Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Summary

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Abstract

Produkcja wydzielanych białek ssaków do badań strukturalnych i biofizycznych może być wyzwaniem, czasochłonnym i kosztownym. Opisano tutaj efektywny czasowo i kosztowo protokół ekspresji wydzielanych białek w komórkach ssaków i jednoetapowego oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa do niklu. System opiera się na transfekcji przejściowej na dużą skalę komórek ssaków w zawiesinie, co znacznie skraca czas produkcji białka, ponieważ eliminuje etapy, takie jak rozwój wirusów ekspresyjnych lub generowanie stabilnych linii komórkowych o ekspresji. Protokół ten wykorzystuje tanie środki do transfekcji, które można łatwo wytworzyć za pomocą prostej modyfikacji chemicznej, lub środki do transfekcji o umiarkowanej cenie, które zwiększają wydajność poprzez zwiększenie wydajności transfekcji i zmniejszenie cytotoksyczności. Staranne monitorowanie i utrzymywanie poziomu glukozy w pożywce zwiększa wydajność białka. Kontrolowanie dojrzewania natywnych glikanów na etapie ekspresji zwiększa końcową wydajność prawidłowo pofałdowanych i funkcjonalnych białek ssaków, które są idealnymi właściwościami do prowadzenia krystalografii rentgenowskiej. W niektórych przypadkach jednoetapowe oczyszczanie wytwarza białko o czystości wystarczającej do krystalizacji, co pokazano tutaj jako przykład.

Introduction

Zrozumienie struktury białek na poziomie atomowym jest kluczem do odkrycia molekularnych podstaw biologicznych szlaków i chorób. Rentgenowska krystalografia białek jest najpowszechniej stosowaną/aplikacyjną metodą określania struktur makromolekularnych. Głównym wyzwaniem tej metody jest uzyskanie odpowiedniej ilości odpowiednio sfałdowanego, czystego białka. Staje się to problemem szczególnie podczas pracy z wydzielanymi białkami ssaków, które podlegają specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym.

Białka o ekspresji bakteryjnej są głównym źródłem skrystalizowanych białek zdeponowanych w Banku Danych Białkowych¹. Bakteryjne systemy ekspresji są w dużej mierze preferowane, ponieważ są szybkie, niedrogie i zazwyczaj dają wysokie plony białka. Jednak zewnątrzkomórkowe domeny białek ssaków ulegające ekspresji u bakterii często nie są prawidłowo pofałdowane, w którym to przypadku do uzyskania jednorodnie pofałdowanego białka wymagane jest ponowne fałdowanie i rozległe etapy oczyszczania. Ponadto wiele białek ssaków wymaga glikozylacji potranslacyjnej, aby osiągnąć prawidłowe fałdowanie². Chociaż ekspresja i glikozylacja w komórkach drożdży lub owadów mogą przezwyciężyć problem fałdowania, modyfikacje potranslacyjne, w tym glikozylacja, różnią się znacznie od tych w komórkach ssaków³, dając białka o nieprawidłowych lub niejednorodnych modyfikacjach.

Komórki ssaków wyrażają wszystkie wymagane molekularne mechanizmy, aby zapewnić prawidłowe modyfikacje potranslacyjne i fałdowanie; jednak te systemy ekspresji nie są zazwyczaj preferowane przez większość laboratoriów, ze względu na ograniczoną wydajność i wysokie koszty odczynników i materiałów eksploatacyjnych. Polietylenoimina, standardowy odczynnik do transfekcji, jest stosunkowo tania, ale narzuca znaczną cytotoksyczność i niską skuteczność transfekcji, co skutkuje zwiększonymi kosztami pożywek komórkowych, DNA i sprzętu do hodowli. Wiele alternatyw dla PEI jest zbyt drogich. Rozwiązujemy te problemy, opisując połączenie ulepszonych narzędzi do hodowli komórkowej i chemicznie zmodyfikowanego PEI w celu uzyskania szybkiej i stosunkowo niedrogiej metody ekspresji wydzielanych białek ssaków, po której następuje jednoetapowe oczyszczanie. Ta solidna metoda daje wystarczającą wydajność do badań funkcjonalnych i biochemicznych⁴, a w niektórych przypadkach daje białko podatne na krystalizację bez dalszego oczyszczania.

Ten protokół opisuje kilka technik maksymalizacji ekspresji i wydajności wydzielanych białek ssaków w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) 293F hodowanych w zawiesinie. Wydajność (i koszt) transfekcji, produkcja i oczyszczanie białek są znacznie zwiększone dzięki przestrzeganiu tego protokołu. PEI modyfikowany przez dodanie karbaminianów w jednoetapowej reakcji otwarcia pierścienia (PEI-TMC-25, synteza i właściwości opisane szczegółowo w ref ⁵) znacznie poprawia wydajność transfekcji, zmniejsza cytotoksyczność wynikającą z rozerwania błony kationowej i odpowiednio zmniejsza koszty eksperymentu. Co więcej, żywotność komórek i ekspresja białek ulegają znacznej poprawie dzięki dodaniu suplementów hodowlanych w celu dostarczenia glukozy i witamin. Co ważne dla produkcji białek glikozylowanych, leczenie kifunensyną, nietoksycznym inhibitorem chemicznym mannozydazy I, wytwarza białka z określonymi, niedojrzałymi glikanami, które mogą być usunięte przez endoglikozydazę EndoHf w celu uzyskania białek z pojedynczą N-acetyloglukozaminą zamiast pełnej długości glikanu związanego z N⁶. Wreszcie, wydzielanie białek do niezawierającej surowicy, chemicznie zdefiniowanej pożywki umożliwia szybkie i łatwe oczyszczanie do badań strukturalnych i biochemicznych. Jednoetapowe oczyszczanie żywicy kwasem niklowo-azotryoctowym (Ni-NTA) usuwa większość zanieczyszczeń w supernatancie, a w niektórych przypadkach może dać białko o czystości wystarczającej do krystalizacji.

