Method Article

Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5

DOI:

10.3791/53426

⸱

November 13th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj protokół generowania iCM za pomocą retrowirusowego dostarczania Gata4, Tbx5 i Mef2c w konstrukcji policistronicznej. Protokół ten daje stosunkowo jednorodną populację przeprogramowanych komórek o zwiększonej wydajności i jakości, co jest cenne dla przyszłych badań nad przeprogramowaniem iCM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednia konwersja fibroblastów serca (CF) w indukowane kardiomiocyty (iCMs) ma ogromny potencjał dla medycyny regeneracyjnej, oferując alternatywne strategie leczenia chorób serca. Konwersja ta została osiągnięta przez wymuszoną ekspresję zdefiniowanych czynników, takich jak Gata4 (G), Mef2c (M) i Tbx5 (T). Tradycyjnie, iCM są generowane przez koktajl wirusów wyrażających te poszczególne czynniki. Jednak skuteczność przeprogramowania jest stosunkowo niska, a większość fibroblastów transdukowanych in vitro G,M i T nie ulega pełnemu przeprogramowaniu, co utrudnia badanie mechanizmów przeprogramowywania. Niedawno wykazaliśmy, że stechiometria G,M,T ma kluczowe znaczenie dla skutecznego przeprogramowania iCM. Optymalna stechiometria G,M,T ze względnie wysokim poziomem M i niskimi poziomami G i T osiągnięta dzięki zastosowaniu naszego policistronicznego wektora MGT (zwanego dalej MGT) znacznie zwiększyła wydajność przeprogramowania i poprawiła jakość iCM in vitro. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis metodologii zastosowanej do generowania iCM za pomocą konstruktu MGT z fibroblastów serca. Izolacja fibroblastów serca, generowanie wirusa do przeprogramowania i ocena procesu przeprogramowania są również uwzględnione, aby zapewnić platformę do wydajnego i powtarzalnego generowania iCM.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie, odpowiadając za 17,3 miliona zgonówrocznie1. Utrata kardiomiocytów wynikająca z zawału mięśnia sercowego (MI) lub postępującej niewydolności serca jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności2. Ze względu na ograniczoną zdolność regeneracyjną, serca dorosłych ssaków zwykle cierpią z powodu upośledzenia funkcji pompy i niewydolności serca po urazie3-6. W związku z tym skuteczna (re)generacja kardiomiocytów in vivo i in vitro w celu leczenia chorób serca i modelowania chorób jest krytyczną kwestią, którą należy się zająć.

Niedawny rozwój bezpośredniego przeprogramowania, które bezpośrednio przeprogramowuje komórki z jednego zróżnicowanego fenotypu na inny, bez przechodzenia przez stan pluripotencjalny, oferuje obiecujące alternatywne podejście dla medycyny regeneracyjnej. Serce ssaków zawiera obfite fibroblasty serca (CF), które stanowią około połowy komórek w sercu i masowo namnażają się po urazie7-9. W związku z tym ogromna pula CF może służyć jako endogenne źródło nowych CM do terapii regeneracyjnej, jeśli można je bezpośrednio przeprogramować na funkcjonalne CM. Wykazano, że kombinacja czynników transkrypcyjnych, takich jak Gata4 (G), Mef2c (M) i Tbx5 (T), z mikroRNA lub małymi cząsteczkami lub bez nich, może przeprogramować fibroblasty w iCM10-26. Co ważne, konwersja ta może być również indukowana in vivo i skutkuje poprawą funkcji serca oraz zmniejszeniem rozmiaru blizny w zawale serca16,27-29. Badania te wskazują, że bezpośrednie przeprogramowanie serca może być potencjalną drogą do wyleczenia uszkodzonego serca. Jednak niska skuteczność przeprogramowania iCM stała się główną przeszkodą dla dalszych badań mechanistycznych. Ponadto powtarzalność przeprogramowania serca jest kolejną kontrowersyjną kwestią związaną z tą technologią11,30,31.

