Dekarboksylacja enzymatyczna sterowana światłem

Summary

Opisujemy protokół katalizowanego światłem wytwarzania nadtlenku wodoru — kofaktora przemian oksydacyjnych.

Abstract

Oksydoreduktazy należą do najczęściej stosowanych enzymów przemysłowych. Niemniej jednak potrzebują zewnętrznych elektronów, których dostarczanie jest często kosztowne i trudne. Recykling donorów elektronów NADH lub NADPH wymaga użycia dodatkowych enzymów i substratów protektorowych. Co ciekawe, kilka oksydoreduktaz akceptuje nadtlenek wodoru jako donor elektronów. Chociaż jest niedrogi, odczynnik ten często zmniejsza stabilność enzymów. Rozwiązaniem tego problemu jest generowanie kofaktora in situ. Ciągłe dostarczanie kofaktora o niskim stężeniu napędza reakcję bez pogorszenia stabilności enzymu. W artykule przedstawiono metodę katalizowanego światłem wytwarzania nadtlenku wodoru in situ na przykładzie zależnej od hemu dekarboksylazy kwasów tłuszczowych OleT_JE. Dekarboksylaza kwasów tłuszczowych OleT_JE została odkryta ze względu na jej unikalną zdolność do wytwarzania długołańcuchowych 1-alkenów z kwasów tłuszczowych, co jest nieznaną dotąd reakcją enzymatyczną. 1-alkeny są szeroko stosowanymi dodatkami do plastyfikatorów i smarów. Wykazano, że OleT_JE akceptuje elektrony z nadtlenku wodoru do oksydacyjnej dekarboksylacji. Podczas gdy dodanie nadtlenku wodoru uszkadza enzym i skutkuje niską wydajnością, wytwarzanie kofaktora in situ pozwala obejść ten problem. System fotobiokatalityczny wykazuje wyraźne korzyści w zakresie aktywności enzymu i wydajności, co skutkuje prostym i wydajnym systemem dekarboksylacji kwasów tłuszczowych.

Introduction

Zmiana klimatu i przewidywalne wyczerpanie zasobów odnawialnych stanowi poważne zagrożenie dla naszego społeczeństwa. W tym kontekście kataliza enzymatyczna stanowi wciąż nie w pełni wykorzystany potencjał dla rozwoju zrównoważonej i "bardziej ekologicznej" chemii¹. Oksydoreduktazy mają zdolność katalizowania wprowadzania i modyfikacji grup funkcyjnych w łagodnych warunkach reakcji i należą do najważniejszych biokatalizatorów². Większość przemian redoks wymaga dostarczenia zewnętrznych kofaktorów, takich jak NAD(P)H. Metody regeneracji kofaktorów zostały zastosowane na skalę przemysłową. Nadal jednak wiążą się one z wysokimi kosztami procesu, co ogranicza ich zastosowanie głównie do produktów o wysokiej wartości. Co ciekawe, kilka monooksygenaz^{peroksydaz 3,4} i P450⁵ akceptuje elektrony z nadtlenku wodoru za pośrednictwem tak zwanego bocznika nadtlenkowego. Chociaż_H2O2jest tanim koreagentem, podobno jest szkodliwy dla wielu enzymów. Stałe tworzenie in situ niskich stężeń nadtlenku wodoru jest realnym podejściem do kierowania reakcją bez uszczerbku dla stabilności operacyjnej enzymu.

Rysunek 1. Eksperymentalne przygotowanie fotobiokatalitycznej dekarboksylacji kwasów tłuszczowych przez OleT_JE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykorzystanie światła jako źródła energii w procesach chemicznych i biologicznych cieszy się coraz większą uwagą w ostatnich latach⁶. Wytwarzanie nadtlenku wodoru napędzane światłem okazało się łatwą i niezawodną metodą dostarczania nadtlenku wodoru do przemian redoks (rysunek 1). Fotokatalizator, taki jak mononukleotyd flawinoadeninowy (FMN), umożliwia redukcję tlenu cząsteczkowego do nadtlenku wodoru, który następnie jest wykorzystywany jako kofaktor w enzymatycznej reakcji oksyfunkcjonalizacji. Możliwymi donorami elektronów są kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), askorbinian lub niedrogi formiat. Metoda ma ogólne zastosowanie do enzymów zależnych od_H2O2, w tym monooksygenaz peroksydaz^3,4 i P45055

.

