Method Article

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

DOI:

10.3791/53437

⸱

December 12th, 2015

1Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powierzchnia komórki rośliny jest jej interfejsem do odbierania sygnałów środowiskowych; reaguje zmianami biologicznymi komórki, takimi jak transport błonowy i przegrupowanie cytoszkieletu. Analiza obrazu w czasie rzeczywistym i wysokiej rozdzielczości takich zdarzeń wewnątrzkomórkowych zwiększy zrozumienie biologii komórek roślinnych na poziomie molekularnym. Mikroskopia epifluorescencyjna o zmiennym kącie nachylenia (VAEM) to nowa technika, która zapewnia wysokiej jakości obrazy poklatkowe białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych. W tym artykule opisano praktyczne procedury przygotowania próbek VAEM, regulacji układu optycznego VAEM, przechwytywania filmów i analizy obrazu. Jako przykład obserwacji VAEM przedstawiono reprezentatywne wyniki dotyczące dynamiki PATROL1. Jest to białko niezbędne do ruchu aparatów szparkowych, uważa się, że bierze udział w dostarczaniu pompy protonowej do błon plazmatycznych w kompleksie szparkowym Arabidopsis thaliana. Obserwacja w czasie rzeczywistym komórek ochronnych i komórek pomocniczych w liścieniach A. thaliana wykazała, że znakowane fluorescencyjnie PATROL1 pojawiały się jako kropkowate struktury na błonach plazmatycznych przez kilka sekund, a następnie znikały. Analiza kymograficzna danych filmowych VAEM pozwoliła określić rozkład czasowy obecności (określany jako "czas przebywania") struktur przypominających kropki. Zastosowanie VAEM zostało omówione w kontekście tego przykładu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powierzchnia komórki roślinnej, w tym błona plazmatyczna i bezpośrednio przylegająca do niej cytoplazma, jest głównym regionem percepcji komórki roślinnej i integracji sygnałów biotycznych i abiotycznych ze środowiska zewnątrzkomórkowego. W odpowiedzi na te sygnały składniki powierzchni komórki, w tym białka błony plazmatycznej i cytoszkielet korowy, ulegają dynamicznym zmianom w skali czasu od sekund do minut1-4. W ten sposób obrazowanie białek fluorescencyjnych na powierzchni komórki w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości może rzucić światło na reakcje rośliny na sygnały środowiskowe na poziomie molekularnym.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa jest potężnym narzędziem do określania lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie3, jednak często trudno jest monitorować dynamikę białek w czasie rzeczywistym ze względu na stosunkowo długi czas ich przechwytywania. Nową techniką monitorowania białek w komórce roślinnej w czasie rzeczywistym jest mikroskopia epifluorescencyjna o zmiennym kącie nachylenia (VAEM), która jest adaptacją sprzętu zwykle używanego do mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). W mikroskopii TIRF fluorescencyjno-wzbudziające źródło światła jest ulotnym polem świetlnym, które jest generowane, gdy kąt wejścia lasera jest wystarczająco płytki, aby całkowicie wewnętrznie odbijać światło na granicy szkła i wody. Głębokość penetracji ulotnego pola świetlnego wynosi około 100 nm. Mikroskopia TIRF jest znakomitym narzędziem do obrazowania pojedynczych cząsteczek, takich jak wykrywanie egzocytozy w komórkach zwierzęcych5. Jednak ulotne światło nie może dotrzeć do błon plazmatycznych ani cytoplazmy korowej w komórkach roślinnych, ponieważ mają one grube ściany komórkowe. Ostatnio sprzęt do mikroskopii TIRF został zaadaptowany przez biologów komórek roślinnych, obserwując, że laser, jeśli jest ustawiony pod nieco większym kątem niż wtedy, gdy jest używany do wywoływania zjawisk całkowitego wewnętrznego odbicia, może wzbudzić powierzchnię próbek komórek roślinnych, co skutkuje wysokiej jakości obrazowaniem komórek roślinnych6,7. Głębokość oświetlenia wzbudzenia zmienia się poprzez regulację kąta wejścia lasera; dlatego ta technika jest opisana jako VAEM. Ten układ optyczny jest również nazywany mikroskopią TIRF o zmiennym kącie (VA-TIRFM), ponieważ istnieje możliwość, że całkowite odbicie może mieć miejsce na granicy ściana komórkowa-peryplazma7, jednak termin VAEM jest używany w tym artykule, zgodnie z pierwszym raportem w roślinach6.