Całkiem niedawno, wygenerowaliśmy kompletny zestaw policistronicznych konstruktów kodujących G,M,T we wszystkich możliwych porządkach splicingu z identycznymi sekwencjami 2A w pojedynczym mRNA. Te policistroniczne konstrukty dały różne poziomy ekspresji białek G, M i T, co doprowadziło do znacząco różnej wydajności przeprogramowania25. Najbardziej wydajny konstrukt, nazwany MGT, który wykazał stosunkowo wysoką ekspresję Mef2c i niską ekspresję Gata4 i Tbx5, znacznie poprawił wydajność przeprogramowania i wytworzył duże ilości iCM z ekspresją markerów CM, silnymi oscylacjami wapnia i spontanicznym dudnieniem25. Co więcej, dzięki zastosowaniu konstruktu policistronicznego MGT, w naszym badaniu uniknęliśmy użycia wielu wektorów i wygenerowaliśmy komórki o jednorodnym stosunku ekspresji G,M,T, zapewniając w ten sposób ulepszoną platformę do badań nad przeprogramowaniem serca. Aby zwiększyć odtwarzalność eksperymentalną, tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować fibroblasty, wyprodukować kasetę MGT przenoszącą retrowirusa, wygenerować iCM i ocenić skuteczność przeprogramowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół wykorzystuje noworodki myszy. Opieka nad zwierzętami i eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Wydział Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych (DLAM) na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill.

1. Przygotowanie i pożywek

  1. Przygotuj pożywkę z fibroblastami (FB): Uzupełnij 500 ml pożywki IMDM ze 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 6 ml penicyliny/streptomycyny.
  2. Przygotuj pożywkę iCM: Uzupełnij 400 ml pożywki DMEM 100 ml pożywki M199 i 50 ml FBS.
  3. Przygotuj pożywkę B27: Uzupełnij 490 ml pożywki RPMI1640 10 ml pożywki B27.
  4. Przygotować pożywkę Plat-E: Uzupełnić 500 ml pożywki DMEM o 50 ml FBS, 5 ml penicyliny/streptomycyny i 5 ml aminokwasów endogennych.
  5. Przygotuj pożywkę do transfekcji Plat-E: Uzupełnij 500 ml pożywki DMEM o 50 ml FBS i 5 ml aminokwasów endogennych.
  6. Przygotować 24-dołkową płytkę pokrytą żelatyną: Dodać 0,5 ml 0,1% roztworu żelatyny do dołka z 24-dołkową płytką, inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut i odessać bezpośrednio przed użyciem.
  7. Przygotować bufor do znakowania FACS: Uzupełnij 500 ml DPBS 10 ml FBS i 2 ml EDTA (0,5 M), aby osiągnąć końcowe stężenie 2 mM. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotować bufor sortujący MACS: Uzupełnić 500 ml DPBS o 2,5 g BSA i 2 ml EDTA (0,5 M), aby osiągnąć końcowe stężenie 2 mM. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotuj 2x bufor HBS do transfekcji: uzupełnij 500 ml buforu HEPES (50 mM) z 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na2HPO4 (0,10647 g), 12 mM glukozy (1,08096 g). Dodać około 650 μl 10 N NaOH, aby dostosować pH do 7,05-7,12. Przefiltrować przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  10. Przygotować 2,5 M roztwór CaCl2 do transfekcji: Dodać 18,376 g CaCl2 do 50 ml ddH2O. Przefiltrować przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  11. Przygotować bufor wiążący ICC (immunocytochemia): Dodać 5 ml paraformaldehydu (PFA, 32%) do 35 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 4%.
  12. Przygotować bufor do permeabilizacji ICC: Dodać 0,1 ml Triton do 100 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,1%.
  13. Przygotować bufor blokujący ICC: Dodać 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 100 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 5%.
  14. Przygotować bufor barwiący ICC: Dodać 1 g BSA do 100 ml DPBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 1%.

