Artykuł metodologiczny

Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53444

⸱

7 marca 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Dwie uzupełniające analizy atmosferycznych cząstek biologicznych z filtrów próbek powietrza są opisane tutaj: ekstrakcja i wykrywanie endotoksyny oraz DNA.

Streszczenie

Badania aerozoli na zewnątrz często wykorzystują cząstki stałe pobierane na filtrach. Procedura ta umożliwia równoległe wykonywanie różnych charakterystyk zebranych cząstek. Celem przedstawionej metody jest uzyskanie wysoce dokładnej i wiarygodnej analizy zawartości endotoksyn i DNA w bioaerozolach wyekstrahowanych z filtrów. Ekstrakcja cząsteczek organicznych o dużej masie cząsteczkowej, takich jak lipopolisacharydy, z próbek filtrów polega na wytrząsaniu próbki w wolnym od pirogenów środowisku na bazie wody. Dalsza analiza opiera się na reakcji enzymatycznej, którą można wykryć za pomocą pomiaru mętnościowego. Ze względu na wysoką zawartość substancji organicznych w próbkach filtrów, ekstrakcja DNA z próbek odbywa się przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, który został pierwotnie zaprojektowany dla gleb i zmodyfikowany w celu poprawy wydajności DNA. Opisano wykrywanie i kwantyfikację określonych gatunków drobnoustrojów za pomocą ilościowej analizy łańcuchowej reakcji polimerazy (q-PCR) i porównano je z innymi dostępnymi metodami.

Wprowadzenie

Pobieranie próbek powietrza na filtrach jest podstawowym narzędziem w badaniach aerozoli atmosferycznych. 1 Próbkowane filtry są punktem wyjścia dla różnych charakterystyk chemicznych, fizycznych i biologicznych zebranych cząstek otoczenia. 2-11 Zaletą tego podejścia jest to, że różne analizy mogą być wykonywane off-line na tej samej próbce. Zestawienie danych z różnych analiz umożliwia badaczowi dobre zrozumienie charakterystyki zebranych cząstek i pomaga w rozwiązywaniu złożonych problemów w naukach o atmosferze. 12,13 Na przykład próbki powietrza morskiego i śródlądowego pobrane w tym samym okresie można porównać pod względem toksyczności cząstek i składu biologicznego. 14 W tym badaniu lipopolisacharydy (LPS), składniki ścian komórkowych bakterii Gram-ujemnych, znane również jako endotoksyny, wyekstrahowano z filtrów, od których pobrano próbki na lądzie i w głębi lądu, i oceniono je za pomocą testu lizatu amebocytów limulusa (LAL). Równolegle przeprowadzono genomową ocenę zawartości bakterii (bakterie ogółem, Gram-ujemne i cyjanobakterie) na tej samej próbce przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (q-PCR). Test LAL opiera się na pomiarach zmętnienia powstałego po dodaniu wodnego ekstraktu amebocytów z kraba podkowiastego, Limulus polyphemus, do roztworu wodnego zawierającego endotoksyny. Im wyższe stężenie endotoksyn w próbce, tym szybciej rozwija się zmętnienie. 15 Analiza q-PCR opiera się na sygnale fluorescencyjnym emitowanym podczas amplifikacji określonego fragmentu DNA. 16 Dzięki monitorowaniu sygnału w czasie rzeczywistym w fazie wykładniczej reakcji PCR i kalibracji za pomocą krzywej wzorcowej można określić ilościowo początkową ilość DNA. Połączenie tych dwóch analiz z innymi, jak opisano w innym miejscu,14 może zapewnić dobre oszacowanie poziomów endotoksyn i ilości bakterii źródłowych w próbkach.

Celem przedstawionej tutaj metody jest uzyskanie bardzo dokładnej i wiarygodnej analizy zawartości endotoksyn i DNA w bioaerozolach ekstrahowanych z filtrów. Podczas gdy metody pobierania próbek fizycznych i nieorganicznych właściwości chemicznych aerozoli są dobrze znane, a ostatnio opracowano metody badania ich składnika materii organicznej17, przeprowadzono niewiele badań nad biologicznym składnikiem aerozoli. 18 Uzasadnieniem dla obecnej metody jest wypełnienie tej luki poprzez szczegółowe przedstawienie solidnej metody ekstrakcji, analizy i identyfikacji frakcji biologicznej aerozoli unoszących się w powietrzu. 14

Opisana tutaj metoda powinna znaleźć szerokie zastosowanie w biologicznych projektach badawczych nad aerozolami wewnętrznymi i zewnętrznymi, obejmujących analizę filtrów. 20-24

Rozdział

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Szczegółowa lista wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole znajduje się w sekcji Materiały.

