Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli

Podsumowanie

Opisana jest dwuetapowa metoda chromatograficzna oczyszczania rekombinowanego białka Shadoo wyrażonego jako ciała inkluzyjne w Escherichia coli, a także protokół migotania oczyszczonego Shadoo do struktur amyloidowych.

Streszczenie

System ekspresji Escherichia coli jest potężnym narzędziem do produkcji rekombinowanych białek eukariotycznych. Używamy go do produkcji Shadoo, białka należącego do rodziny prionów. Opisano chromatograficzną metodę oczyszczania rekombinowanego Shadoo znakowanego (Jego)₆ wyrażonego jako ciała inkluzyjne. Ciała inkluzyjne rozpuszcza się w 8 M moczniku i wiąże z kolumną naładowaną Ni²⁺ w celu przeprowadzenia chromatografii powinowactwa jonowego. Związane białka są eluowane przez gradient imidazolu. Frakcje zawierające białko Shadoo poddawane są chromatografii wykluczania wielkości w celu uzyskania wysoko oczyszczonego białka. W ostatnim etapie oczyszczony Shadoo jest odsalany w celu usunięcia soli, mocznika i imidazolu. Rekombinowane białko Shadoo jest ważnym odczynnikiem do badań biofizycznych i biochemicznych zaburzeń konformacji białek występujących w chorobach prionowych. Wiele doniesień wykazało, że prionowe choroby neurodegeneracyjne powstają w wyniku odkładania się stabilnych, uporządkowanych włókienek amyloidowych. Przedstawiono przykładowe protokoły opisujące sposób migotania Shadoo na fibryle amyloidowe przy pH kwaśnym i obojętnym/zasadowym. Metody produkcji i fibrylacji Shadoo mogą ułatwić badania w laboratoriach zajmujących się chorobami prionowymi, ponieważ pozwalają na produkcję dużych ilości białka w szybki i tani sposób.

Wprowadzenie

Choroby neurodegeneracyjne prionów, do których zalicza się gąbczastą encefalopatię bydła u bydła, trzęsawkę owiec i chorobę Creutzfeldta-Jakoba u ludzi, są śmiertelne i nieuleczalne. Choroby prionowe charakteryzują się zmianami konformacyjnymi komórkowego białka prionowego składającego się głównie z α-helis, w konformer amyloidowy wzbogacony β krzyżowo ^1,2. Struktury krzyżowe β zawierają gęsto upakowane i wysoce uporządkowane warstwy β przypominające kryształy, stabilizowane wiązaniami wodorowymi ^3,4. Amyloidy prionowe mogą się samoreplikować dzięki β-niciom na krawędzi wzrostu, które stanowią matrycę do rekrutacji i przekształcania monomerycznej jednostki białkowej.

Zgodnie z hipotezą "tylko białko", jedynym czynnikiem zakaźnym jest konformer amyloidu białka prionowego. Zaproponowano jednak, że niektóre inne biomolekuły są niezbędne w zaburzeniach prionowych. Na przykład uważa się, że błony komórkowe są miejscem, w którym zachodzi konwersja, a niektóre ujemnie naładowane lipidy usprawniają proces konwersji ^5,6. Ponadto niektóre białka mogą być również zaangażowane w patologie prionowe. W szczególności istnieją dwaj inni członkowie rodziny białek prionowych: Doppel i Shadoo ^7,8. Doppel ma stosunkowo sztywną strukturę stabilizowaną mostkami dwusiarczkowymi i nie ulega samopolimeryzacji i agregacji do włókienek amyloidowych ⁹. W przeciwieństwie do białka prionowego, Shadoo może przyjąć strukturę wzbogaconą o β arkusz i samoasocjować się w struktury fibryli amyloidowych. Wykazano, że Shadoo może migotać w warunkach natywnych lub po związaniu ujemnie naładowanych błon ^10,11. Konwersja Shadoo do włókien podobnych do amyloidu może być związana z patologiami. Rzeczywiście, mechanizmy, za pomocą których struktury podobne do amyloidu powodują chorobę, są słabo poznane.

Shadoo posiada domenę hydrofobową (HD) i serię tandemowych powtórzeń Arg/Gly podobnych do N-końcowej części białka prionowego (Rysunek 1A). Jako N-końcowa część białka prionowego, Shadoo jest wysoce dodatnio naładowany i wydaje się być natywnie nieustrukturyzowanym białkiem ^11,12. Shadoo wydaje się być funkcjonalnie związany z zaburzeniami prionowymi, ponieważ może bezpośrednio wiązać białko prionowe. Ponadto jego ekspresja jest regulowana w dół podczas patologii prionów ^13,14. Jednak rola Shadoo w chorobie prionowej nie została jeszcze ustalona.