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie praktycznych procedur użycia VAEM do wizualizacji fluorescencyjnie znakowanej dynamiki białek na powierzchni komórek roślinnych. Dodatkowo opisano protokół analizy obrazu w celu ilościowego określenia czasu przebywania (czasu obecności) cząsteczek do analizy filmu VAEM. Jako przykład posłużono się kropką GFP-PATROL1 na komórkach kompleksu szparkowego u liścieni Arabidopsis thaliana. PATROL1 został zidentyfikowany za pomocą zaawansowanych metod genetycznych jako gen przyczynowy mutanta defektu odpowiedzi szparkowej u A. thaliana8. PATROL1 jest roślinnym homologiem MUNC-13, który jest czynnikiem primingowym w egzocytozie pęcherzyków synapsowych8. W odpowiedzi na sygnały środowiskowe, takie jak światło lub wilgotność, uważa się, że PATROL1 odwracalnie reguluje dostarczanie pompy protonowej do błon plazmatycznych w kompleksie szparkowym. Każdy kompleks szparkowy składa się z pary komórek ochronnych8 i komórek pomocniczych9 i wymaga pompy protonowej do ruchu aparatów szparkowych. W tych komórkach PATROL1 znakowane GFP lokalizuje się w kropkowatych strukturach, które pozostają na błonie plazmatycznej przez mniej niż 1 minutę9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sadzonek

  1. Wysterylizuj nasiona.
    1. Przygotować roztwór sterylizacyjny, dodając 500 μl NaClO (dostępny chlor: 5,0%) i 1 μl 10% Triton X-100 do 500 μl sterylnej wody.
    2. Umieść ok. 10 transgenicznych nasion A. thaliana niosących GFP-PATROL18 w probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 1 ml 70% roztworu etanolu i dobrze wymieszać, odwracając pięć razy. Pozostaw na 1 min.
    4. Obserwuj, jak nasiona opadają na dno tuby. W czystej komorze z przepływem laminarnym delikatnie usuń 70% etanolu za pomocą mikropipety i dodaj 1 ml roztworu sterylizacyjnego. Dobrze wymieszaj, odwracając pięć razy i odstaw na 5 minut.
    5. Umyj nasiona. Pracując w warunkach aseptycznych, na czystej ławce, delikatnie usuń roztwór za pomocą mikropipety i dodaj 1 ml sterylnej wody. Powtórz to pięć razy. Wysterylizowane nasiona można przechowywać w sterylnej wodzie o temperaturze 4 °C przez 2 dni.
  2. Wysterylizowane nasiona wysiewać na 0,5% zestalonej gumie gellan 1/2 pożywki Murashige i Skoog (pH 5,8)9. Przyklej pokrywkę do płytki za pomocą dwóch warstw taśmy chirurgicznej.
  3. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze 4 °C w komorze chłodniczej O/N.
  4. Przenieść płytkę do komory wzrostowej ustawionej na temperaturę 23,5 °C z 12-godzinnym/12-godzinnym cyklem jasno-ciemnym przy użyciu 100 μmol m−2 sek−1 białych świateł i inkubować przez 7 dni. Następnie można zbierać sadzonki z liścieniami o długości około 1 mm.

2. Montaż kropli z nieba okazów liścienia

UWAGA: Ważnym czynnikiem w przygotowaniu próbki do obserwacji VAEM jest unikanie umieszczania pęcherzyków powietrza między próbką a szkłem nakrywkowym. Bąbelki znacznie obniżają jakość obrazu VAEM, powodując różnice we współczynniku załamania światła. Prosta metoda, którą nazwaliśmy montażem "kropli nieba", może być zastosowana w celu uniknięcia pęcherzyków między liścieniami A. thaliana a szkłem nakrywkowym. Należy to zrobić bezpośrednio przed obserwacją.