1. Pobieranie próbek powietrza na filtry

  1. Przygotowanie filtrów
    1. Do poboru próbek o dużej objętości należy użyć filtrów o wymiarach 20,3 x 25,4 cm2. Wybierz rodzaj filtra, który najlepiej odpowiada potrzebom badawczym, a także odpowiednią wielkość porów (cut-off), jeśli jest to wymagane.1 W tym przypadku należy zastosować kwarcowe filtry z mikrowłókien.
    2. Filtry przeznaczone do poboru związków organicznych i biologicznych należy uprzednio wypalić, aby usunąć pozostałości organiczne. Aby wypalić filtry, zawiń każdy z nich osobno w folię aluminiową, a następnie wypal w piecu laboratoryjnym w temperaturze 450 °C przez co najmniej 5 hr.
    3. Wypalone filtry należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu poboru próbek.
  2. Obsługa urządzenia i pobieranie próbek powietrza
    1. Oczyść głowicę próbnika o dużej objętości z osadzonego pyłu. Przetrzyj części czystymi ręcznikami papierowymi i pozostaw do wyschnięcia przed ponownym podłączeniem ich do próbnika.
    2. Zdezynfekuj kasetę filtra etanolem; przez cały czas pracy należy używać rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.
    3. Umieść wypalony filtr w czystej kasecie filtra i postępuj zgodnie z instrukcją obsługi próbnika o dużej objętości.
    4. Na folii aluminiowej zaznacz datę oraz wszelkie nietypowe warunki pogodowe, jeśli wystąpiły (np. deszcz, burza pyłowa), i przechowuj ją w czystym miejscu do zakończenia poboru próbek.
    5. Wyjmij zużyty filtr i złóż go na pół, tak aby strona, na której osadziły się próbki, znajdowała się wewnątrz.
    6. Zawiń filtr w oryginalną folię aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
      Uwaga: Jeśli odstęp czasu między pobraniem próbki a analizą jest dłuższy niż 2 miesiące, przechowuj próbkę w temperaturze -80 °C, aby zapobiec degradacji materiału organicznego i biologicznego.

2. Analiza endotoksyn

Uwaga: Powierzchnię roboczą należy zdezynfekować 70% etanolem i używać wyłącznie probówek, końcówek oraz odczynników wolnych od pirogenów. W przypadku użycia szkła laboratoryjnego wymagane jest wstępne wygrzanie w temperaturze 250 °C przez 30 min lub 200 °C przez 60 min.25 Wszystkie odczynniki należy przygotować w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, przez cały czas pracując w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym.