Niedawno badaliśmy zastosowanie nowej bakteryjnej dekarboksylazy⁷ do przemiany naturalnych tłuszczów w olefiny⁸. Byłaby to zrównoważona droga syntezy powszechnie stosowanych chemikaliów platformowych ze źródeł biologicznych. Dekarboksylaza OleT_JE z bakterii Gram-dodatniej Jeotgalicoccus sp. katalizuje oksydacyjną dekarboksylację kwasów tłuszczowych i tworzy 1-alkeny jako produkty. OleT_JE jest ściśle spokrewniony z bakteryjnymi monooksygenazami P450 i do reakcji potrzebuje elektronów z nadtlenku wodoru.

Niestety, dodanie H₂O₂ do roztworu substratu i enzymu spowodowało niską konwersję i słabą powtarzalność wyników, prawdopodobnie z powodu szkodliwego wpływu nadtlenku wodoru na stabilność OleT_JE. Wytwarzanie białka fuzyjnego z reduktazą NADPH RhFred umożliwiło dekarboksylację zależną od NADPH. ⁹ Niemniej jednak wysoka cena NADPH i obecne ograniczone możliwości opłacalnej regeneracji skłoniły nas do zbadania tańszych donorów elektronów. Zainspirowani podobieństwem OleT_JE do monooksygenaz P450, zastosowaliśmy katalizowaną światłem generację_H2O2. Z przyjemnością uzyskaliśmy wysokie konwersje (do >95%) przy użyciu ekstraktów bezkomórkowych lub oczyszczonych roztworów enzymatycznych.

Na przykładzie dekarboksylacji kwasów tłuszczowych przedstawiamy ogólny protokół dla enzymatycznych przemian redoks sterowanych światłem przy użyciu FMN jako fotokatalizatora i nadtlenku wodoru jako kofaktora. Przedstawione metody obejmują wytwarzanie enzymu w rekombinowanej komórce E. coli, oczyszczanie enzymu, zastosowanie do syntezy 1-alkenów oraz analizę produktów reakcji.

Protocol

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Kilka substancji chemicznych stosowanych w tych syntezach jest silnie toksycznych i rakotwórczych. Wszystkie etapy związane ze szkodliwymi rozpuszczalnikami organicznymi, w szczególności ekstrakcja produktów reakcji i derywatyzacja kwasów tłuszczowych, muszą być przeprowadzane pod wyciągiem przy użyciu środków ochrony indywidualnej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami). Wszystkie czynności związane z organizmami zmodyfikowanymi genetycznie w tych pracach wymagają instalacji zatwierdzonych do pracy z organizmami zmodyfikowanymi genetycznie o poziomie bezpieczeństwa S1.