2. Generacja fibroblastów serca u noworodków myszy

  1. Generowanie fibroblastów serca metodą hodowli eksplantatów
    1. Oczyść noworodkową transgeniczną mysz αMHC-GFP (P1 do P2) 75% etanolem. Odetnij głowę sterylnymi nożyczkami. Następnie wykonaj poziome nacięcie od jednej pachy do drugiej. Użyj sterylnych, i zgiętych kleszczy, aby wyciąć serce i umieścić je w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej lodowaty bufor PBS.
      1. Alternatywnie wyciśnij serce po poziomym nacięciu.
    2. Sprawdź ekspresję GFP w sercu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Ponieważ ekspresja GFP jest napędzana przez promotor αMHC, który jest promotorem specyficznym dla serca, serce transgenicznej myszy powinno być w kolorze zielonym15, podczas gdy ujemne serce jest przyciemnione w dowolnej fluorescencji.
    3. Weź 3-4 serca z dodatnim wynikiem GFP do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm i zmiel je na małe kawałki o wielkości mniejszej niż 1 mm3 za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
    4. Umieść 3-4 mielone serca w jednym 10 cm naczyniu z 2 ml pożywki FB. Pozwól tkankom osiąść na 3 godziny.
    5. Powoli dodawaj 8 ml podgrzanej pożywki FB do naczyń zawierających tkanki serca. Nie naruszaj tkanek przez trzy dni.
    6. Wymieniaj nośnik co trzy dni.
    7. W dniu 7 odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki DPBS. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny do każdej płytki i trawić w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    8. Dodaj 5 ml pożywki FB, aby ugasić trypsynę. Delikatnie odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Pipetować pożywkę w górę i w dół, aby jeszcze bardziej mechanicznie zdysocjować tkankę.
    9. Zebrać komórki i przefiltrować przez sitka do komórek 40 μm, aby uniknąć zanieczyszczenia fragmentów tkanki serca, a następnie osadzać komórki, wirując z prędkością 200 x g przez 5 minut.
    10. Umyj komórki raz buforem MACS, a komórki są gotowe do sortowania.
  2. Generowanie fibroblastów serca metodą trawienia enzymatycznego
    1. Zbierz serca z dodatnim wynikiem GFP jako 2.1.1. Przełóż wszystkie serca do 10 cm naczynia z 10 ml lodowatego DPBS.
    2. Ściśnij komory sterylnymi kleszczami, aby usunąć krew i spłucz raz lodowatym DPBS.
    3. Przytnij serca, aby były wolne od innych tkanek i tłuszczu.
    4. Pokrój każde serce na około 4 części, które są nadal luźno połączone.
    5. Jeśli jest mniej niż 20 serc, przenieść serca do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 8 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
      1. Jeśli jest 20-30 serc, przenieś serca do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 10 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    6. Wyrzuć trypsynę i dodaj 5 ml (dla mniej niż 20 serc) lub 10 ml (dla 20-30 serc) ciepłej kolagenazy typu II (0,5 mg/ml) w HBSS.
    7. Wiruj rurkę na wirowniku przez 1 minutę z prędkością około 4 do 6 (jeśli płyn nie dostanie się do pokrywki, prędkość jest w porządku).