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Zgodnie z protokołem producenta zestawu LAL, należy rehydratować lizat krótko przed użyciem.26 Delikatnie opukać fiolkę, aby odczepić pozostałości LAL z jej ścianek. Ostrożnie unieść korek, aby przełamać próżnię. Za pomocą strzykawki z igłą dodać do fiolki 5 ml wody beztlenowej i wolnej od pirogenów (PFW), aby rehydratować całą zawartość lizatu, a następnie delikatnie wymieszać, aby uniknąć powstania piany.
    2. Fiolkę, gdy nie jest używana, należy uszczelnić plastikową folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch dni. Pozostały lizat należy przechowywać w temperaturze -20 °C do trzech miesięcy.
      Uwaga: Odczynnik ten można zamrozić tylko raz.
    3. Rehydratować kontrolny standard endotoksyn (CSE), zawierający 0,5 µg E. coli, zgodnie z protokołem producenta.27 Dokładną ilość wody do dodania do fiolki CSE należy ustalić na stronie internetowej producenta28, wpisując numer partii zestawu w odpowiednim miejscu na stronie. Końcowe stężenie E. coli w fiolce mierzone jest w jednostkach endotoksyn (EU; gdzie 10 EU = 1 ng). Fiolkę tę należy oznaczyć jako Ed0.
    4. Fiolkę CSE, gdy nie jest używana, należy uszczelnić plastikową folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.
  2. Przygotowanie krzywej standardowej i filtrów z dodatkiem endotoksyn
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przygotować 22 beztlenowe i wolne od pirogenów probówki wirówkowe o pojemności 2 ml, zawierające malejące ilości CSE (probówki Ed1-Ed11) lub brak CSE (probówka ślepa zawierająca tylko PFW), aby stworzyć podwójną serię rozcieńczeń endotoksyn, zgodnie z Tabelą 1.
    2. W komorze biologicznej z przepływem cyrkulacyjnym wyciąć 22 okrągłe kawałki czystego, upieczonego wcześniej filtra, używając zdezynfekowanego wycinaka do korków o średnicy 1,12 cm.
    3. Umieścić pary filtrów w sterylnych szalkach Petriego.
    4. Nanieść 50 µl z każdego członu serii rozcieńczeń endotoksyn Ed2-Ed11 oraz z probówki ślepej na odpowiadające im pary filtrów.
    5. Pozostawić szalki Petriego z filtrami z dodatkiem endotoksyn otwarte pod wyciągiem do wyschnięcia przez 30 min.
    6. Każdy kawałek filtra umieścić w beztlenowej i wolnej od pirogenów probówce o pojemności 2 ml.
ProbówkaKońcowe stężenie endotoksyn (EU/ml)-1)Standardowa objętość endotoksyny (ml)Objętość wody beztropogennej (ml)objętość całkowita (ml)
Ed02,500roztwór stokowy5
Ed11,00080 (z Ed0)120200
Wersja 210020 (z Ed1)180200
Ed35010 (z Ed1)190200
Ed4255 (z Ed1)195200
Wydanie 512.52.5 (z Ed1)197.5200
Ed66.251,25 (z Ed1)198.75200
Ed73.1256,25 (z Ed2)193.75200
Ed81.5636,25 (z wyd. 3)193.75200
Ed90.7816,25 (z Ed4)193.75200
Ed100.3916,25 (z Ed5)193.75200
Ed110.1956,25 (z Ed6)193.75200
Puste pole00200200
* Przygotować roztwór zapasowy zgodnie z instrukcjami producenta.

Tabela 1: Krzywa wzorcowa endotoksyn.** Dla każdej probówki z rozcieńczeniem w krzywej kalibracyjnej szczegółowo określono stężenie endotoksyn, objętość wzorca endotoksyn oraz wody wolnej od pirogenów do dodania, a także otrzymaną objętość całkowitą.

  1. Ekstrakcja endotoksyn z filtrów eksperymentalnych i wzbogaconych
    1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wyciąć z filtrów z próbkami (z kroku 1.2) okrągłe fragmenty za pomocą zdezynfekowanego wycinaka do korków o średnicy 1,12 cm i umieścić je wraz z filtrami wzbogaconymi standardem (z kroku 2.2) w wolnych od pirogenów probówkach o pojemności 2 ml (tj. probówkach z próbkami).
    2. Do probówek dodać 1 ml PFW i mieszać je przez 60 min w temperaturze pokojowej za pomocą wytrząsarki laboratoryjnej.
    3. Odwirować probówki z próbkami w mikrowirówce przy 375 x g przez 10 min.29
    4. Przenieść supernatant zawierający endotoksyny do nowej wolnej od pirogenów probówki o pojemności 2 ml.
  2. Test lizatu amebocytów Limulus (LAL)
    1. Oznaczyć stężenie endotoksyn w próbkach, wykonując test LAL w wolnej od pirogenów mikropłytce 96-dołkowej z płaskim dnem i pokrywką.
    2. Zaplanować układ płytki z wyprzedzeniem, zgodnie z Rysunkiem 1. Na każdej analizowanej płytce uwzględnić krzywą wzorcową przygotowaną bezpośrednio z roztworów standardowych endotoksyn Ed2-Ed11 (obejmującą tym samym zakres stężeń od 100 do 0,195 EU/ml (patrz sekcja 2.2)). Krzywa wzorcowa powinna zajmować dołki 1-10 w rzędach A i B płytki. Dołki 11-12 w tych rzędach przeznaczyć na próbki ślepe (łącznie cztery próby ślepe).
    3. Włączyć czytnik mikropłytek i zaprogramować go na reakcję kinetyczną obejmującą inkubację mikropłytki w 37 °C i wytrząsanie co 5 min, a następnie pomiary absorbancji przy 405 nm. Powtórzyć 18 razy przez 1,5 hr.
    4. Wyznaczyć wydajność ekstrakcji endotoksyn z filtrów z próbkami (tj. próbek otrzymanych z filtrów wzbogaconych standardem) poprzez podzielenie obliczonej ilości endotoksyn przez pierwotną ilość dodaną.
    5. Rozpocząć analizę, nanosząc 50 µl standardowych roztworów endotoksyn (z kroku 2.4.2), ekstraktu z filtra wzbogaconego i odpowiadających mu prób ślepych (z sekcji 2.3) lub próbek eksperymentalnych i ich prób ślepych (również z sekcji 2.3), zgodnie z zaplanowanym układem płytki (Rysunek 1), a następnie zamknąć pokrywę.
    6. Do każdego dołka szybko dodać 50 µl roztworu LAL i delikatnie potrząsnąć płytką poziomo, gdy znajduje się ona na stole, przed umieszczeniem jej w czytniku.
    7. Umieścić płytkę w czytniku i rozpocząć pomiar eksperymentalny.

