojrzałym mózgu.

Proliferacja w EGL od dawna jest związana z sub-pialnym położeniem, które wynika z migracji stycznej z rombowej wargi¹⁷, z przejściem na wyjście z cyklu komórkowego i różnicowaniem neuronalnym progenitorów związanym z ich wyjściem z zewnętrznej warstwy EGL do środkowej EGL¹⁸. Rozległa migracja styczna postmitotycznych komórek ziarnistych w osi przyśrodkowej i bocznej zachodzi w środkowej i wewnętrznej EGL¹⁹, przed końcową migracją promieniową do wewnętrznej warstwy ziarnistej dojrzałej kory móżdżku. Migracja komórek z rombowej wargi przez powierzchnię móżdżku jest zależna od sygnalizacji CXCL12 z pia^20-22, a komórki ziarniste wyrażają receptor CXCL12 CXCR4. Ich migracja styczna przypomina zatem migrację stycznie migrujących hamujących populacji interneuronów^{kory nowej 23-25}. Co ciekawe, badania pod mikroskopem elektronowym¹⁷ sugerują, że komórki EGL o morfologii proliferacyjnej utrzymują kontakt wzrokowy, łącząc zachowanie komórek ze zdolnością proliferacyjną w sposób przypominający podstawowych przodków kory ssaków²⁶. Znajduje to odzwierciedlenie we wspomnianej wcześniej stratyfikacji EGL na trzy podwarstwy, które są zdefiniowane przez odrębne środowiska zewnątrzkomórkowe i w których prekursory granulek mają wyraźne sygnatury ekspresji genów¹⁸.

Proliferacja komórek progenitorowych w oEGL następuje przy normalnym rozkładzie wielkości klonów, tak że gdy przodkowie są indywidualnie genetycznie znakowani pod koniec rozwoju embrionalnego u myszy, powodują one powstanie średniej 250-500 postmitotycznych neuronów ziarnistych^27,28. Proliferacja jest zależna od mitogennej sygnalizacji SHH z leżących u podstaw neuronów Purkinjego^29-32. Wykazano, że zdolność do reagowania na SHH jest całkowicie zależna od autonomicznej ekspresji czynnika transkrypcyjnego Atoh1 w komórce, zarówno in vitro³³, jak i in vivo^34,35. Podobnie, wykazano, że wyjście z cyklu komórkowego i różnicowanie się zależy od ekspresji czynnika transkrypcyjnego NeuroD1³⁶, który jest prawdopodobnie bezpośrednim represorem Atoh1³⁷.

Pomimo tego postępu i znacznego postępu w rozszyfrowaniu biologicznych podstaw wyjścia z cyklu komórkowego^38-42, podstawowych mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw decyzji o wyjściu z cyklu komórkowego i przejściu od neuronu progenitorowego do różnicującego, oraz związanej z tym postmitotycznej migracji stycznej w wewnętrznym EGL, jak również późniejszej migracji radialnej, pozostają nie w pełni zrozumiałe. Wynika to w dużej mierze z eksperymentalnej nierozwiązywalności EGL: rozwija się on późno i jest trudny do genetycznego ukierunkowania, ponieważ wiele z tych samych cząsteczek neurogennych jest również kluczowych we wcześniejszym okresie życia prekursorów granulek w rombowej wardze. Aby przezwyciężyć ten problem, wielu autorów opracowało elektroporację in vivo i ex vivo jako metodę celowania w móżdżek po urodzeniu u gryzoni^43-48. W tym przypadku jesteśmy pionierami w stosowaniu elektroporacji ex vivo u piskląt do badania EGL, co przynosi znaczne korzyści pod względem kosztów i wygody. Nasza metoda elektroporacji i hodowli ex vivo w warstwach tkanki móżdżku piskląt wykorzystuje tkankę wypreparowaną z embrionalnych piskląt dnia 14 w szczytowym momencie proliferacji EGL. Metoda ta pozwala na genetyczne ukierunkowanie EGL niezależnie od rombowej wargi i przygotuje grunt pod genetyczną analizę przejścia od progenitora ziarnistości do postmitotycznego neuronu ziarnistego w móżdżku.