    8. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
    9. Obracaj rurkę przez 1 minutę.
    10. Osad przez 1 minutę grawitacyjnie, aż kawałki tkanki osiądą, zebrać płyn do nowej probówki zawierającej 5 ml zimnego podłoża FB.
    11. Powtórz kroki 2.2.6-2.2.10 3-5 razy.
    12. Połącz wszystkie kolekcje, filtrując przez sitko o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
    13. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    14. Zawiesić komórki w 10 ml buforze MACS i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    15. Opcjonalnie: Jeśli jest dużo krwinek, ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml buforu do lizy RBC (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA), trzymać na lodzie przez 1 minutę, następnie rozcieńczyć 10 ml buforu MACS i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Przemyć jeszcze raz buforem MACS.
  3. Izolacja fibroblastów Thy1.2+ za pomocą MACS (sortowanie komórek aktywowane magnetycznie)
    1. Określ liczbę żywotnych komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
      1. Pobrać 10 μl komórek z 10 ml zawiesiny komórek w kroku 2.2.14. Wymieszać z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
      2. Dodaj mieszaninę do hemocytometru. Odstawić na 3-5 minut, a następnie natychmiast zbadać pod mikroskopem. Martwe komórki są barwione na niebiesko, a żywe komórki są niebarwione.
      3. Policz wszystkie żywotne komórki w czterech kwadratach narożnych hemocytometru o średnicy 1 mm. Określ liczbę żywotnych komórek: średnia liczba na kwadrat x 2 (współczynnik rozcieńczenia) x 104 x 10 (całkowita objętość zawiesiny komórek).
    2. W przypadku komórek mniejszych niż 1 x 107 należy ponownie zawiesić komórki z 10 μl mikrogranulek Thy1,2 w schłodzonym buforze MACS o pojemności 90 μl. Dodaj proporcjonalnie więcej koralików, jeśli jest więcej niż 1 x 107 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować w lodówce (2-8 °C) przez 30 minut.
    3. Dodać 10 ml buforu MACS i wirować próbki o sile 200 x g przez 5 minut; przemyć 10 ml buforu MACS i ponownie odwirować.
    4. Doprowadzić objętość do 2 ml w buforze MACS.
    5. Skonfiguruj separator MACS w okapie. Wstaw kolumnę LS do separatora. Nałóż 3 ml buforu MACS na kolumnę, aby ją zrównoważyć.
    6. Przepuścić zawiesinę komórek przez zrównoważoną kolumnę LS.
    7. Przemyć 3 razy 2 ml buforu MACS za każdym razem.
    8. Zdjąć kolumnę LS z separatora i wymyć 3 razy za pomocą 2 ml buforu MACS do nowej probówki o pojemności 50 ml.
    9. Wirować z prędkością 200 x g przez 5 min.
    10. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki FB, policzyć komórki i nasiona na płytkach o odpowiedniej gęstości. W przypadku fibroblastów generowanych metodą hodowli eksplantatów gęstość komórek wysiewu może wynosić około 2-3 x 104 komórek / dołek na płytce 24-dołkowej. W przypadku fibroblastów generowanych metodą trawienia enzymatycznego gęstość komórek może wynosić około 4-5 x 104 komórek / dołek na płytce 24-dołkowej.