Schemat układu mikropłytki; krzywe wzorcowe, badane próbki, kontrole z dodatkiem i kontrole ślepe.
Rycina 1: Płytka do analizy endotoksyn. Przykład układu analizy endotoksyn w mikropłytce 96-dołkowej.

3. Analiza genomiczna

Uwaga: W przypadku ekstrakcji DNA należy zdezynfekować powierzchnię roboczą 70% etanolem i używać wyłącznie sterylnych probówek, końcówek i odczynników. Do analizy DNA metodą q-PCR należy zdezynfekować powierzchnię roboczą preparatem do usuwania zanieczyszczeń DNA z powierzchni. Wszystkie odczynniki należy przygotować w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, przez cały czas pracując w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym.

  1. Przygotowanie starterów i sond DNA
    1. Przed ekstrakcją DNA należy zamówić komercyjnie dostępny zestaw starterów i sondę (jeśli stosowana jest metoda sondy hydrolitycznej) lub zaprojektować nowy zestaw starterów i sondę za pomocą komputerowych narzędzi do projektowania starterów.30
    2. Rehydratować startery zgodnie z protokołem producenta, używając albo 10 mM Tris-0.1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor TE), albo wody klasy PCR.
      Uwaga: Zaleca się rozpuszczenie początkowego stoku starterów PCR w buforze TE z niskim stężeniem EDTA (0,1%), co zapobiega degradacji starterów przy dłuższym przechowywaniu. Do kolejnych rozcieńczeń należy używać wody klasy PCR, aby zmniejszyć ilość EDTA, która mogłaby hamować reakcje PCR.
    3. Przygotować aliquoty po 50 µl lub 100 µl starterów i sondy w sterylnych probówkach 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
  2. Standardowa ocena stężenia komórek przed ekstrakcją DNA
    1. W probówce wirówkowej o odpowiedniej pojemności przygotować standardowy roztwór komórek badanego gatunku drobnoustrojów (probówka Od0, Tabela 2A). Wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując ją w górę i w dół w probówce 7-10 razy za pomocą pipety o małej średnicy otworu.
    2. Jeśli komórki są zabarwione (np. niektóre zarodniki grzybów), nie przeprowadzać procedury barwienia. Jeśli barwienie komórek jest wymagane, rozcieńczyć zawiesinę komórkową w odpowiednim barwniku do mikroskopowej detekcji badanych komórek.31
    3. Oczyścić szkiełko nakrywkowe i hemocytometr etanolem. Nawilżyć i przymocować szkiełko nakrywkowe do hemocytometru.
    4. Nanieść około 8 µl zawiesiny komórkowej do obu komór hemocytometru, ostrożnie dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego końcówką pipety i wypełniając komorę siłami kapilarnymi. Należy unikać przepełnienia lub niedopełnienia komory.
    5. Określić liczbę komórek, obserwując je pod mikroskopem przy powiększeniu 400X (obiektyw 40X i okular 10X). Powinny być widoczne dziewięć kwadratów o wymiarach 1 x 1 mm2, ułożonych w siatce 3 x 3. Ustawić ostrość mikroskopu na jednym z czterech narożnych kwadratów siatki (można użyć większego powiększenia). Kwadrat 1 x 1 mm2 powinien składać się z 16 mniejszych kwadratów.
    6. Policzyć wszystkie komórki w czterech narożnych kwadratach 1 x 1 mm2 oraz w kwadracie środkowym siatki 3 x 3. Jeśli komórek jest zbyt dużo lub zbyt mało, aby można je było policzyć, powtórzyć procedurę, odpowiednio zagęszczając lub rozcieńczając pierwotną zawiesinę komórkową (na pojedynczym obszarze 1 mm2 powinno znajdować się 15-50 komórek).
    7. Obliczyć stężenie komórek (komórki ml-1) w standardowej zawiesinie komórkowej Od0 na podstawie średniej liczby komórek z pięciu policzonych kwadratów według wzoru: Liczba komórek ml-1 = Średnia liczba komórek kwadrat-1 x Współczynnik rozcieńczenia x 104.
  3. Ocena wydajności ekstrakcji DNA
    1. Przygotować dziewięć sterylnych probówek 0,5 ml zgodnie z Tabelą 2A.
