Dwie uzupełniające analizy atmosferycznych cząstek biologicznych z filtrów próbek powietrza są opisane tutaj: ekstrakcja i wykrywanie endotoksyny oraz DNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania aerozoli na zewnątrz często wykorzystują cząstki stałe pobierane na filtrach. Procedura ta umożliwia równoległe wykonywanie różnych charakterystyk zebranych cząstek. Celem przedstawionej metody jest uzyskanie wysoce dokładnej i wiarygodnej analizy zawartości endotoksyn i DNA w bioaerozolach wyekstrahowanych z filtrów. Ekstrakcja cząsteczek organicznych o dużej masie cząsteczkowej, takich jak lipopolisacharydy, z próbek filtrów polega na wytrząsaniu próbki w wolnym od pirogenów środowisku na bazie wody. Dalsza analiza opiera się na reakcji enzymatycznej, którą można wykryć za pomocą pomiaru mętnościowego. Ze względu na wysoką zawartość substancji organicznych w próbkach filtrów, ekstrakcja DNA z próbek odbywa się przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, który został pierwotnie zaprojektowany dla gleb i zmodyfikowany w celu poprawy wydajności DNA. Opisano wykrywanie i kwantyfikację określonych gatunków drobnoustrojów za pomocą ilościowej analizy łańcuchowej reakcji polimerazy (q-PCR) i porównano je z innymi dostępnymi metodami.
Wprowadzenie
Pobieranie próbek powietrza na filtrach jest podstawowym narzędziem w badaniach aerozoli atmosferycznych. 1 Próbkowane filtry są punktem wyjścia dla różnych charakterystyk chemicznych, fizycznych i biologicznych zebranych cząstek otoczenia. 2-11 Zaletą tego podejścia jest to, że różne analizy mogą być wykonywane off-line na tej samej próbce. Zestawienie danych z różnych analiz umożliwia badaczowi dobre zrozumienie charakterystyki zebranych cząstek i pomaga w rozwiązywaniu złożonych problemów w naukach o atmosferze. 12,13 Na przykład próbki powietrza morskiego i śródlądowego pobrane w tym samym okresie można porównać pod względem toksyc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Szczegółowa lista wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole znajduje się w sekcji Materiały.
1. Pobieranie próbek powietrza na filtry
- Przygotowanie filtrów
- Do poboru próbek o dużej objętości należy użyć filtrów o wymiarach 20,3 x 25,4 cm2. Wybierz rodzaj filtra, który najlepiej odpowiada potrzebom badawczym, a także odpowiednią wielkość porów (cut-off), jeśli jest to wymagane.1 W tym przypadku należy zastosować kwarcowe filtry z mikrowłókien.
- Filtry przeznaczone do poboru związków organicznych i biologicznych należy uprzednio wypalić, aby usunąć pozostałości ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Powszechną praktyką w badaniu aerozoli atmosferycznych jest stosowanie analiz „off-line” pobranych filtrów (patrz Rycina 2).32 Analizy chemiczne pobranej materii obejmują zawartość związków organicznych (np. białek, cząsteczek węglowodorów, sacharydów) oraz nieorganicznych (np. metali, soli). Analizy biologiczne obejmują zawartość drobnoustrojów żywych i nieżyjących, identyfikację gatunków z wykorzystaniem metod analizy DNA lub mikroskopii, a .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W pracy opisano metody ekstrakcji i wykrywania do ilościowego określania zarówno endotoksyn, jak i DNA obecnego w próbkach aerozoli pobranych na filtrach. Metody te wymagają dokładnych procedur i mogą być łatwo wykonane, o ile eksperymentator przestrzega kilku podstawowych i ważnych punktów omówionych tutaj.
Na etapie wykrywania endotoksyn należy pamiętać, że roztwór lizatu jest dość lepki i ma tendencję do wytwarzania pęcherzyków podczas pipetowania. Trudno jest usunąć te pęcherzyki, a prowad.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują dr Yoavowi Barakowi z Wydziału Chemii Instytutu Weizmanna za wsparcie i rady. Badanie to było wspierane przez Izraelską Fundację Naukową (grant # 913/12) oraz przez Fundację Minerva z finansowaniem z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Filtr do pobierania próbek | |||
| HiVol 3000 - Próbnik powietrza o dużej objętości | Ecotech | ||
| Kwarcowe filtry z mikrofibry | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Laboratoryjne piece komorowe | Carbolite | ELF 11series | |
| Folia aluminiowa | Opal | ||
| < strong>Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Endotoxin | |||
| Etanol | Sigma Aldrich | 16368 | Odczynnik laboratoryjny, 96% |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego Airstream klasy II AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Kontrola standardowej endotoksyny | Associates firmy Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0,5 &mikro; g / fiolka 1 opakowanie Odczynnik |
| LAL Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| Sterylna strzykawka 10 ml z końcówką Luer-Lok | Becton-Dickinson & Co. | ||
| Igła do strzykawki BD Precisionglide | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterylne |
| Taśma uszczelniająca Parafilm-M | Parafilm | P7543 | Sigma Nr katalogowy |
| Mikroprobówki | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, bez pirogenów |
| o średnicy 1,12 cm Świdr | korkowy Boekel Scientific | 1601 BD Series - Stal | Część zestawu świdrów korkowych zawierającego wiertła o różnych średnicach. |
| 50 mm Szalka Petriego | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptyczny |
| Vortex Genie 2 | Przemysł naukowy, inc. | SI-0297 | |
| Mikrowirówka 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI z pokrywką | Nunc | 167008 | Studzienki z płaskim dnem (z pokrywką (pakowane pojedynczo)), sterylne, wolne od pirogenów |
| Czytnik mikropłytek Synergy HT Multi-Detection | Biotek | 7091000 | |
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standardowe DNA gatunków drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania | ATCC lub inna kolekcja | Albo odpowiedni szczep drobnoustrojów do ekstrakcji DNA, albo wyekstrahowane DNA | |
| Ulepszony przez Neubauera | hemocytometru | Marienfeld | 640030 |
| TE, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 mM EDTA |
| Woda bez nukleaz klasy PCR | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| Startery PCR | Sigma Aldrich | Ukierunkowane na interesujące gatunki drobnoustrojów | |
| Podwójnie znakowane sondy | Sigma Aldrich | Ukierunkowane na interesujące gatunki drobnoustrojów | |
| Probówki z nakrętką | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| Zestaw do ekstrakcji DNA PowerSoil | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Koraliki szklane, płukane kwasem 425-600 &mikro; m | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Koraliki szklane, myte kwasem < 106 &mikro; m | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Bufor do lizy komórek, zestaw Power Soil Wiadro |
| lód Magic Touch | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Szybki SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym, 0,1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| Optyczna folia | samoprzylepna MicroAmpApplied Biosystems | 4311971 | |
| Wirówka 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 z wiadrami MTP |
Bibliografia
- Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