Opracowaliśmy plazmid przenoszący sekwencję kodującą mysi gen Shadoo. Plazmid został wykorzystany do transformacji E. coli do produkcji N-końcowego białka fuzyjnego His₆ Shadoo. Ten system ekspresji jest dobrze przyjęty w naszym laboratorium i jest powszechnie stosowany w naszych bieżących projektach ^6,15,16. Ważną kwestią dla ekspresji Shadoo jest wybór szczepu E. coli. Podczas gdy kompetentny szczep bakteryjny BL21 jest powszechnie stosowany do ekspresji rekombinowanych białek, Shadoo został z powodzeniem poddany ekspresji i oczyszczony tylko z przekształconego szczepu bakteryjnego SoluBL21. Kompetentna E. coli SoluBL21 jest ulepszonym mutantem szczepu gospodarza BL21 opracowanym do produkcji białek, których ekspresja w macierzystym BL21 nie dawała wykrywalnego rozpuszczalnego produktu. Wysoki poziom ekspresji Shadoo w SoluBL21 E. coli prowadzi do akumulacji białka w ciałach inkluzyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, gdy nienatywne białko jest silnie eksprymowane w E. coli, białko to ma tendencję do gromadzenia się w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych. Shadoo prawdopodobnie agreguje się poprzez niekowalencyjne oddziaływania hydrofobowe lub jonowe (lub kombinację obu) do wysoce wzbogaconych dynamicznych struktur utworzonych przez białko pofałdowane w różnym stopniu. W związku z tym oczyszczanie składa się z co najmniej dwóch etapów: (i) selektywnego oddzielenia białka od innych biomolekuł w pożywce denaturacyjnej oraz (ii) renaturacji oczyszczonego białka przy użyciu technik fałdowania in vitro.

Selektywne oddzielenie Shadoo zostało osiągnięte w roztworze buforowym zawierającym 8M mocznik (lub alternatywnie 6M guanidyna-HCl). Usuwanie mocznika i renaturyzację białka można przeprowadzić poprzez zastosowanie różnych protokołów: (i) renaturyzacji w roztworze o kwaśnym pH w celu uzyskania nieustrukturyzowanego monomerycznego białka Shadoo lub (ii) renaturacji w roztworze o pH ≥ 7 w celu uzyskania Shadoo spolimeryzowanego w stabilne włókna amyloidowe z charakterystycznymi motywami β krzyżującymi się arkuszami.

Protokół

1. Generowanie plazmidu i ekspresja Shadoo

Uwaga: Gen kodujący mysie białko Shadoo (Shadoo^25-122) został podklonowany do wektora ekspresyjnego pET-28 ¹¹. Klon ten wprowadzono do szczepu bakteryjnego E. coli SoluBL21 w celu ekspresji białka Shadoo z N-końcowym tagiem heksahistydynowym (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), zgodnie z wcześniejszym opisem ¹¹. Plazmid można zamówić od autorów. Masa cząsteczkowa Shadoo obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej wynosi 12 243,2 Da.

Uwaga: Wszystkie manipulacje z bakteriami należy przeprowadzać pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza lub w pobliżu palnika Bunsena.

1. Przeprowadź transformację kompetentnych bakterii SoluBL21 plazmidem pET-28-His₆-Shadoo, stosując standardowy protokół szoku termicznego. Wymieszaj od 1 do 5 µl plazmidu (zazwyczaj od 10 pg do 100 ng) z 50 µl zawiesiny bakterii w probówce. Wykonaj szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s.
2. Hoduj transformowane bakterie w temperaturze 37 °C do osiągnięcia A₆₀₀ na poziomie 0,5-0,7 w medium Luria-Bertani uzupełnionym o 40 mg/ml kanamycyny (Rysunek 1B).
3. Indukuj ekspresję białka Shadoo przez noc (O/N), dodając do hodowli 240 µg/ml izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozydu (ITPG). Hoduj bakterie przy wstrząsaniu z prędkością 150 rpm w temperaturze 37 °C. Uwaga: Zazwyczaj hodowla bakteryjna osiąga A₆₀₀ równą 3 po całej nocy.
   Uwaga: Transformowane bakterie można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej produkcji białka. W tym celu do aliquotów hodowli bakteryjnej dodaj 10%-50% (v/v) sterylnego glicerolu i zamroź je w temperaturze -80 °C.