    2. Rozcieńczyć standardowy roztwór komórek (Od0) tak, aby zawierał około 107 komórek ml-1 w całkowitej objętości 20 µl (Od1).
    3. Dodać 18 µl sterylnej, wolnej od nukleaz wody klasy PCR (NFW) do probówek Od2-Od8 oraz 20 µl do probówki kontrolnej (blank) Od9.
    4. Przenieść 2 µl roztworu komórek z Od1 do Od2. Delikatnie wymieszać pipetą i przenieść 2 µl z probówki Od2 do Od3. Kontynuować rozcieńczanie komórek w ten sam sposób w kolejnych probówkach aż do probówki Od8 włącznie, aby uzyskać rozcieńczenie szeregowe od 107 do 100 komórek ml-1.
    5. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wyciąć 18 okrągłych fragmentów czystego, upieczonego wcześniej filtra, używając zdezynfekowanego wycinaka do korków o średnicy 1,12 cm. Umieścić filtry parami w sterylnych szalkach Petriego.
    6. Nanieść 10 µl z rozcieńczeń Od1-Od8 oraz z probówki kontrolnej Od9 na każdą z par filtrów, tak aby każdemu standardowemu stężeniu komórek odpowiadała jedna para filtrów.
    7. Pozostawić szalki Petriego otwarte pod dygestorium i pozostawić do wyschnięcia na 30 min.
    8. Umieścić każdy fragment filtra w sterylnej probówce 2 ml z nakrętką i wyekstrahować DNA zgodnie z procedurą szczegółowo opisaną w sekcji 3.4.
  4. Ekstrakcja DNA z filtrów eksperymentalnych i wzbogaconych
    Uwaga: Do ekstrakcji DNA z filtrów należy używać komercyjnych zestawów przeznaczonych do ekstrakcji DNA z gleby zgodnie z protokołem producenta z następującymi modyfikacjami.
    1. Dla każdej próbki filtra (Od1-Od8) przygotować mieszaninę szklanych kulek przemytych kwasem w sterylnej probówce 0,5 ml. Użyć 0,1 g kulek o średnicy 425-600 µm i 0,3 g kulek o średnicy ≤106 µm.
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wyciąć trzy okrągłe fragmenty z losowo wybranych miejsc na każdej próbce filtra, używając zdezynfekowanego wycinaka do korków o średnicy 1,12 cm, i umieścić je w probówkach 2 ml z nakrętką.
    3. Dodać mieszaninę szklanych kulek do probówek.
    4. Dodać do każdej probówki w komorze biologicznej bufor do lizy komórek dołączony do zestawu do ekstrakcji, w ilości wskazanej w protokole producenta.
    5. Przygotować naczynie z lodem i zniszczyć komórki mechanicznie za pomocą homogenizatora kulowego (bead beater).
    6. Homogenizować kulkami przez 1 min, a następnie umieścić w lodzie na 1 min. Powtórzyć pięciokrotnie.
    7. Kontynuować postępowanie zgodnie z protokołem dostawcy zestawu od etapu po lizie.
    8. Po elucji za pomocą dołączonego buforu elucyjnego (zawierającego bufor Tris 10 mM) lub NFW, ponownie przepuścić eluat przez kolumnę, aby zwiększyć wydajność DNA.
      Uwaga: Jeśli próbki nie są analizowane w tym samym dniu co ekstrakcja DNA, można je przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
A- Przygotowanie standardowych serii rozcieńczeń komórek
ProbetkaKońcowe stężenie komórek (kom./ml)-1)Standardowa objętość komórki (ml)Objętość wody wolnej od nukleaz (ml)Objętość całkowita (ml)
Od0wyznaczyć za pomocą komory licznikowej Hemocytometru
Od1powinno zostać eluowane do zakresu 107 komórek/ml-120
Od210-1 Od12 z Od11820
Od310-2 Od12 z Od21820
Od410-3 Od12 z Od31820
Od510-4 Od12 z Od41820
Od610-5 Od12 z Od51820
Od710-6 Od12 z Od61820
Od810-7 Od12 z Od71820
Puste002020
B- Przygotowanie krzywej wzorcowej DNA
ProbówkaKońcowe stężenie DNA (mg ml⁻¹)-1)Standardowa objętość DNA (ml)Objętość wody wolnej od nukleaz (ml)Objętość całkowita (ml)
Dd0wyznaczyć za pomocą NanoDrop
Dd1należy eluować do zakresu 101 mg/ml-120
Dd210-1 Dd12 z Dd11820
Dd310-2 Dd12 z Dd21820
Dd410-3 Dd12 z Dd31820
Dd510-4 Dd12 z Dd41820
Dd610-5 Dd12 z Dd51820
Dd710-6 Dd12 z Dd61820
Dd810-7 Dd12 z Dd71820
Puste002020