1. Ekspresja rekombinowanej dekarboksylazy OleT_JE w E. coli

1. Przygotowanie szczepu produkcyjnego
   1. Przygotować syntetyczny gen OleT_JE z Jeotgalicoccus i sklonować go do wektora ekspresyjnego pASK-IBA37plus zgodnie z opisem. ⁸
      UWAGA: Aby uniknąć degradacji kwasów tłuszczowych przez enzymy z metabolizmu bakteryjnego, zastosowano szczep E. coli JW5020 z kolekcji Keio o dysfunkcyjnym szlaku degradacji kwasów tłuszczowych.
2. Hodowla i indukcja ekspresji enzymów
   1. Przygotować hodowlę wstępną, zaszczepiając mutanta OleT E. coli JW5020 z płytki LB (zawierającej 100 μg ampicyliny ^ml-1) w dwóch 3 ml pożywki LB w probówkach. Odpipetować ampicylinę (100 μg ^ml-1) z roztworu podstawowego do pożywki w celu selekcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 180 obr./min.
   2. Dodać 2 ml kultur wstępnych do dwóch 200 ml pożywki LB, zawierającej ampicylinę (100 μg ^ml-1), w 1 l kolbach wstrząsowych. Inkubacja przebiega w temperaturze 37 °C i przy prędkości 180 obr./min.
   3. Monitoruj zmianę OD_600nm po inokulacji. Gdy OD₆₀₀ osiągnie wartość między 0,6 a 0,8, wywołaj ekspresję, dodając tetracyklinę (0,2 μg ^ml-1). Inkubować kultury przez 15 godzin w temperaturze 20 °C i 180 obr./min.
      UWAGA: Ponieważ OleT_JE zawiera kofaktor hemowy, konieczne jest dodanie kwasu δ-aminolewulinowego (0,5 mM) przed indukcją, aby zapewnić kulturze prekursor do syntezy kofaktora.
3. Liza komórek
   1. Wykonaj następujące czynności na lodzie. Przenieść kultury przez dekantację lub pipetowanie do probówek wirówkowych i użyć skali, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Odwirowywać kultury przez 20 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
   2. Ostrożnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 50 ml buforze (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) przez pipetowanie i przenieść zawiesinę do stożkowej probówki wirówkowej.
   3. Po odwirowaniu przez 15 minut w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C odrzucić supernatant, ponownie zawiesić każdą osadkę w buforze o pojemności 3 ml przez pipetowanie.
   4. Przeprowadź lizę komórek poprzez sonikację roztworów na lodzie (trzy cykle x 30 sekund), pozostawiając 1-minutową przerwę między cyklami. Odwirować roztwory przez 20 minut przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i przenieść supernatant do stożkowej probówki wirówkowej bez naruszania osadu przez pipetowanie. Wyrzuć granulkę.
      UWAGA: Jedna frakcja rozpuszczalnika zostanie użyta bezpośrednio do biokatalizy po usunięciu małych cząsteczek. Druga frakcja zostanie wykorzystana do oczyszczenia OleT_JE znakowanego przez Hisa.
4. Usuwanie małych cząsteczek ekstraktów komórkowych
   1. Przed użyciem surowego ekstraktu w biokatalizie, należy usunąć małe cząsteczki, które mogłyby zakłócać tworzenie się nadtlenku wodoru lub transfer elektronów, pipetując 3 ml ekstraktu bezkomórkowego do jednostki filtrującej wirówki z membraną 10 kDa i odwirować przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C. Zawiesić pozostałe białko w 3 ml buforu Tris-HCl.
5. Oczyszczanie OleT
   1. Nałożyć 3 ml ekstraktu z drugiej komórki na kolumny wirowe His Pur Ni-NTA, które zostały wcześniej zrównoważone buforem równoważącym (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM).
   2. Uszczelnij kolumny dolnymi zatyczkami i górnymi nakrętkami i lekko nimi potrząśnij, aż żywica zostanie równomiernie rozprowadzona z ekstraktem bezkomórkowym. Inkubować załadowane kolumny przez 30 minut w wytrząsarce podwieszanej w temperaturze 4 °C.
   3. Przepłukać kolumny 1 ml buforu płuczącego (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) przez odwirowanie przy 700 x g przez 2 min. Powtórz ten krok dwukrotnie.
   4. Umieścić kolumny w świeżej stożkowej probówce wirówkowej i dodać 1 ml buforu elucyjnego (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) OleT_JE. Wirować przy 700 x g przez 2 minuty i powtórzyć ten krok dwa razy.
      UWAGA: Imidazol wiąże się z niklem, a tym samym usuwa OleT_JE z kolumny.
   5. Przenieść elucję do jednostki filtrującej wirówki (membrana 10 kDa) i odwirować przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia imidazolu.
   6. Sprawdź czystość enzymu za pomocą karty charakterystyki (15%). ⁹ Zmieszać 3 μl elucji z buforem SDS (stężenie końcowe 1x) i inkubować roztwór w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu denaturacji. Następnie zastosuj całkowitą kwotę na stronie SDS. Uruchom żel przy 35 mA, używając komercyjnego wzorca białka. Wykryć białko przy 50 kDa.
   7. Aby określić stężenie białka, należy użyć dostępnego na rynku zestawu BSA. Odpipetować 50 μl rozcieńczonych próbek białka (1:100, 1:200, 1:500) i wzorca BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ^ml-1) w 96-dołkowej płytce. Dodać 200 μl odczynnika Bradforda, zmierzyć absorbancję przy 595 nm po 15 minutach za pomocą fluorymetru i obliczyć stężenia przy użyciu krzywej wzorcowej.

