Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli

Podsumowanie

Opisana jest dwuetapowa metoda chromatograficzna oczyszczania rekombinowanego białka Shadoo wyrażonego jako ciała inkluzyjne w Escherichia coli, a także protokół migotania oczyszczonego Shadoo do struktur amyloidowych.

Streszczenie

System ekspresji Escherichia coli jest potężnym narzędziem do produkcji rekombinowanych białek eukariotycznych. Używamy go do produkcji Shadoo, białka należącego do rodziny prionów. Opisano chromatograficzną metodę oczyszczania rekombinowanego Shadoo znakowanego (Jego)₆ wyrażonego jako ciała inkluzyjne. Ciała inkluzyjne rozpuszcza się w 8 M moczniku i wiąże z kolumną naładowaną Ni²⁺ w celu przeprowadzenia chromatografii powinowactwa jonowego. Związane białka są eluowane przez gradient imidazolu. Frakcje zawierające białko Shadoo poddawane są chromatografii wykluczania wielkości w celu uzyskania wysoko oczyszczonego białka. W ostatnim etapie oczyszczony Shadoo jest odsalany w celu usunięcia soli, mocznika i imidazolu. Rekombinowane białko Shadoo jest ważnym odczynnikiem do badań biofizycznych i biochemicznych zaburzeń konformacji białek występujących w chorobach prionowych. Wiele doniesień wykazało, że prionowe choroby neurodegeneracyjne powstają w wyniku odkładania się stabilnych, uporządkowanych włókienek amyloidowych. Przedstawiono przykładowe protokoły opisujące sposób migotania Shadoo na fibryle amyloidowe przy pH kwaśnym i obojętnym/zasadowym. Metody produkcji i fibrylacji Shadoo mogą ułatwić badania w laboratoriach zajmujących się chorobami prionowymi, ponieważ pozwalają na produkcję dużych ilości białka w szybki i tani sposób.

Wprowadzenie

Choroby neurodegeneracyjne prionów, do których zalicza się gąbczastą encefalopatię bydła u bydła, trzęsawkę owiec i chorobę Creutzfeldta-Jakoba u ludzi, są śmiertelne i nieuleczalne. Choroby prionowe charakteryzują się zmianami konformacyjnymi komórkowego białka prionowego składającego się głównie z α-helis, w konformer amyloidowy wzbogacony β krzyżowo ^1,2. Struktury krzyżowe β zawierają gęsto upakowane i wysoce uporządkowane warstwy β przypominające kryształy, stabilizowane wiązaniami wodorowymi ^3,4. Amyloidy prionowe mogą się samoreplikować dzięki β-niciom na krawędzi wzrostu, które stanowią matrycę do rekrutacji i przekształcania monomerycznej....

Protokół

1. Generowanie plazmidu i ekspresja Shadoo

Uwaga: Gen kodujący mysie białko Shadoo (Shadoo^25-122) został podklonowany do wektora ekspresyjnego pET-28 ¹¹. Klon ten wprowadzono do szczepu bakteryjnego E. coli SoluBL21 w celu ekspresji białka Shadoo z N-końcowym tagiem heksahistydynowym (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), zgodnie z wcześniejszym opisem ¹¹. Plazmid można zamówić od autorów. Masa cząsteczkowa Shadoo obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej wynosi 12 243,2 Da.

Uwaga: Ws....

Wyniki

Z jednego litra hodowli bakteryjnej uzyskuje się około 5-10 mg oczyszczonego białka Shadoo. Aby otrzymać rekombinowane Shadoo o wysokiej czystości, konieczne jest dwuetapowe oczyszczanie. Pierwszy etap polega na chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny naładowanej Ni²⁺, która zatrzymuje białka z etykietą His. Eluowane frakcje poddawane są elektroforezie SDS-PAGE i barwieniu błękitem Coomassie Brilliant Blue (Rycyna 5A). Frakcje zawierające białko Shadoo są łączone i dalej oczyszczane meto.......

Dyskusja

Przedstawiono łatwy i skuteczny protokół zarówno do ekspresji, jak i oczyszczania dużej ilości rekombinowanego białka Shadoo myszy. Opisana metoda pozwala na pomyślne rozpuszczanie i oczyszczanie rekombinowanego białka Shadoo znakowanego (His₆). Ważne jest, jak wskazano w tytule, że po ekspresji w bakterii prokariotycznej E. coli Shadoo gromadzi się w ciałach inkluzyjnych. Przed oczyszczeniem Shadoo, bakterie muszą zostać poddane lizie przez sonikację w buforze zawierającym Triton X-100. Następnie cia.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AKTA FPLC	GE, Amersham	# 1363
HiLoad 16/60 Superdex	GE Healthcare	17-1069-01
HiTrap IMAC	GE Healthcare	GE17-0920-05
HiPrep26/10 Kolumna odsalająca	GE Healthcare	GE17-5087-01
SoluBL21 Kompetentny E. coli	Genlantis	C700200
pET-28b+	Novogen	69865-3
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LB-Bulion	medium Sigma-Aldrich	L3022
Eppendorf Biophotometar	Eppendorf	550507804
Trito X-100	Life Technologies	85111
NiSO4	Sigma-Aldrich	656895
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T
Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe	Roche	4693116001
NaCl	Sigma-Aldrich	746398
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
Gdn-HCl	Sigma-Aldrich	G4505
marker wielkości białka	Thermo Fisher Naukowy	26620