Tabela 2: Krzywa wzorcowa DNA. Seria rozcieńczeń komórek mikroorganizmów wzorcowych (A), w której określono objętość komórek wzorcowych, objętość NFW oraz objętość całkowitą w każdej probówce z rozcieńczeniem. Przygotowanie krzywej wzorcowej DNA (B), w której określono objętość wzorcowego DNA, objętość NFW oraz objętość całkowitą w każdej probówce z rozcieńczeniem.

  1. Przygotowanie krzywej standardowej DNA
    1. Wyekstrahować DNA bezpośrednio z próbki standardowej badanego mikroorganizmu (Dd0), stosując tę samą procedurę, która została opisana dla filtrów eksperymentalnych w kroku 3.4.
    2. Użyć spektrofotometru do oznaczenia stężenia DNA w standardowej próbce DNA (Dd0) przy 260 nm.
    3. Przygotować dziewięć sterylnych probówek o pojemności 0,5 ml do sporządzenia krzywej standardowej DNA, zgodnie z Tabelą 2B.
    4. W razie potrzeby rozcieńczyć standardowy roztwór DNA Dd0 do zakresu stężeń 1-10 µg ml-1 w pierwszej probówce (Dd1) do całkowitej objętości 20 µl.
    5. Dodać 18 µl NFW do probówek Dd2-Dd8 oraz 20 µl do probówki kontrolnej (blank).
    6. Przenieść 2 µl standardowego roztworu DNA z probówki Dd1 do Dd2. Delikatnie wymieszać pipetą, a następnie przenieść 2 µl z Dd2 do Dd3. Kontynuować rozcieńczanie DNA w ten sam sposób w kolejnych probówkach, aby uzyskać rozcieńczenia szeregowe od 100 do 10-7 w probówkach Dd2-Dd8 wraz z probówką kontrolną zawierającą tylko NFW.
      Uwaga: Jeśli analizy nie przeprowadzono w dniu ekstrakcji, próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
  2. Analiza Quantitative-PCR (qPCR)
    1. Włączyć urządzenie do q-PCR z wyprzedzeniem w celu jego rozgrzania.
    2. W nowym pliku programu wprowadzić szczegóły przebiegu q-PCR w oprogramowaniu sterującym urządzeniem, zgodnie z Tabelą 3.
      Uwaga: Różne urządzenia mają różny optymalny czas dla każdego etapu cyklu termicznego. Wartości te są określone w instrukcji obsługi urządzenia.
    3. Zdezynfekować powierzchnię roboczą środkiem do dekontaminacji DNA i pracować wyłącznie ze sterylnymi probówkami, końcówkami oraz odczynnikami.
    4. Przygotować pojemnik z lodem obok stanowiska pracy. Mieszaninę polimerazy Taq przechowywać w lodzie.
    5. Obliczyć całkowitą liczbę dołków reakcyjnych, które zostaną zajęte na płytce. Uwzględnić teoretyczny zapas na dodatkowe reakcje (5%) i pomnożyć zwiększoną liczbę reakcji przez objętość jednej reakcji, aby obliczyć całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej.
    6. Przygotować wspólną pulę reakcyjną, zaczynając od NFW, starterów, sondy, a na koniec mieszaniny polimerazy Taq. Przykład obliczeń objętości dla wspólnej puli znajduje się w Tabeli 4.
    7. Mieszaninę reakcyjną przechowywać w ciemności i w lodzie do momentu użycia.