Rysunek 1. Schemat konstruktu ekspresyjnego Shadoo, transformacji bakterii i indukcji ekspresji Shadoo (zgodnie z opisem w kroku 1). (A) Konstrukt ekspresyjny dla Shadoo koduje znacznik heksahistydynowy połączony z N-końcem białka, Nt. Schemat przedstawia, że białko Shadoo zawiera zasadowe powtórzenia argininy/glicyny (zielony cylinder), domenę hydrofobową (HD) oraz pojedynczą stronę N-glikozylacji (CHO), a następnie C-koniec (Ct). (B) Plazmid pET-28-His₆-Shadoo jest transformowany do bakterii SoluBL21 metodą szoku termicznego przez 45 sec w 42 °C. Transformowane bakterie są wysiewane na selektywny agar zawierający 40 µg/ml kanamycyny. Pojedyncza kolonia z płytki jest wykorzystywana do zaszczepienia hodowli w kolbie wytrząsowej o pojemności 1,000-3,000 ml. Ekspresja białka rekombinowanego jest indukowana 1 mM IPTG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Oczyszczanie białka Shadoo za pomocą niskociśnieniowej chromatografii cieczowej (LPLC)

1. Liza komórek i przygotowanie ciałek inkluzyjnych
   1. Zebrać zawiesinę bakteryjną i przenieść ją do probówek do wirowania (Rysunek 2).
   2. Wirować przy 2,500 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz przez zlanie i resuspender osad w 15 ml buforu (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 z koktajlem antyproteazowym) dla każdego osadu pochodzącego z 500 ml hodowli komórkowej.
      Uwaga: Resuspenderowane osady można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka dni. Zamrażanie ułatwia lizę komórek bakteryjnych.
   3. Sprawdzić nadekspresję białka rekombinowanego w surowych osadach bakteryjnych za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie.
      1. W tym celu odwirować 1 ml hodowli bakteryjnej, aby uzyskać osad komórek. Do osadu dodać 100 µl roztworu denaturującego Laemmli (277.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4.4% SDS, 44.4% _w/v glicerolu, 0.02% błękitu bromofenolowego) i podgrzać w temperaturze 100 °C przez 5 min.
      2. Nanieść 10 µl próbki na żel akryloamidowy 12%, przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE i zwizualizować rozdzielone białka poprzez barwienie Coomassie.
   4. Do całkowicie resuspenderowanego osadu z etapu 2.1.2) dodać Triton X-100 do stężenia końcowego 0.5%.
   5. Inkubować zawiesinę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min.
   6. Sonikować zawiesinę przez 5 min przy amplitudzie szczyt-szczyt 6-12 mikronów w lodowatej wodzie, aby przeprowadzić lizę komórek bakteryjnych.
   7. Przenieść sonikowaną zawiesinę do czystych probówek do wirowania o pojemności 50 ml.
   8. Wirować probówki przy 15,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
   9. Usunąć nadsącz przez zlanie i dodać 5 ml buforu wiążącego (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M mocznika, 5 mM imidazolu) do każdej probówki.
   10. Umieścić probówki na rotatorze na noc (O/N), aby całkowicie resuspenderować białka z ciałek inkluzyjnych.

Rycina 2. Schemat oczyszczania ciał inkluzyjnych (zgodnie z opisem w kroku 2.1). Ztransformowane bakterie ekspresyjne Shadoo są zbierane przez wirowanie i resuspenderowane w buforze do lizy. Zawiesinę inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 30 min, a następnie poddaje sonikacji w celu mechanicznego rozbicia komórek bakteryjnych. Sonikację przeprowadza się na lodzie, aby zapobiec nagrzewaniu się próbki. Rozbite komórki są zbierane przez wirowanie i resuspenderowane w buforze zawierającym 8 M mocznika w celu solubilizacji białek z ciał inkluzyjnych. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