  1. Umieścić 30 μl buforu bazowego [5 mM kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego-Tris (MES-Tris) o pH 6,5, 50 mM KCl, 100 μM CaCl2] na środku szkiełka podstawowego (rozmiar: 76×26 mm, grubość: 1,0–1,2 mm).
  2. Usuń liścienie z 7-dniowej sadzonki za pomocą nożyczek do preparowania. Unieś liścienie stroną obserwacyjną skierowaną do góry na podstawowym spadku buforowym (rysunek 1, krok 1).
  3. Umieść 30 μl buforu podstawowego na środku szkła nakrywkowego (rozmiar: 18×18 mm, grubość: 0,12–0,17 mm) (Rysunek 1, krok 2). Delikatnie odwróć szklankę nakrywkową do góry nogami. Napięcie powierzchniowe zapobiegnie spadkowi bufora. Przytrzymaj szklankę nakrywkową pęsetą na jednej krawędzi. Umieść przeciwną krawędź na szkiełku podstawowym tak, aby kropla buforu znajdowała się w przybliżeniu powyżej liścienia.
  4. Trzymając krawędź szkła nakrywkowego nadal na szkiełku podstawowym i nadal przytrzymując przeciwległą krawędź pęsetą, wyreguluj położenie kropli buforowej pod szkłem nakrywkowym tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad próbką liścienia (Rysunek 1, krok 3). Puść szklaną pokrywę. Umieść kroplę na próbce, dając preparat bez pęcherzyków powietrza.
  5. Zetrzyj nadmiar buforu za pomocą niestrzępiących się chusteczek. Natychmiast obserwować przygotowanie (patrz krok 3).
    UWAGA: Nie ma potrzeby uszczelniania próbek.

3. Obserwacja VAEM i akwizycja filmów

UWAGA : System mikroskopowy TIRF9 używany w niniejszym badaniu jest opisany w następujący sposób: Mikroskop odwrócony jest wyposażony w jednostkę TIRF i soczewkę obiektywową TIRF o aperturze numerycznej 1,49. Do komputerowej kontroli kąta wejścia lasera używana jest skrzynka sterownicza. Zielone białko fluorescencyjne (GFP) jest wzbudzane za pomocą optycznie pompowanego lasera półprzewodnikowego o długości fali 488 nm, a fluorescencja jest wykrywana przez filtr pasmowo-przepustowy o długości fali 510–550 nm, aby zapobiec autofluorescencji chloroplastów. Zmierzona maksymalna wartość mocy wyjściowej światłowodu wynosi 13,0–13,5 mW. Do detekcji stosuje się system głowicy kamery EM-CCD (Electron Multipling Charge-Coupled Device) oraz jednostkę zmiany powiększenia kamery z mocowaniem C.