2. Biotransformacja katalizowana światłem

1. Reakcje biokatalityczne bez dodatku nadtlenku wodoru
   1. Przygotować 10 ml roztworu podstawowego 10 mM kwasu stearynowego (M_r 284,5 g ^mol-1), dodając 10% (v/v) tergitolu i 0,0284 g kwasu stearynowego do wody destylowanej. Podgrzewać roztwór w komorze grzewczej do temperatury 60 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia kwasu tłuszczowego.
   2. Biokataliza i pobieranie próbek
      1. Przygotować dwie mieszaniny reakcyjne o objętości 2 ml zawierające 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM kwasu stearynowego w buforze Tris-HCl. Dodać mieszadło magnetyczne w celu zapewnienia wystarczającego dopływu tlenu i umieścić szklane rurki w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 25 °C.
      2. Do każdej z mieszanin reakcyjnych dodać 200 μg ^ml-1 oczyszczonego enzymu lub 10% (v/v) ekstraktu bezkomórkowego i oświetlić je przezroczystą szklaną żarówką (120 W) w odległości 15 cm od probówek reakcyjnych.
      3. Pobrać 200 μl próbek w określonych punktach czasowych (0, 10, 30, 60 i 120 min oraz w nocy), zatrzymując reakcję za pomocą 20 μl 37% HCl. Dodać 5 μl kwasu mirystynowego (10 mM roztwór podstawowy) jako wzorzec wewnętrzny.
2. Analiza produktów reakcji
   1. W celu ekstrakcji dodać 500 μl octanu etylu do próbek dwukrotnie, odwrócić probówki i odwirować przez 1 minutę przy 13 000 x g.
   2. Pobrać 400 μl supernatantu i pozostawić rozpuszczalnik do całkowitego odparowania.
   3. Kwasy karboksylowe pochodnieć do kwasu trimetylosililokarboksylowego, dodając 200 μl N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (MSTFA). Inkubować roztwór w temperaturze 60 °C przez 30 minut w celu przekształcenia grup hydroksylowych w etery trimetylosililowe.
   4. Wyznaczanie konwersji metodą GC/FID
      UWAGA: Oznaczyć tworzenie 1-heptadecenu (RT: 8,34 min), kwasu α- i β-hydroksystearynowego (RT: 12,05 i 12,1 min) oraz zmniejszenie substratu (RT: 11,15 min) za pomocą GC/FID.
      1. Ustaw opisany poniżej profil temperatury Ustaw temperaturę wtrysku na 340 °C. Utrzymuj początkową temperaturę piekarnika na poziomie 90 °C przez 3.5 minuty, a następnie zwiększ do 45 °C ^min-1. W temperaturze 220 °C utrzymać temperaturę przez 2 minuty. Po wielokrotnym wzroście o 45 °C ^min-1 należy utrzymać temperaturę 280 °C przez 2 minuty, a następnie zwiększyć do 60 °C ^min-1,
         UWAGA: Maksymalna temperatura 330 °C jest utrzymywana przez 1,44 min.
      2. Wstrzyknąć 4 μl próbki ze stosunkiem podziału 5, aby uzyskać szybką ulatnianie się i jednorodne zmieszanie z gazem nośnym helem.
         UWAGA: W zależności od wzrostu temperatury podłoże i produkty wejdą w fazę gazową. Substancje są wykrywane przez detektor GC/FID po przejściu przez kolumnę w określonych czasach retencji i są wyświetlane jako piki na ekranie. Obserwuj formację szczytu na monitorze.
      3. Obliczyć stężenie utworzonego produktu według następującego wzoru:
         
         UWAGA: Współczynnik kalibracji został określony specjalnie dla tej kolumny dla każdego substratu i produktu poprzez obliczenie krzywej wzorcowej na podstawie znanych ilości substancji derywatyzowanych i odpowiadającej im powierzchni pików.
   5. Zidentyfikuj piki olefin i β-hydroksykwasów za pomocą GC/MS.
      1. Zidentyfikuj piki olefin i β-hydroksykwasów za pomocą GC/MS. Ustaw profil temperatury. Ustawić temperaturę wtrysku na 250 °C. Utrzymać temperaturę piekarnika na poziomie 100 °C przez 5 minut, a następnie zwiększyć o 20 °C ^min-1,
         UWAGA: Maksymalna temperatura jest utrzymywana przez 7,5 min.
      2. Ustawić temperaturę detektora spektrometru mas na 250 °C i skanować z prędkością od 50 do 500 m/z w trybie uderzenia elektronów.
         UWAGA: Jonizacja uderzeniowa elektronu usuwa pojedynczy elektron, powodując powstanie rodnika, który zostanie przekazany do analizy masy. Ze względu na wysoką energię wewnątrzmolową wiązania kowalencyjne w cząsteczce pękają, tworząc fragmenty o niższym m/z. Fragmenty te tworzą odcisk palca specyficzny dla danej substancji.
      3. Wstrzyknąć 1 μl próbki. Wykryj 1-heptadecen po 11,4 minutowym czasie przechowywania za pomocą odpowiedniego odcisku palca (ryc. 2).