2. Chromatografia powinowactwa do Ni²⁺
   Uwaga: Chromatografię przeprowadza się na systemie FPLC przy użyciu kolumny chelatującej Sepharose 5 ml naładowanej Ni²⁺ (Rycina 3A). Wszystkie roztwory są nakładane na kolumnę z szybkością przepływu 1 ml/min.
   1. Wstrzyknąć 10 ml wodnego roztworu 0,2 M NiSO₄ do kolumny Sepharose w celu naładowania jej jonami Ni²⁺.
   2. Urównoważyć kolumnę naładowaną jonami Ni²⁺ poprzez wstrzyknięcie 30-50 ml buforu wiążącego o niskim stężeniu imidazolu (bufor 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika, 5 mM imidazolu).
   3. Nakładać białka rozpuszczone w moczniku, używając pętli wtryskowej o pojemności 50 ml.
   4. Odzyskać frakcję przepływową, dokładnie przemywając kolumnę 10 ml buforu wiążącego z niskim stężeniem imidazolu (bufor 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika, 5 mM imidazolu), aby usunąć z kolumny maksymalną ilość niewiązących białek.
   5. Przemyć kolumnę 50-100 ml buforu płuczącego (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika, 80 mM imidazolu), aby eluować białka nieswoiście związane z kolumną.
   6. Zastosować 15-minutowy gradient liniowy imidazolu od 80-800 mM w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M mocznika. Podczas stosowania gradientu zbierać frakcje o objętości 1 ml. Uwaga: Białka z tagiem His są eluowane gradientem buforu zawierającego imidazol (pełniącego rolę kompetytora).
   7. Pobrać alikwot 8 µl z każdej frakcji i dodać 4 µl 4x roztworu denaturującego Laemmliego (patrz 2.1.3.1). Ogrzewać roztwory w temperaturze 100 °C przez 5 min.
   8. Nałożyć 10 µl markera wielkości białek i 10 µl każdej próbki na 12% żel akrylamidowy, przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE i zwizualizować rozdzielone białka poprzez barwienie Coomassie. Uwaga: Masa cząsteczkowa Shadoo obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej wynosi 12 243,2 Da.
   9. Połączyć wszystkie frakcje zawierające Shadoo.

Rycina 3. Procedura oczyszczania (opisana w krokach 2.2-2.4). (A) Jony Ni²⁺ mogą być koordynowane przez reszty histydyny, co umożliwia selektywne oczyszczanie białek z tagiem polihistydynowym. Imidazol jest wykorzystywany do elucji białka dzięki zdolności do koordynacji z jonem Ni²⁺ i wyparcia związanego białka. (B) Białka o różnym promieniu hydrodynamicznym, które zostały zatrzymane na kolumnie Ni²⁺, są rozdzielane na kolumnie do wykluczania molekularnego. Białka są eluowane od największych do najmniejszych. (C) Przed użyciem frakcje zawierające Shadoo są łączone i odsalane w celu usunięcia mocznika, imidazolu i soli. Badania kontroli jakości obejmują SDS-PAGE z barwieniem Coomassie oraz Western blotting. Oczyszczone białko Shadoo może zostać poddane liofilizacji. Liofilizowane Shadoo jest stabilne przez wiele miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze -20 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Chromatografia wykluczania
   Uwaga: Drugim etapem oczyszczania jest chromatografia wykluczania, która oddziela białko Shadoo od pozostałych białek współelowanych podczas pierwszego etapu oczyszczania (Rycina 3B).
   1. Równoważyć kolumnę Superdex o całkowitej objętości złoża 120 ml poprzez wstrzyknięcie 250 ml buforu 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 8 M Urea przy szybkości przepływu 1.5 ml/min.
   2. Nanieść połączone frakcje zawierające Shadoo z punktu 2.2.9 na zrównoważoną kolumnę. Zbierać frakcje o objętości 1 ml po osiągnięciu objętości martwej kolumny wynoszącej 40 ml, przy stałym przepływie powyższego buforu.
   3. Pobrać alikwot 10 µl z każdej frakcji i przeprowadzić analizę SDS-PAGE oraz barwienie Coomassie zgodnie z powyższym opisem, aby ustalić, które frakcje zawierają Shadoo.
   4. Połączyć frakcje zawierające Shadoo.
4. Odsalanie
   Uwaga: Procedura odsalania usuwa sole, imidazol i mocznik w celu otrzymania rekombinowanego białka Shadoo w buforze odpowiednim do dalszych badań biofizycznych i biochemicznych (Rycina 3C). Taki sam rezultat można uzyskać poprzez dializę próbek przeciwko buforowi.
   1. Równoważyć kolumnę do odsalania o objętości 53 ml za pomocą 150 ml buforu 10 mM octanu amonu, pH 5, przy szybkości przepływu 5 ml/min.
   2. Nanieść połączone frakcje Shadoo na kolumnę. Po wstrzyknięciu buforu octanu amonu ręcznie zbierać frakcje wykazujące wzrost sygnału przy 280 nm na wyjściu detektora UV.
   3. Liofilizować odsolone białko Shadoo i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Przed użyciem rozpuścić liofilizowane białko Shadoo w odpowiednim buforze, np. w buforze 10 mM octanu sodu, pH 5.
      Uwaga: Znacznik polihistydynowy można usunąć za pomocą enterokinazy.

3. In Vitro Montaż białka Shadoo w amyloidowe włókna w pH fizjologicznym

Uwaga: Białko Shadoo agreguje i spontanicznie tworzy włókna przy pH ≥ 7 ¹¹.