    8. Nanieść 1 µl standardowego DNA, DNA z próbki lub NFW (jako kontrolę negatywną) do dołków w mikropłytce q-PCR w trzech powtórzeniach.
    9. Upewnić się, że płytka znajduje się w uchwycie, aby zapobiec jej dotykaniu powierzchni roboczej i zachować jej czystość.
    10. Dodać 9 µl wspólnej puli (Tabela 4) do każdego dołka reakcyjnego.
    11. Przykryć płytkę optyczną folią klejącą i szczelnie zamknąć ze wszystkich stron.
    12. Wirować płytkę w wirówce z adapterami do płytek przez 1 min przy 1 000 x g przed umieszczeniem jej w urządzeniu q-PCR.
    13. Włożyć płytkę do urządzenia i uruchomić program.
ParametrSzczegółyUwagi
Metoda detekcjiIlościowa sonda hydrolizacyjna
Warunki cyklu termicznego
Wstępna denaturacja i aktywacja enzymu95 °C przez 10 min
Denaturacja95 °C przez 15 secpowtórzyć 45 razy
Przyłączanie i elongacja60 °C przez 60 sec
Układ płytki
Krzywa wzorcowaDd1 - Dd83 powtórzenia na rozcieńczenie w studniach 1-8 w 3 górnych rzędach
Kontrola bez matrycy (NTC)Woda wolna od nukleaz (NFW)3 powtórzenia w 9th studni w 3 górnych rzędach
Analizowane próbkiDNA wyekstrahowane z filtrów3 powtórzenia na próbkę w pozostałych studniach
Zestaw starterówna każdą studnię
Objętość próbki10 ml

Tabela 3: Szczegóły dotyczące oprogramowania do q-PCR. Szczegóły parametrów analizy, które należy wprowadzić do pliku programu q-PCR.

OdczynnikObjętość na reakcję (ml)Liczba reakcjiMargines błędu (5%)Całkowita objętość mieszaniny (ml)
Mieszanina polimerazy Taq55052.5262.5
Starter F (10 mM) 0.55052.526.25
Starter R (10 mM)0.55052.526.25
Woda wolna od nukleaz 35052.5157.5
DNA – 1 ml zostanie dodane bezpośrednio do docelowych dołków w płytce 96-dołkowej.

Tabela 4: Obliczenia mieszaniny reakcyjnej do ilościowego PCR. Szczegółowo przedstawiono objętość na reakcję, liczbę reakcji, zapas na błędy oraz całkowitą obliczoną objętość każdego odczynnika do dodania do mieszaniny reakcyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powszechną praktyką w badaniu aerozoli atmosferycznych jest stosowanie analiz „off-line” pobranych filtrów (patrz Rycina 2).32 Analizy chemiczne pobranej materii obejmują zawartość związków organicznych (np. białek, cząsteczek węglowodorów, sacharydów) oraz nieorganicznych (np. metali, soli). Analizy biologiczne obejmują zawartość drobnoustrojów żywych i nieżyjących, identyfikację gatunków z wykorzystaniem metod analizy DNA lub mikroskopii, a ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy opisano metody ekstrakcji i wykrywania do ilościowego określania zarówno endotoksyn, jak i DNA obecnego w próbkach aerozoli pobranych na filtrach. Metody te wymagają dokładnych procedur i mogą być łatwo wykonane, o ile eksperymentator przestrzega kilku podstawowych i ważnych punktów omówionych tutaj.

