Prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń

Podsumowanie

Przedstawiono protokół ekstrakcji i wstępnego zatężania estradiolu z próbek wody za pomocą zautomatyzowanego i zminiaturyzowanego systemu.

Streszczenie

Zaproponowano nową metodę ekstrakcji do fazy stałej (SPE) próbek wody ze środowiska. Opracowany prototyp jest ekonomiczny i przyjazny dla użytkownika, a także umożliwia szybkie, zautomatyzowane i proste wykonanie SPE. Wstępnie stężony roztwór jest zgodny z analizą za pomocą testu immunologicznego, o niskiej zawartości rozpuszczalnika organicznego. Opisano metodę ekstrakcji i wstępnego zatężania naturalnego hormonu 17β-estradiolu w 100 ml próbek wody. SPE z odwróconą fazą przeprowadza się za pomocą sorbentu oktadecylokrzemionkowego, a elucję przeprowadza się za pomocą 200 μl metanolu 50% v/v. Eluent rozcieńcza się przez dodanie dwuwody w celu zmniejszenia ilości metanolu. Po ręcznym przygotowaniu kolumny SPE, cała procedura jest wykonywana automatycznie w ciągu 1 godziny. Pod koniec procesu stężenie estradiolu mierzy się za pomocą komercyjnego testu immunoenzymatycznego i sorbentowego (ELISA). Osiągane jest 100-krotne stężenie wstępne, a zawartość metanolu wynosi zaledwie 10% v/v. Pełne odzyski cząsteczki uzyskuje się za pomocą 1 ng/l wzbogaconych, dejonizowanych i syntetycznych próbek wody morskiej.

Wprowadzenie

Przygotowanie próbki jest ważnym krokiem w każdym procesie analitycznym. W szczególności usunięcie efektów matrycowych, zmniejszenie zakłóceń i wzbogacenie analitu są niezbędne do uzyskania precyzyjnych wyników i osiągnięcia niskich granic wykrywalności. Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) budzą szczególne obawy ze względu na ich działanie na organizmy żywe, nawet jeśli są obecne w bardzo niskich stężeniach w środowisku. Naturalny hormon 17β-estradiol znajduje się na unijnej liście obserwacyjnej zanieczyszczenia wody i może zostać dodany do listy substancji priorytetowych regulowanych przez Europejską Ramową Dyrektywę Wodną. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) jest powszechnie stosowana do analizy małych zanieczyszczeń w wodzie, zarówno metodami wykrywania ^{chemicznego 1-5} (chromatografia, spektrometria mas), jak i immunologicznego ^6-9. Te ostatnie zyskały zainteresowanie w dziedzinie monitorowania środowiska, ponieważ testy immunologiczne są dostępne w wielu różnych formatach, są specyficzne dla docelowego analitu i osiągają niskie granice wykrywalności. ^{6, 7, 10, 11} Na rynku dostępne są różne testy immunoenzymatyczne (ELISA), które umożliwiają analizę wielu próbek jednocześnie na płytce wielodołkowej. Zabieg składa się z następujących po sobie etapów reakcji, które mogą trwać kilka godzin. Końcowy produkt reakcji można wykryć optycznie w celu określenia stężenia cząsteczki docelowej na podstawie krzywej kalibracyjnej.

Klasyczne procedury SPE obejmują wstępne kondycjonowanie sorbentu, ekstrakcję próbki, mycie, elucję i zagęszczanie przez odparowanie eluentu. Rozpuszczalnik używany do rozcieńczania tego ekstraktu dobiera się w zależności od metody wykrywania. W przypadku metod immunologicznych ilość rozpuszczalnika organicznego ma duży wpływ na czułość metody. ¹²