Rycina 4. Schemat refoldingu Shadoo do włókien amyloidowych (opisany w kroku 3). Oczyszczone Shadoo samoistnie przekształca się we włókna amyloidowe po rozpuszczeniu w buforze o pH ≥ 7. W roztworze kwasowym Shadoo przekształca się we włókna amyloidowe podczas inkubacji z 1 M Gdn-HCl przy wstrząsaniu. Analizy kontroli jakości obejmują mikroskopię elektronową i barwienie ThT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Rozcieńczyć białko Shadoo do stężenia końcowego 2 µM w buforze Tris-HCl 20 mM o pH 7,4. Stężenie należy wyznaczyć poprzez pomiar gęstości optycznej roztworu przy 280 nm, wykorzystując współczynnik ekstynkcji wynoszący 20 970, wyliczony na podstawie składu aminokwasowego białka Shadoo.
2. Inkubować 500 µl roztworu w stożkowatej probówce plastikowej w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni, aby umożliwić spontaniczną konwersję białka w struktury amyloidowe (Rycina 4).
3. Do 100 µl alikwoty roztworu Shadoo dodać świeżo przygotowaną tioflawinę T (ThT) do stężenia końcowego 10 µM. Inkubować roztwór przez 5 min w temperaturze pokojowej. Zmierzyć emisję fluorescencji w zakresie od 460 do 520 nm przy długości fali wzbudzenia 435 nm, aby potwierdzić obecność struktur amyloidowych ¹⁷.

4. Montowanie Shadoo do włókien amyloidowych in vitro przy niskich wartościach pH

1. Rozcieńczyć Shadoo w 1 M GdnHCl i buforze octanu sodu 20 mM, pH 5, do stężenia końcowego 2 µM.
2. Inkubować 500 µl tego roztworu w probówce stożkowej przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 37 °C przez 3-7 dni.
3. Sprawdzić obecność włókien amyloidowych, dodając ThT do alikwotu roztworu zgodnie z opisem w punkcie 3.3.
4. Dializować otrzymaną zawiesinę przeciwko buforowi octanu sodu 10 mM, pH 5,0, aby oczyścić włókna amyloidowe Shadoo.
5. Przechowywać oczyszczone włókna w temperaturze +4 °C.

Rycina 5. Reprezentatywne wyniki. Frakcje białek eluowane z kolumny chelatującej naładowanej Ni²⁺ (A) oraz kolumny do wykluczania rozmiarowego (B) przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Identyfikację oczyszczonego białka Shadoo oceniono z użyciem przeciwciała anty-Shadoo SPRN (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Z jednego litra hodowli bakteryjnej uzyskuje się około 5-10 mg oczyszczonego białka Shadoo. Aby otrzymać rekombinowane Shadoo o wysokiej czystości, konieczne jest dwuetapowe oczyszczanie. Pierwszy etap polega na chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny naładowanej Ni²⁺, która zatrzymuje białka z etykietą His. Eluowane frakcje poddawane są elektroforezie SDS-PAGE i barwieniu błękitem Coomassie Brilliant Blue (Rycyna 5A). Frakcje zawierające białko Shadoo są łączone i dalej oczyszczane meto...

Dyskusja

Przedstawiono łatwy i skuteczny protokół zarówno do ekspresji, jak i oczyszczania dużej ilości rekombinowanego białka Shadoo myszy. Opisana metoda pozwala na pomyślne rozpuszczanie i oczyszczanie rekombinowanego białka Shadoo znakowanego (His₆). Ważne jest, jak wskazano w tytule, że po ekspresji w bakterii prokariotycznej E. coli Shadoo gromadzi się w ciałach inkluzyjnych. Przed oczyszczeniem Shadoo, bakterie muszą zostać poddane lizie przez sonikację w buforze zawierającym Triton X-100. Następnie cia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AKTA FPLC	GE, Amersham	# 1363
HiLoad 16/60 Superdex	GE Healthcare	17-1069-01
HiTrap IMAC	GE Healthcare	GE17-0920-05
HiPrep26/10 Kolumna odsalająca	GE Healthcare	GE17-5087-01
SoluBL21 Kompetentny E. coli	Genlantis	C700200
pET-28b+	Novogen	69865-3
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LB-Bulion	medium Sigma-Aldrich	L3022
Eppendorf Biophotometar	Eppendorf	550507804
Trito X-100	Life Technologies	85111
NiSO4	Sigma-Aldrich	656895
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T
Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe	Roche	4693116001
NaCl	Sigma-Aldrich	746398
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
Gdn-HCl	Sigma-Aldrich	G4505
marker wielkości białka	Thermo Fisher Naukowy	26620