Results

Podczas gdy dodanie nadtlenku wodoru do mieszaniny reakcyjnej spowodowało niską lub umiarkowaną konwersję (<10%), wytwarzanie nadtlenku wodoru in situ zwiększyło konwersję do 80%. Analiza metodą GC/MS wskazuje na tworzenie się olefin z kwasów tłuszczowych (ryc. 2).

Rysunek 2. (A) Profil temperatury dla pomiarów GC/MS. (B) Odcisk palca 1-heptadecenu eluującego po 11,4 min. (C) Charakterystyczne wtórne jony fragmentacyjne C_nH_2n-1 końcowych olefin pokazane na przykładzie 1-heptadecenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reakcja katalizowana światłem osiągnęła wysokie konwersje dzięki bezkomórkowym ekstraktom E. coli. Oczyszczony roztwór enzymu wykazał wyraźną korelację między stężeniem enzymu a jego konwersją. Zwiększenie stężenia cząsteczki zbierającej światło FMN prowadzi do wyższych konwersji. Jednak zwiększenie stężenia powyżej 10 mM nie przyspieszyło jeszcze bardziej reakcji, co wskazuje, że ilość nadtlenku wodoru jest wystarczająco dostępna i nie jest już czynnikiem ograniczającym.

Oprócz dekarboksylacji kwasów tłuszczowych, OleT_JE katalizuje również hydroksylację w pozycji β. Podczas konwersji kwasu stearynowego dekarboksylacja jest około trzy razy szybsza niż hydroksylacja. W typowym eksperymencie z użyciem roztworu 0,5 mM kwasu stearynowego i 10 μM FMN, 99% substratu przekształcono w mieszaninę 1-heptadecenu i kwasu 2-hydroksystearynowego w stosunku 3,3:1 (ryc. 3)⁸. Badanie widma substratów biokatalizy sterowanej światłem wykazało, że w przypadku kwasów tłuszczowych o dłuższych łańcuchach acylowych OleT_JE preferencyjnie katalizuje dekarboksylację, podczas gdy względna ilość hydroksylowych kwasów tłuszczowych w mieszaninie produktów wzrastała wraz z krótszą długością łańcucha. Kwasy tłuszczowe krótsze od kwasu mirystynowego (C14) nie ulegały dekarboksylacji.

Rysunek 3. Chromatografia gazowa dekarboksylacji kwasu stearynowego za pośrednictwem OleT_JE (11,15 min) do 1-heptadecenu (8,4 min), kwasu α-hydroksystearynowego (12,04 min) β-hydroksystearynowego kwasu (12,1 min). Pokazana jest zmiana powierzchni pików w próbkach pobranych w ciągu 2 godzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zaskakująco, nienasycone kwasy kwas oleinowy (C18:1d9 cis) i kwas linolowy (C18:2d9d12) nie zostały zaakceptowane jako substraty, co wskazuje, że skręcona konfiguracja podwójnych wiązań cis nie może być zaakomodowana w produktywnym trybie wiązania w enzymie. Dodatek kwasu oleinowego (10%) zapobiegał również przemianie kwasu stearynowego. Co ciekawe, kwas stearynowy (C18:1d9 trans) został przekształcony przez OleT_JE, jednak z nieco niższą aktywnością niż kwas stearynowy.

Discussion

Napędzana światłem generacja nadtlenku wodoru może być stosowana do szeregu przemian redoks, w tym peroksygenaz³, chloroperoksydaz¹⁰ i monooksygenaz P450⁵. Jest to łatwe i praktyczne podejście. W dłuższej perspektywie wykorzystanie światła widzialnego otwiera perspektywę wykorzystania światła słonecznego do przemian chemicznych, które jest zrównoważoną alternatywą dla reakcji bogatych w energię.