Protokół

Uwaga: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi King's College London, UK i brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Rozwarstwienie móżdżku e14

1. Inkubować brązowe zapłodnione jaja kurze w temperaturze 38 °C do 14. dnia zarodka.
2. Za pomocą nożyczek do jaj odetnij głowę zarodkowi pisklęcia in ovo i przenieś głowę na szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS (ryc. 1A).
3. Za pomocą standardowych kleszczy wykonaj nacięcia za każdym okiem na całej długości tkanki, usuwając oczy i górną szczękę. Wykonaj drugie nacięcie przez gardło, usuwając dolną szczękę (ryc. 1B).
4. Za pomocą standardowych kleszczy usuń całą skórę z powierzchni czaszki, odrywając ją (ryc. 1C) i usuń kości czołowe i ciemieniowe, odsłaniając mózg.
5. Od strony brzusznej usuń chrząstkę gardłową i mezenchymę pomocniczą.
6. Od strony grzbietowej ostrożnie usuń mezenchymę grzbietową do tyłomózgowia, uważając, aby nie uszkodzić pia, i oddziel cały mózg (ryc. 1D).
7. Wykonaj nacięcie przez całą długość tkanki między śródmózgowiem a tyłomózgowiem i oddziel tyłomózgowie, w tym móżdżek (ryc. 1E).
8. Wykonując nacięcia na całej długości tkanki w obu bocznych połączeniach móżdżku i płytki grzbietowej tyłomózgowia, usuń cały móżdżek, dbając o zachowanie integralności pia podczas sekcji (ryc. 1F). Usuń tworzący się splot naczyniówkowy (ryc. 1G).
9. Przenieś wypreparowany móżdżek do lodowatego HBSS.

2. Kultura Slice e14 Móżdżek

1. Przenieś cały móżdżek na sterylną platformę rozdrabniacza tkanek za pomocą szpatułki lub pipety Pasteura o pojemności 3 ml z odciętą końcówką w celu poszerzenia otworu. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety.
2. Wytnij cały móżdżek w wymaganej orientacji o grubości 300 μm za pomocą zestawu rozdrabniacza tkanek z prędkością cięcia 50% maksimum. Integralność tkanek jest najłatwiej zachowana w przekroju strzałkowym; jednak orientacja jest również ważnym czynnikiem w analizie komórek (dendryty komórek Purkinjego są wyrównane strzałkowo, podczas gdy aksony komórek ziarnistych biegną poprzecznie, prostopadle do płaszczyzny dendrytów komórek Purkinjego).
3. Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml przykryj pokrojony móżdżek lodowatym HBSS.
4. Przenieść plastry z HBSS na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą lodowato świeży HBSS za pomocą 3 ml pipety Pasteura z odciętą końcówką.
5. Pod mikroskopem preparacyjnym oświetlonym światłowodowym źródłem światła należy zapewnić oddzielenie poszczególnych plastrów za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich. Zidentyfikuj plastry do elektroporacji na podstawie ich integralności tkankowej i pozycji przyśrodkowo-bocznej.
   Uwaga: Każda sekcja od zarodka do inkubacji w plastrze trwa około 10-20 minut, w zależności od doświadczenia. Wykonuj sekcje pojedynczo, aby upewnić się, że móżdżek spędza minimalną ilość czasu między dekapitacją a posiewem ex vivo.