  1. Skalibruj centrowanie i ogniskowanie lasera zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnych obserwacji VAEM. Zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie okresowych kontroli procedur regulacji ścieżki lasera, odpowiednich dla posiadanego mikroskopu.
    1. Określ centralną pozycję oświetloną ścieżką światła bez soczewek obiektywu na suficie sali mikroskopowej. Aby zaznaczyć środkową pozycję, umieść kolorową okrągłą uszczelkę na suficie (Rysunek 2, krok 1, 2).
    2. Oświetl sufit za pomocą soczewki obiektywu (Rysunek 2, krok 3, 4). Przesuń oświetlony obszar do pozycji środkowej (Rysunek 2, krok 5). Ustaw ostrość lasera (Rysunek 2, krok 6). Dostosuj położenie zogniskowanego lasera do środka (Rysunek 2, krok 7).
  2. Ustaw próbkę na stoliku mikroskopu i wybierz komórki do obserwacji za pomocą oświetlenia jasnego pola.
  3. Sprawdź, czy białko fluorescencyjne można zaobserwować w komórkach i ustaw pozycję osi Z na powierzchni komórki za pomocą oświetlenia epifluorescencyjnego (ryc. 3A).
  4. Wykonaj obserwacje VAEM.
    1. Stopniowo zwiększaj kąt wejścia wiązki laserowej za pomocą skrzynki sterownika. Jednocześnie uważnie monitoruj obraz na żywo. Początkowo obraz będzie rozmazany (rysunek 3B).
    2. Wraz ze wzrostem kąta lasera obraz VAEM stanie się mniej rozmyty, co ostatecznie zapewni wyraźny obraz (ryc. 3C i D). W tym momencie przestań zwiększać kąt lasera. Jeśli sygnał fluorescencji zostanie utracony, zmniejsz go do płytszego kąta.
    3. Dostosuj kąt wejścia lasera, aby uzyskać lepszy obraz. Dostrojenie położenia osi z może również poprawić jakość obrazu. W razie potrzeby dostosuj parametry optyczne (moc lasera, długość fali i zestaw filtrów) oraz parametry przetwornika obrazu [rozmiar obrazu, czas ekspozycji, wzmocnienie, digitizer i wzmocnienie zwielokrotniające elektrony (EM)].
      UWAGA: W przypadku opisanego powyżej sprzętu mikroskopowego TIRF reprezentatywne parametry są następujące. Powiększenie obiektywu tuż przed aparatem: 2X; Moc lasera: 1,0 mW; Rozmiar obrazu: 512 × 512 pikseli; Czas naświetlania: 100 ms; Zysk: 5×; Digitizer: 11 MHz; i wzmocnienie EM: 100.
  5. Pobieranie filmu w postaci wielostronicowego pliku obrazu TIFF za pomocą komercyjnego oprogramowania mikroskopowego. Na zdjęciu film przedstawia kropki oznaczone GFP na powierzchni komórek szparkowych.
    UWAGA: Warunki pozyskiwania reprezentatywnych obrazów są następujące. Tryb akwizycji: Przesyłanie strumieniowe do pamięci RAM; Liczba ramek: 600; i rozmiar wielostronicowego pliku TIFF: ~302 MB.

4. Analiza kymograficzna do ilościowego oznaczania czasu przebywania kropki znakowanej GFP przy użyciu oprogramowania Fidżi