Oprócz wydajności odzysku i wstępnego zagęszczenia, metoda musi być również prosta i opłacalna. Automatyzacja procedury pomaga zmniejszyć liczbę błędów związanych z ludźmi. W naszej poprzedniej pracy ¹³ przedstawiliśmy nasz prototyp zautomatyzowanego SPE, a nasza metoda została zastosowana do analizy naturalnego hormonu 17β-estradiolu w próbkach wody morskiej. W prezentowanym filmie chcielibyśmy podkreślić techniczne zalety naszej metody w porównaniu z tradycyjnym SPE off-line i on-line oraz jej szczególną kompatybilność z detekcją za pomocą reakcji immunologicznych. Opisujemy protokół stosowany do próbek wody w celu wykrycia 17β-estradiolu. SPE przeprowadza się za pomocą fazy sorbentowej oktadecylokrzemionki (C18), a elucję przeprowadza się za pomocą rozcieńczonego metanolu.

Protokół

Uwaga: Poniższy protokół opisuje SPE przeprowadzoną na 100 ml próbki wody z sorbentem C18 i elucją, z 50% v/v metanolem. Wzbogaconą próbkę rozcieńcza się do 10% v/v metanolu przed analizą za pomocą zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA).

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotuj próbki wody
   1. Przed przystąpieniem do jakiegokolwiek innego kroku przefiltrować każdą 100 ml próbki wody za pomocą filtrów o wielkości porów 0,2 μm.
   2. Zwiększyć próbkę o pożądanym stężeniu, rozcieńczając odpowiednią objętość roztworu odniesienia w objętości wody. Na przykład, przygotować 100 ml próbki wody z 100 ng/l E2, rozcieńczając 3,3 μl roztworu odniesienia E2 o stężeniu 300 μg/l. Rozcieńczyć ten roztwór dziesięć razy, aby otrzymać próbkę wzbogaconą o 10 ng/l E2. Rozcieńczyć ten ostatni jeszcze dziesięć razy, aby otrzymać próbkę o objętości 100 ml z 1 ng/l E2.
   3. Przefiltrowaną próbkę (niezmodyfikowaną lub wzbogaconą) umieścić w szklanej butelce z gwintem GL45. Próbkę należy zużyć tego samego dnia. Weź małą frakcję do analizy za pomocą testu ELISA, aby oszacować początkowe stężenie.
2. Przygotować 300 μl eluentu, rozcieńczając metanol w wodzie dejonizowanej (di-) do 50% v/v w szczelnej probówce.

2. Przygotowanie kolumny SPE

1. Przygotować zawiesinę 20 mg/ml cząstek sorbentu oktadecylowo-krzemionkowego, dodając najpierw 1 600 μl metanolu, a następnie 400 μl di-wody do 40 mg sorbentu z odwróconymi fazami. Szczelnie zamknij pokrywkę i zamieszaj wirem.
2. Montaż dolnej membrany w kolumnie
   1. Wybierz jedną membranę nylonową o wielkości porów 11 μm i umieść ją na podwójnej warstwie chusteczki przeciwkurzowej. Za pomocą stempla o średnicy 3 mm wytnij dwie małe części w membranie.
   2. Chwyć jedną z małych membran za pomocą płaskich kleszczyków filtracyjnych i umieść ją po jednej stronie kolumny.
   3. Przykręć łącznik z płaskim dnem z rurką i dokręć. Membrana jest teraz na swoim miejscu, a sorbent można bezpiecznie dodać. Narysuj strzałkę na korpusie kolumny skierowaną w stronę końca, na którym umieszczono membranę.
3. Przygotowanie wypełnionej kolumny sorbentowej
   1. Przymocuj kolumnę do uchwytu strzałką skierowaną w dół. Kolumna musi być ustawiona jak najbardziej pionowo.
   2. Podłączyć pustą jednorazową strzykawkę o pojemności 10 ml do końca rurki kolumny za pomocą złączy Luer-Lock.
   3. Przygotuj mikropipetę z końcówką o pojemności 20-200 μl, ustaw objętość na 100 μl. Ten format końcówki do pipet jest dostosowany do wielkości przygotowywanej kolumny sorbentowej. Procedura byłaby trudniejsza w przypadku większych końcówek do pipet, takich jak te używane z pipetami o pojemności 1 ml.
   4. Wymieszać zawiesinę sorbentu za pomocą wiru i szybko odpipetować 100 μl w środek kolumny. Podczas wstrzykiwania należy delikatnie odessać cały odpipetowany roztwór przez membranę, używając strzykawki drugą ręką. Na tym etapie roztwór wypełniający strzykawkę musi być wolny od cząstek, a w kolumnie można ostatecznie zaobserwować złoże cząstek.
   5. Powtórzyć ten proces jeszcze 2 razy, mieszając zawiesinę podstawową między wszystkimi etapami pipetowania, aby zapewnić jednorodną zawiesinę cząstek w roztworze. Otrzymana kolumna zawiera 6 mg sorbentu.
   6. Po załadowaniu i wysuszeniu 300 μl zawiesiny poprzez zasysanie strzykawką, należy utrzymać strzykawkę na miejscu i umieścić drugą membranę nylonową na górze, używając kleszczy drugą ręką.
   7. Przykręcić drugi łącznik z rurką i wyrzucić strzykawkę. Kolumna SPE jest gotowa do użycia.