Metodę stosuje się w przypadku oczyszczonego enzymu lub ekstraktu bezkomórkowego. Chociaż to ostatnie wymaga mniejszych kosztów i pracy, należy zauważyć, że małe cząsteczki w surowym ekstrakcie mogą zakłócać konwersję katalizowaną światłem. Praktycznym podejściem jest usunięcie tych małych składników za pomocą mikromembrany (tj. przez odwirowanie w filtrze odśrodkowym lub przez dializę). Stężenie cząsteczki zbierającej światło FMN określa stężenie nadtlenku wodoru. W zależności od powinowactwa oksydoreduktazy, stężenie to ma decydujące znaczenie dla aktywności enzymatycznej. Innym ważnym czynnikiem jest stężenie protektorowego donora elektronów EDTA. Najważniejszym parametrem jest jednak stabilność działania i aktywność enzymu.

Olefinizacja kwasów tłuszczowych jest elegancką reakcją przekształcania biopochodnych kwasów tłuszczowych w olefiny, które należą do głównych surowców dla przemysłu chemicznego. Sterowana światłem biokatalityczna dekarboksylacja może być przeprowadzana w temperaturze pokojowej i przy neutralnym pH, co zapewnia wyraźne korzyści w zakresie zrównoważonego rozwoju.

Nasze wyniki pokazują, że wytwarzanie nadtlenku wodoru in situ jest strategią dostarczania kofaktora bez pogorszenia stabilności enzymu, co prowadzi do wysokiej konwersji. Obecne metody regeneracji kofaktorów wykorzystują produkty rolne lub chemikalia na bazie ropy naftowej. Reakcje napędzane światłem stają się odnawialną alternatywą. Przyszłe badania będą poświęcone metodom zastępowania odczynnika protektorowego EDTA tańszymi cząsteczkami oraz zmniejszaniu ilości cząsteczki zbierającej światło FMN.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Ampicillin	Sigma Aldrich	69-52-3
Odczynnik Bradford	Roth	K015.1
BSA	Sigma Aldrich	90604-29-8
DMSO	Sigma Aldrich	67-68-5
Octan etylu	Fisher Chemical	141-78-6
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Roth	8043.1
Hydrat soli sodowej 5-monofosforanu ryboflawiny	Sigma Aldrich	130-40-5
Kwas chlorowodorowy 37%	Sigma Aldrich	7647-01-0
Nadtlenek wodoru 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1
δ-Kwas aminolewulinowy	Sigma Aldrich	5451-09-2
N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamid (MSTFA)Sigma	Aldrich	24589-78-4
Kwas mirystynowy >99%	Sigma Aldrich	208-875-2
Imidazol	Sigma Aldrich	288-32-4
Chlorek sodu	Fisher Chemical	7647-14-5
Kwas stearynowy >99%	Sigma Aldrich	57-11-4
Tetracyklina	Sigma Aldrich	60-54-8
Tergitol	Sigma Aldrich	MFCD01779855
Tris(hydroksymetylo)-aminomethan	Sigma Aldrich	77-86-1
Device
Inkubator wytrząsarka	G-25CK	New Brunswick Scientific
	Ecotron	Infors HT
Wirówka	400R	Heraeus
	RC 5B Plus	Sorvall
	Fresco 17	Thermo Scientific
Wirniki wirówkowe	SS34	Sorvall
	SLA	Sorvall
Clean bench	Envirco	Ceag Schirp Reinraum technik
Kolumna GC-FID	CP-Sil 5CB (30 m x 0,25  mm x 0,25 &mikro; m)	Kolumna Agilent Technologies
GC-MS	FactorKolumna kapilarna czterokapilarna (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)	Varian
GC-FID	GC-2010 plus	Shimadzu
GC-MS	IST-40	Varian
Mieszadło magnetyczne	RCT klasyczny
	SevenEasy	Mettler toledo
Sonicator	Branson Sonifier 250	Branson
Fotometr spektralny	FLUOstar Omega	BMG Labtech
Equipment
Kolumna chromatografii powinowactwa	Jego kolumna wirowa Pur Ni-NTA	Thermo Scientific
Centricon	Vivaspin turbo 15	VWR International
Microtiter Płytki	96 Well Multiply® Płytki do PCR	Sarstedt