Na etapie wykrywania endotoksyn należy pamiętać, że roztwór lizatu jest dość lepki i ma tendencję do wytwarzania pęcherzyków podczas pipetowania. Trudno jest usunąć te pęcherzyki, a prowad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Yoavowi Barakowi z Wydziału Chemii Instytutu Weizmanna za wsparcie i rady. Badanie to było wspierane przez Izraelską Fundację Naukową (grant # 913/12) oraz przez Fundację Minerva z finansowaniem z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr do pobierania próbek
HiVol 3000 - Próbnik powietrza o dużej objętościEcotech
Kwarcowe filtry z mikrofibryWhatman1851-865203 mm x 254 mm
ELF - Laboratoryjne piece komoroweCarboliteELF 11series
Folia aluminiowaOpal
< strong>NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Endotoxin
EtanolSigma Aldrich16368 Odczynnik laboratoryjny, 96%
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Airstream klasy II AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates of Cape Cod, Inc.T0051
Kontrola standardowej endotoksynyAssociates firmy Cape Cod, Inc.E0005-1Escherichia coli  O113:H10, 0,5 &mikro; g / fiolka 1 opakowanie Odczynnik
LAL WaterAssociates of Cape Cod, Inc.W0051
Sterylna strzykawka 10 ml z końcówką Luer-LokBecton-Dickinson & Co.
Igła do strzykawki BD PrecisionglideBecton-Dickinson & Co.305129Sterylne 
Taśma uszczelniająca Parafilm-MParafilmP7543Sigma Nr katalogowy
MikroprobówkiAxigenMCT-200-C2 ml, bez pirogenów
o średnicy 1,12 cm Świdrkorkowy Boekel Scientific1601 BD Series - StalCzęść zestawu świdrów korkowych zawierającego wiertła o różnych średnicach. 
50 mm Szalka PetriegoMiniplast Ein-Shemer72050-01Aseptyczny
Vortex Genie 2 Przemysł naukowy, inc.SI-0297
Mikrowirówka 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI z pokrywkąNunc167008Studzienki z płaskim dnem (z pokrywką (pakowane pojedynczo)), sterylne, wolne od pirogenów
Czytnik mikropłytek Synergy HT Multi-DetectionBiotek7091000
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
DNA
DNA awaySigma Aldrich7010
Standardowe DNA gatunków drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowaniaATCC lub inna kolekcjaAlbo odpowiedni szczep drobnoustrojów do ekstrakcji DNA, albo wyekstrahowane DNA
Ulepszony przez NeubauerahemocytometruMarienfeld640030
TE, Low EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8,0)  0,1 mM EDTA 
Woda bez nukleaz klasy PCR Sigma Aldrich3315959001
Startery PCRSigma AldrichUkierunkowane na interesujące gatunki drobnoustrojów
Podwójnie znakowane sondySigma AldrichUkierunkowane na interesujące gatunki drobnoustrojów
Probówki z nakrętkąAxigenST-200-SS2 ml 
Zestaw do ekstrakcji DNA PowerSoil Mo Bio Laboratories12888-100
Koraliki szklane, płukane kwasem 425-600 &mikro; mSigma AldrichG8772-100G
Koraliki szklane, myte kwasem < 106 &mikro; mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1Bufor do lizy komórek, zestaw Power Soil Wiadro
lód Magic TouchBel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlusApplied Biosystems4376600
Szybki SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4370048
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym, 0,1 mlApplied Biosystems4346906
MicroAmp Splash-Free 96-well BaseApplied Biosystems4312063
Optyczna foliasamoprzylepna MicroAmpApplied Biosystems4311971
Wirówka 5810 REppendorf5811 000.010Rotor A-4-62 z wiadrami MTP 
309605 kultur bufor na

Bibliografia

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza endotoksynekstrakcja DNApobieranie pr bek przez filtrpomiar turbidymetrycznyilo ciowy PCRrozdrabnianie kulkami szklanymiwoda wolna od pirogen wprotok wirowaniakomora z laminarnym przep ywem powietrzaczytnik mikrop ytek

Powiązane artykuły