  1. Zainstaluj oprogramowanie Fiji ("Fiji is Just ImageJ")10, korzystając z instrukcji autorów (http://fiji.sc/Fiji).
  2. Uruchom Fiji i otwórz uzyskany wielostronicowy plik TIFF za pomocą menu Fiji "File-Open".
  3. Umieść linię w interesującym Cię miejscu, korzystając z menu paska narzędzi Fidżi "Narzędzie do zaznaczania linii prostej". Opcjonalnie użyj narzędzia "Narzędzie do zaznaczania linii segmentowanych" lub "Narzędzie do zaznaczania linii odręcznie". W przedstawionych tutaj wynikach linia prosta o długości 100 pikseli (odpowiadająca 8,0 μm) została umieszczona na komórce pomocniczej (rysunek 4A).
  4. Utwórz obraz kimograficzny za pomocą menu Fidżi "Image-Stacks-Dynamic Reslice" (http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Rysunek 4B). Opcjonalnie dostępne są również opcje "Odwróć w pionie" i "Obróć o 90 stopni" w oknie pola wyboru (nieużywane w prezentowanych tutaj wynikach). Osie x i y na obrazie kimografu wskazują odpowiednio położenie linii (100 pikseli odpowiada 8,0 μm) i czas obserwacji (600 pikseli odpowiada 60 sekundom). Jeśli obraz kimografu nie jest zadowalający, położenie i rodzaj (prosty, segmentowy i odręczny) linii na obrazie wielostronicowym może ulec zmianie. Wraz ze zmianą linii obraz kimografu zmienia się dynamicznie. Zapisz obraz kimograficzny jako plik TIFF za pomocą menu Fidżi "File-Save As-Tiff".
  5. Zmierz długość plamy w orientacji osi czasu.
    1. Aby wykonać redukcję szumów, zastosuj filtr Gaussa do obrazów kimograficznych za pomocą menu Fidżi "Proces-Filtry-Rozmycie gaussowskie". Parametr "Sigma (Promień)" jest przestrajany (do prezentowanych wyników używany jest promień 1 piksela).
    2. Segmentuj obszary sygnału według progowania, korzystając z menu Fidżi "Image-Adjust-Threshold".
      UWAGA: Do wyboru jest kilka algorytmów progowania. W prezentowanych wynikach wybrano algorytm "Yen" (Rysunek 4C).
    3. Przygotuj się do zmierzenia długości osi czasu (y) plamy za pomocą menu "Analyze-Set Measurements". Sprawdź "Prostokąt ograniczający" w oknie "Ustaw pomiary". Idealnie byłoby, gdyby ustawiony obszar był jak najmniejszy, aby wykluczyć hałas. W tym przypadku minimalny obszar został ustawiony na 50 pikseli. Zmierz długość osi czasu (y) plamy za pomocą menu "Analizuj-Analizuj cząstki". Aby uzyskać wartości wyników i udowodnić wiarygodność obszarów pomiaru, zaznacz pola "Wyświetl wyniki" i "Dodaj do menedżera".
    4. Wartości w kolumnie "Wysokość" to długości osi czasu (y) dla mierzonej plamy (Rysunek 4D). Zapisz wartości za pomocą menu tabeli wyników "Zapisz plik jako" oraz oblicz i przetwórz zestaw danych czasu trwania obrazu obiektu blob za pomocą pakietu statystycznego i/lub oprogramowania do arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 4E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule wideo przedstawiono protokoły obserwacji GFP-PATROL1 w komórkach kompleksu szparkowego liścienia A. thaliana. Montaż kropli na niebie jest prostą metodą przygotowania, która może pomóc w ograniczeniu występowania pęcherzyków powietrza w preparatach liścieni A. thaliana (ryc. 1). Nadmierne przechylenie lasera wejściowego i/lub ustawienie Z próbek dla VAEM zapewni niewyraźny obraz. Jeśli tak się stanie, zaleca się ponowne rozpoczęcie od pozycji bezpośrednio nad próbką, zgod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule wideo podano protokoły monitorowania i pomiaru dynamicznego zachowania kropek GFP-PATROL1 na kompleksie szparkowym Arabidopsis thaliana. Jak pokazano tutaj, obserwacja VAEM jest potężnym narzędziem do obrazowania na żywo powierzchni komórek roślinnych. W warunkach eksperymentalnych zastosowanych tutaj do monitorowania GFP-PATROL1, fotowybielanie fluorescencyjne było bardzo małe w próbce użytej do 1 minuty przechwytywania wideo, ponieważ bardzo czuły EM-CCD pozwala na użycie stosunkowo słabego lase...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jestem wdzięczny Dr. Masaru Fujimoto za jego techniczne sugestie dotyczące VAEM. Jestem również wdzięczny prof. Koh Iba i dr Mimi Hashimoto-Sugimoto za dostarczenie roślin transgenicznych z GFP-PATROL1 oraz dyskusje na temat PATROL1. Dziękuję prof. Seiichiro Hasezawie za nieustające wsparcie dla mojej pracy. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) grant KAKENHI numer 25711017.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop odwróconyOlympusIX-73
Jednostka TIRFSoczewka obiektywowa OlympusIX3-RFAEVAW
TIRF OlympusUAPON 100 i razy; OTIRF NA = 1,49
Skrzynka kontroli kąta laseraChuo SeikiQT-AK
Optycznie pompowany laser półprzewodnikowyCoherentSapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510– Filtr pasmowo-przepustowy 550 nmAparat OlympusU-FBNA
EM CCDHamamatsu PhotonicsImagEM C9100-13
Jednostka zmiany powiększenia kamery z mocowaniem C Oprogramowanie OlympusU-TVCAC
MetaMorphUrządzenia molekularneMetaMorph wersja 7.7.11.0
Instrukcja mikroskopii TIRFOlympusAX7385Instrukcje: System oświetlenia całkowitego wewnętrznego odbicia (wydrukowano w Japonii 24 sierpnia 2012 r.)
Olejek immersyjnyOlympusImmersion Oil Typr-Fne = 1,518 (23 stopnie)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
  2. Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
  3. Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
  4. Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
  5. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
  6. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
  7. Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
  8. Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215(2013).
  9. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
  10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
  12. Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
  13. Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
  14. Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
  15. Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
  16. Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Variable Angle Epifluorescence MicroscopyPlant Cell Surface DynamicsFluorescent Protein TrackingReal time ImagingKymograph AnalysisResidence Time MeasurementGuard Cell ObservationSubsidiary Cell AnalysisPATROL1 Protein DynamicsArabidopsis thaliana

Related Articles