3. Generacja retrowirusa do przeprogramowania iCM

Uwaga: Wykonaj następujące kroki w Szafie Bezpieczeństwa Biologicznego BSL2 w sterylnych warunkach. Zaleca się właściwą utylizację transfekowanych komórek, końcówek pipet i probówek, aby uniknąć ryzyka zagrożeń dla środowiska i zdrowia.

  1. Utrzymuj komórki Plat-E w pożywce Plat-E uzupełnionej 1 μg/ml puromycyny i 10 μg/ml blasticydyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. W dniu 2 należy zastąpić pożywkę pożywką Plat-E pozbawioną puromycyny i blasticydyny.
  3. W dniu 0 podziel komórki Plat-E na 10 cm szalki dzień przed transfekcją w ilości około 4-5 x 106 komórek na płytkę. Komórki powinny być zlewające się w ~80-90% w dniu transfekcji.
  4. W pierwszym dniu zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę do transfekcji na komórkach w ciągu 1 godziny przed transfekcją. Procedura transfekcji jest następująca:
    1. Transfekcja przy użyciu zestawów komercyjnych
      1. Zmieszać 20 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofektaminy) i 500 μl zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM). Dodać 10 μg plazmidu retrowirusowego do kolejnych 500 μl zredukowanej pożywki w surowicy. Inkubować każdą mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
      2. Powoli dodawać mieszaninę plazmidu do mieszaniny transfekcyjnej. Ten krok może zająć 15-30 sekund. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej (roztwór może wydawać się mętny).
      3. Dodaj mieszaninę kroplami do komórek.
      4. Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Transfekcja przy użyciu fosforanu wapnia.
      1. Zmieszać 40 μl 2,5 M CaCl2 i 440 μl ddH2O, a następnie dodać 20 μg plazmidu retrowirusowego (dostosować ilość ddH2O tak, aby całkowita objętość wynosiła 500 μl).
      2. Dodaj 500 μl 2x HBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      3. Odwiruj HBS i w międzyczasie dodaj mieszaninę wapnia-DNA do HBS kroplami. Ten krok trwa około 30 sekund dla każdej próbki. Więc maksymalnie wykonaj 3-4 próbki jednocześnie.
      4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty Inkubacja przez dłuższy czas prowadzi do większego osadu i mniej komórek wchłonie osad.
      5. Dodaj mieszaninę kroplami do komórek i obserwuj pod mikroskopem 20X. Powinny być widoczne drobne osady (wiele małych jest dobrych, ale kilka dużych nie jest dobrych).
      6. Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  5. W dniu 2 zmień pożywkę na komórkach z 8 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Inkubować przez 24 godziny.
  6. W dniu 3 i 4 należy pobrać supernatant z naczyń za pomocą sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml, przefiltrować go przez filtr z octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 2 ml roztworu do wytrącania retrowirusa na każde 8 ml supernatantu zawierającego wirusa. Delikatnie wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. W 5 dniu wirować mieszaninę wirusową w temperaturze 1 500 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Cząsteczki wirusa powinny pojawić się w postaci białego osadu na dnie probówki.
  8. Odrzucić supernatant. Odwirować pozostały roztwór przez odwirowanie z stężeniem 1 500 × g przez 5 minut. Usunąć wszelkie ślady płynu przez aspirację, bardzo uważając, aby nie naruszyć wytrąconych cząstek retrowirusowych w granulkach.
  9. Zawiesić osady retrowirusowe ze 100 μl buforu DPBS na każde 8 ml supernatantu wirusowego. Porcjować wirusa na lodzie. Zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Przeprogramowanie fibroblastów serca

  1. Dodać 4 μl roztworu polibrenu o stężeniu 10 mg/ml do 10 ml pożywki iCM i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Końcowe stężenie polibrenu wynosi 4 μg/ml.
  2. Dodać 500 μl pożywki iCM zawierającej polibren do każdej studzienki z 24-dołkową płytką wysianą fibroblastami.
  3. Dodać 10 μl retrowirusa do każdej studzienki zawierającej 2-3 x 104 komórek z hodowli eksplantatów lub 4-5 x 104 komórek z metody trawienia enzymatycznego. Ilość wirusa powinna być proporcjonalnie zwiększana wraz ze wzrostem liczby komórek w różnych płytkach hodowlanych lub szalkach. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24-48 godzin, aby umożliwić infekcję wirusową. Oś czasu przeprogramowania serca pokazano na rysunku 1.
  4. Po transdukcji wirusa zastąp pożywkę zawierającą wirusa zwykłą pożywką iCM o pojemności 500 μl.
  5. Zmieniaj nośniki co 2-3 dni. W celu pozytywnej selekcji komórek transdukowanych wirusem należy dodać do komórek docelowych pożywkę iCM uzupełnioną puromycyną w stężeniu 2 μg/ml. Trzymaj go przez trzy dni. Następnie utrzymuj puromycynę w pożywce iCM w stężeniu 1 μg/ml.
  6. Trzy dni po zakażeniu wirusowym wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym (20X), aby obserwować ekspresję GFP.
    Uwaga: Dziesięć dni po infekcji wirusowej komórki można pobrać do analizy FACS i analizy ICC w celu określenia wydajności przeprogramowania (w kroku 5 i 6).
  7. Czternaście dni po infekcji wirusowej zastąp pożywkę iCM pożywką B27. Zmieniaj nośniki co trzy dni. Spontaniczne bicie loci komórek może pojawić się po trzech (komórki z metody trawienia enzymatycznego) lub czterech (komórki z metody hodowli eksplantacyjnej) tygodni po transdukcji wirusa.