3. Elektroporacja plastrów

1. Zbuduj komorę elektroporacyjną, mocując anodę elektroporatora do podstawy szalki Petriego o średnicy 60 mm za pomocą taśmy izolacyjnej. Dodać około 1 ml HBSS w celu przykrycia elektrody.
2. Umieść wkładkę hodowlaną 0,4 μm na elektrodzie pokrytej HBSS. Pozwól, aby wkładka hodowlana spoczywała na elektrodzie, upewniając się, że zawsze jest kontakt między wkładką a elektrodą.
   Uwaga: W tej konfiguracji wkładka hodowlana z plastrami będzie spoczywać na powierzchni roztworu, utrzymując obwód, ale umożliwiając przestrzenne ukierunkowanie katody.
3. Przenieść zidentyfikowane wycinki (do pięciu na wkładkę hodowlaną) do wkładki hodowlanej za pomocą 3 ml pipety Pasteura z odciętą końcówką. Oddzielić i pozostawić do osadzenia się na wkładce hodowlanej w orientacji strzałkowej.
4. Za pomocą pipety usuń nadmiar HBSS, aby plastry nie były już skąpane w roztworze.
5. Używając końcówki do pipety P10, odpipetuj DNA (w stężeniu 1 μg/μl) rozcieńcz 20% szybką zielenią na powierzchni docelowego obszaru plasterka. 20% fast green zapewnia lepki roztwór DNA i zapobiega zbyt szerokiemu rozproszeniu DNA. Do każdej warstwy dodać około 5 μl DNA/szybko zielonego roztworu (ryc. 2B).
6. Umieść katodę na żądanej tkance docelowej i poddaj elektroporację impulsom 3 x 10 V, o czasie trwania 10 ms. Unikaj bezpośredniego kontaktu katody z tkanką. Zamiast tego wykorzystaj napięcie powierzchniowe cieczy, aby utrzymać przewodność (umieść katodę jak najbliżej tkanki, nie dotykając jej).
7. W razie potrzeby powtórz dostarczanie DNA i elektroporację do wielu regionów EGL na każdym pojedynczym wycinku móżdżku.
8. Po zakończeniu elektroporacji przenieść kulturę bakterii na szalkę Petriego o średnicy 30 mm.
9. Do każdej kultury dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (Basal Medium Eagle, 0,5% (w/v) D-(+)-glukozy, 1% suplementu B27, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) pod wkładką hodowlaną tak, aby wkładka hodowlana stykała się z podłożem, ale plastry nie były w niej kąpane.
10. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C/6% CO₂ przez okres do 3 dni. Wymieniaj całą pożywkę hodowlaną co 24 godziny na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę.
11. Po przeprowadzeniu hodowli utrwalić plastry na wkładkach hodowlanych na 1 godzinę w 4% paraformaldehydzie (lub O/N w temperaturze 4 °C) w świeżym naczyniu o średnicy 30 mm bez pożywki hodowlanej.

4. Obrazowanie wycinków móżdżku

1. Po utrwaleniu umyj plastry 3 razy przez 5 minut w PBS.
2. Za pomocą żyletki wypreparuj każdy elektroporowany i wyhodowany plasterek móżdżku z wkładki hodowlanej, przecinając wokół wycinka i usuwając plasterek oraz obszar wkładki, do którego jest przyklejony. Nie próbuj usuwać plastra z powierzchni wkładki hodowlanej.
3. Umieścić plastry w około 1 ml podłoża mocującego zawierającego DAPI (w razie potrzeby) pod szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków, i zobrazować za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.
   Uwaga: Parametry obrazowania mogą być zmieniane w zależności od elektroporowanych konstrukcji i według uznania indywidualnego użytkownika.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać przy użyciu elektroporacji skrawków i hodowli móżdżku zarodka kurczaka z 14. dnia inkubacji. Disekcję móżdżku zilustrowano na Rysunku 1, a konfigurację komory do elektroporacji pokazano na Rysunku 2. Wykazujemy, że możliwe jest przeprowadzenie elektroporacji i pomyślna hodowla skrawków móżdżku, które zachowują swoją strukturę i morfologię komórkową in vitro (Rysunek 3A

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę preparowania, elektroporowania i hodowli wycinków embrionalnego móżdżku dnia 14 od pisklęcia. Protokół ten umożliwia ukierunkowanie elektroporacji na małe ogniskowe obszary EGL, w tym izolowane celowanie w poszczególne płaty móżdżku. Umożliwia analizę genetyczną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i wygodzie oraz przy niskich kosztach w porównaniu z ustalonymi technikami u gryzoni^43-47. Taka analiza nie jest obecnie możliwa in vivo ze względu na wydłużon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rozdrabniacz tkanek McIlwain	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cięcie przy 300 μ m dla najlepszych wyników.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamina	Sigma	G7513
penicylina/streptomycyna	Sigma	P4333
0,4 μ m Wkładka hodowlana	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Elektroporator Ovodyne	Intracel	01-916-02	Do elektroporacji należy użyć 3 impulsów 10 V, 10 ms.