3. Przygotowanie systemu

1. Dokręć kolumnę SPE na urządzeniu za pomocą złączy Luer-Lock. Strzałka musi być skierowana w tym samym kierunku, co strzałka pokazana na urządzeniu.
2. Podłącz butelkę zawierającą próbkę do urządzenia, przykręcając do niej dołączoną nasadkę zabezpieczającą GL45.
3. Załadować 200 μl eluentu do zbiornika "Eluent".
4. Załadować 800 μl wody dwuwodnej do zbiornika "Rozcieńczenia".
5. Umieść butelkę na wylocie odpadów, aby zebrać przetworzoną wodę podczas etapu ekstrakcji. Format nie jest ważny, ale objętość musi być wystarczająco duża w stosunku do objętości próbki.
6. Umieścić małą fiolkę o minimalnej objętości 1,5 ml w otworze czujnika. Maksymalna objętość 1 ml będzie zbyt mała, ponieważ na tym wylocie utworzą się pęcherzyki podczas zbierania wzbogaconego eluentu i buforu rozcieńczającego.
7. Sprawdź, czy regulator ciśnienia jest w pozycji zamkniętej, obracając go ręcznie, w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż dalszy ruch nie będzie możliwy.

4. SPE z prototypem

1. Włącz prototyp, naciskając przycisk z tyłu.
2. Przygotowanie interfejsu użytkownika i wybór programu
   1. Otwórz interfejs użytkownika. Wybierz z listy port komunikacyjny komputera, do którego podłączone jest urządzenie, a następnie kliknij przycisk "Dalej".
   2. Wprowadź wartości 580 dla pset i 30 dla dpset. Pompa dostosuje się, aby utrzymać ciśnienie w układzie ciśnieniowym i zbiornikach na poziomie 580 ± 30 mbar podczas pracy.
   3. Wybierz tryb automatyczny.
   4. W kąciku trybu automatycznego załaduj plik programu w polu "ścieżka do pliku konfiguracyjnego".
3. Regulacja regulatora ciśnienia
   1. Uruchom pompę.
   2. Przekręć ręcznie regulator ciśnienia, aż wartość odczytana dla preg będzie mniejsza, ale bliska 320 mbar.
   3. Zatrzymaj pompę.
4. Wszczęcie procedury SPE
   1. Naciśnij "start" w kąciku trybu automatycznego. Pompa włączy się, a etapy ekstrakcji, elucji i rozcieńczania będą automatycznie następować po sobie. Cała procedura dla próbki o objętości 100 ml wykonywana jest w ciągu 50 minut.
   2. Sprawdź wartość preg. Na etapie ekstrakcji musi mieścić się w zakresie 320 - 350 mbar, aby zapewnić optymalne natężenie przepływu.
   3. Zamknąć małą fiolkę i przechowywać w temperaturze 4-5 °C w ciemności do czasu analizy. Wykonaj analizę w ciągu następnych 30 godzin, aby zapobiec degradacji analitu.
   4. Uzdatnioną wodę należy wyrzucić.
5. Czyszczenie systemu
   Uwaga: Po każdej procedurze ekstrakcji system należy wyczyścić, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
   1. Przygotować 10 ml roztworu metanolu 70% v/v w szklanej butelce GL 45.
   2. Odłącz kolumnę SPE i podłącz rurkę ze złączami.
   3. W trybie automatycznym wybierz plik "czyszczenie" i uruchom go z tymi samymi ustawieniami ciśnienia.