5. Immunocytochemiczna analiza skuteczności przeprogramowania

  1. Przepłucz komórki lodowatym PBS trzy razy; usuń nadmiar roztworu.
  2. Dodać 0,5 ml buforu utrwalającego ICC do każdego dołka z 24 płytkimi dołkowymi. Ustaw komórki w RT na 15-20 min.
  3. Przepłukać komórki trzykrotnie PBS.
  4. Dodać 0,5 ml buforu do permeabilizacji ICC do każdej studzienki z 24 płytek dołkowych. Przepuszczalność komórek w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  5. Przepłukać komórki trzykrotnie PBS.
  6. Dodać 0,5 ml buforu blokującego ICC do każdej studzienki na płytce 24-dołkowej, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  7. Rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe buforem barwiącym ICC. Dodać 200 μl roztworów przeciwciał do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Współczynniki rozcieńczania przeciwciał są wymienione w Materiałach.
  8. Następnego dnia trzykrotnie przemyj komórki PBS.
  9. Dodać 200 μl roztworów przeciwciał drugorzędowych do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  10. Umyj komórki PBS trzy razy.
  11. Do każdej studzienki dodać 150 μl roztworu montażowego zawierającego DAPI. Pozostawić do zabarwienia jąder na 1 minutę. Następnie przykryj każdą studzienkę okrągłym szklanym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij szkiełko do dolnej powierzchni za pomocą kleszczyków, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  12. Odessać nadmiar roztworu, a próbki są gotowe do obrazowania. Reprezentatywne obrazy przedstawiające przeprogramowane komórki, które wyrażają marker sercowy cTnT i αaktyninę w d14, pokazano na rysunku 2B.

6. Analiza FACS efektywności przeprogramowania

  1. Dokładnie umyj komórki raz za pomocą DPBS. Dodać 0,3 ml trypsyny (0,05%) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  2. Delikatnie postukaj w płytkę, aby ułatwić podnoszenie komórek. Sprawdź odłączenie komórki pod mikroskopem. Dodaj 1 ml buforu FACS do każdej studzienki, gdy większość komórek jest zdysocjowana. Pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej mechanicznie zdysocjować komórki.
  3. Przenieść komórki z płytki 24-dołkowej do płytki z 96 dołkami do studni. Wirować w czasie 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby zebrać komórki.
  4. Umyj komórki raz buforem FACS.
  5. Dodać 100 μl roztworów utrwalających/przepuszczalnych, aby ponownie zawiesić komórki na 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Umyj komórki dwukrotnie 1x roztworem myjącym, granulką i usuń supernatant.
  7. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciał przeciwko GFP i cTnT w 1x buforze do płukania. Dokładnie zawiesić każdą próbkę z 50 μl roztworu przeciwciał i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  8. Umyj komórki raz w 1x roztworze myjącym, granulce i usuń supernatant.
  9. Do każdej próbki dodać 50 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego zawierającego sprzężoną anty-króliczą IgG osła Alexa Fluor 488 i sprzężoną anty-mysią IgG osła Alexa Fluor 647. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
  10. Umyj komórki raz w 1x roztworze myjącym, granulce i usuń supernatant.
  11. Zawieś komórki w buforze utrwalającym 400 μl (DPBS z 1% PFA). Przenieś komórkę do probówki FACS z nasadką sitka do komórek. Próbki są gotowe do wykrycia FACS. Reprezentatywna analiza FACS wydajności przeprogramowania przy użyciu konstruktu pMxs-puromycyna-MGT z selekcją puromycyny lub bez niej pokazano na rysunku 2A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki przeprogramowania są podsumowane schematem na rysunku 1. Po transdukcji MGT ekspresję GFP w przeprogramowanych komórkach można było wykryć już w 3 dniu. Selekcja transdukowanych komórek metodą puromycyny rozpoczyna się od 3 dnia i utrzymuje się przez pierwsze dwa tygodnie, jeśli stosuje się konstrukt pMx-puro-MGT. Od 10 do 14 dnia ekspresja markerów sercowych, takich jak cTnT i αAktynina, może być wykryta zarówno przez ICC (Figura 2B, krok 5), jak i FACS (Figura 2A...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby pomyślnie generować iCM podczas korzystania z tego protokołu, istnieje kilka ważnych czynników, które mają wpływ na ogólną wydajność. W szczególności warunki uruchamiania fibroblastów i jakość kodowania retrowirusa MGT mogą mieć duży wpływ na wydajność przeprogramowywania.

Ważne jest, aby wytwarzać fibroblasty tak świeże i zdrowe, jak to tylko możliwe. W przypadku metody hodowli eksplantatów fibroblasty można użyć przed upływem siedmiu dni po posianiu eksplantatów na szalkach. Do metody tr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za fachową pomoc techniczną ze strony UNC Flow Cytometry Core i UNC Microscopy Core. Dziękujemy członkom laboratorium Qian i laboratorium Liu za pomocne dyskusje i krytyczne recenzje manuskryptu. Badanie to było wspierane przez grant NIH / NHLBI R00 HL109079 dla dr Liu i American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 oraz Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 dla dr Qian.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
troponina przeciwsercowa TThermo ScientificMS-295-PO1:200 dla FACS i 1:400 dla ICC
anty-GFPLife TechnologiesA111221:500 zarówno dla FACS, jak i ICC
anty-aActininSigma-AldrichA78111:500 zarówno dla FACS, jak i ICC
anty-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 dla  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 dla ICC 
anty-GATA4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 dla ICC
anty-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 dla ICC
Alexa Fluor 488– sprzężony osł anty-królik IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 zarówno dla FACS, jak i ICC
Alexa Fluor 647– sprzężony osł anty-mysie IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 zarówno dla FACS, jak i ICC
Zestaw Cytofix/Cytoperm do barwienia wewnątrzkomórkowegoBD Biosciences554722
Zestaw do obrazowania wapnia Rhod-3TechnologiesR10145
Mikrogranulki Thy1.2Miltenyi Biotec130-049-101
Roztwór Vectashield z DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0,05%)Corning25-052
PRMI1640 średniLife Technologies11875-093
B27 suplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Zredukowana surowica MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, wysoki poziom glukozyLife Technologies10-013
Penicylina-streptomycynaCorning30-002
Aminokwasy endogenneLife Technologies11130-050
Lipofektamina 2000Life Technologies11668500
blasticydynaLife TechnologiesA11139-03
puromycynaLife TechnologiesA11138-03
Kolagenaza IIWorthingtonLS004176
polibrenMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl< sub>2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlukozaSigma-AldrichG6152
Albumina surowicy bydlęcejFisher9048-46-8
paraformaldehydEMS15714
Roztwór do wytrącania retrowirusówALSTEMVC-200
0,4% roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154
żelatynaSigma-AldrichG1393
PBS firmy Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Zrównoważony roztwór soli)Kolumna Corning21022
LSMiltenyi Biotec130-042-401
0,45 μ Filtr z octanu celulozy Thermo Scientific190-2545
Płytki 24-dołkoweCorning3524
10 cm Naczynia do hodowli tkankowych centralnych Thermo Scientific
60 mm   Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polipropylenowa płytka głębinowaDenville ScientificP9639
Polistyrenowe probówki okrągłodenne z nasadką sitkową 352235BD Biosciences
Eppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL System automatycznego obrazowania komórekTechnologie życiaAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Separator MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Szkiełko nakrywkowe okrągłeMikroskopia elektronowa Nauki72195-15
Life Naczynie do hodowli studzienek 172958 Wirówka do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced CardiomyocytesCardiac FibroblastsPolycistronic ConstructGata4 Mef2c Tbx5Retroviral ReprogrammingCell IsolationFlow Cytometry AnalysisImmunochemistry DetectionPurmycin SelectionGFP Expression

Related Articles