5. Wykrywanie stężenia estradiolu za pomocą testu ELISA

1. Przygotować próbki kalibracyjne o stężeniach wskazanych w protokole dostarczonym z używanym zestawem ELISA. Przygotować jeden zestaw kalibracyjny z tą samą matrycą co próbka i jeden zestaw kalibracyjny z metanolem 10% v/v.
2. Dozować niezbędną ilość próbki do dołków na płytce, zgodnie z instrukcjami producenta. Należy użyć próbek kalibracyjnych, niemodyfikowanych i wzbogaconych próbek wody, które zostały przefiltrowane, ale nie zostały przetworzone za pomocą SPE, oraz próbek wzbogaconych w metanolu 10% v/v. Użyj 3 dołków na próbkę, aby zmniejszyć błąd związany z testem.
3. Postępuj zgodnie ze wskazaniami protokołu dołączonego do zestawu dotyczącego dodawania reagentów, czasu inkubacji, mycia i dalszej reakcji z enzymem.
4. Odczytaj sygnał optyczny w każdej studzience zgodnie z instrukcjami producenta zestawu za pomocą czytnika płytek i zbierz dane.
5. Użyj oprogramowania czytnika płytek, aby dopasować krzywe kalibracyjne i określić stężenie E2 w próbce początkowej o tej samej matrycy oraz w próbkach wzbogaconych metanolem o stężeniu 10% v/v.

Wyniki

Powtarzalność pakowania sorbentu oceniono poprzez suszenie i ważenie pipetowanego sorbentu w szklanych fiolkach, a wynik przedstawiono na Rysunku 1. Powtarzalność czasu wstrzykiwania przetestowano dla próbek o objętości 100 ml, co przedstawiono na Rysunku 2. Stężenia w początkowych i wstępnie zagęszczonych próbkach wzbogaconych określono przy użyciu komercyjnego zestawu ELISA do 17β-estradiolu, a wyniki przedstawiono na Rysunku 3.

Dyskusja

Zaproponowano nową metodę przygotowania próbek wody, a następnie analizy za pomocą testu immunologicznego. Urządzenie umożliwia przeprowadzenie ekstrakcji fazy stałej w sposób zautomatyzowany i przyjazny dla użytkownika.

Filtracja próbki wody przed jej wstrzyknięciem do systemu ma kluczowe znaczenie. Wszelkie cząstki stałe nadal obecne w roztworze mogłyby potencjalnie spowodować zatkanie sieci płynów i zatkać kolumnę SPE. Kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie kolumny SPE. Ilość cząstek w ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Membrana filtracyjna 0,2 μ m wielkość porów	Merck Millipore	GNWP04700	Do filtracji próbek
Membrana nylonowa 11 μ m wielkość porów	Merck Millipore	NY1104700	Do kolumny SPE
Jednorazowy dziurkacz do biopsji 5 mm	Budżet medyczny	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μ m średnica cząstek
Syntetyczna woda morska	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Metanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol Zestaw ELISA	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 studzienek, zakres 30 - 3,000 ng/L