Protocol

1. Produkcja miligramowych ilości plazmidowego DNA do transfekcji przejściowej na dużą skalę

1. Sklonuj białko będące przedmiotem zainteresowania do wektora ekspresji ssaków o wysokiej liczbie kopii, stosując klonowanie miejsca restrykcji lub inną odpowiednią technikę.
   1. Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj wektora pHLsec ⁷, który ma wbudowany C-końcowy znacznik 6His, silną sekwencję Kozaka promotora i zoptymalizowany sygnał wydzielania.
2. Przekształć plazmid w kompetentne komórki.
   1. Dodać 20 μl kompetentnych komórek E. coli do 1 μg plazmidowego DNA i inkubować na lodzie przez 30 minut.
   2. Komórki szoku cieplnego w temperaturze 42 °C przez 35 sekund, a następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.
   3. Dodać 300 μl pożywki do wzrostu drobnoustrojów (SOC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.
   4. Płytki komórkowe na płytce agarowej z odpowiednim doborem antybiotyków.
      1. Użyj 100 μg/ml karbenicyliny, jeśli plazmid znajduje się w wektorze pHLsec.
3. Hodowla kolonii w 250 ml bulionu Luria (LB) Podłoże uzupełnione 100 μg/ml antybiotyku (karbenicyliny) O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 220 obr./min.
4. Oczyść DNA z hodowli za pomocą zestawu Hi-Speed Plasmid Maxi Kit zgodnie z protokołem producenta.
   1. Eluować DNA w buforze EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), zamiast buforu TE.
   2. Podwielokrotnić oczyszczony plazmid w ilości potrzebnej do transfekcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Hodowla na dużą skalę i transfekcja przejściowa komórek 293F

1. Uzupełnij 1 L 293F pożywki z 10 ml glutaminy i 5 ml Pen/Strep (oba 100x). Przechowywać w temperaturze 4 °C. 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca ma wystarczającą moc w warunkach bez surowicy, a zmniejszone stężenie antybiotyku poprawia żywotność komórek podczas transfekcji, co poprawia wydajność białka.
2. Hodowla komórek 293F w 300 ml pożywce w 1 l poliwęglanowym kolbach Erlenmeyera z wentylowanymi nakrętkami w temperaturze 37 °C z 8% CO_{2 podczas} wytrząsania w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych.
3. Rozcieńczyć komórki do gęstości 5 x 10⁵/ml na jeden dzień przed transfekcją.
4. W dniu transfekcji należy uzupełnić pożywkę hodowlaną, dodając 10% objętości 2% w/v Cell Boost w pożywce 293F.
   1. Zmierz stężenie glukozy za pomocą glukometru zgodnie z instrukcją producenta i w razie potrzeby stosuj suplementy, aby osiągnąć stężenie glukozy 500 mg/dl.
5. Na tym etapie dodać kifunenzynę (1 μg/ml stężenie końcowe) w celu kontrolowania glikozylacji białek.
6. Obliczyć objętość DNA wymaganą dla 1 μg plazmidu na 1 x 10⁶ komórek. W sterylnych warunkach rozcieńczyć DNA w 5 ml pożywki bez surowicy.
7. Obliczyć objętość odczynnika do transfekcji wymaganą dla 1 μg plazmidu na 2 μl odczynnika do transfekcji. W sterylnych warunkach rozcieńczyć odczynnik do transfekcji (PEI-TMC-25) w 5 ml pożywki wolnej od surowicy.
8. Dodawać odczynnik do transfekcji do roztworu DNA w odstępach co 1 ml, delikatnie mieszając. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej do powstania kompleksów odczynnik-DNA. Następnie dodaj roztwór do komórek kroplami.
9. Pozwól transfekowanym komórkom na ekspresję białka przez 72-96 godzin. Uzupełnij ~10% objętości Cell Boost Media codziennie lub w razie potrzeby, aby utrzymać odczyt glukozy na poziomie 400-600 mg / dl.

3. Oczyszczanie

1. Zdekantować kulturę do kolby wirówkowej, wirować przez 20 minut przy 1 300 x g w celu osadzenia komórek, a następnie zebrać supernatant. W razie potrzeby odwirować po raz drugi i/lub użyć filtra 0,22 μm do sklarowania supernatantu.
2. Dodaj 10% objętości 10x bufor wiążący Ni-NTA (1,5 M NaCl, 0,5 M K₂HPO₄, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol).
3. Przygotować kolumnę grawitacyjną, dodając 2 ml zawiesiny Ni-NTA do kolumny i równoważąc z 10 objętościami kolumny (CV) 1x buforu wiążącego. Jeśli to możliwe, wszystkie stopnie kolumny należy wykonywać w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C. Alternatywnie, schłodź białko i wszystkie na lodzie przed krokiem kolumny i utrzymuj białko i zebrane przepływy na lodzie.
   Uwaga: Gnojowica Ni-NTA składa się w 50% z żywicy objętościowo, a podana przez producenta zdolność wiązania wynosi 50 mg / ml. Koraliki Ni-NTA mogą być ładowane do wielu zastosowań
4. Przelej supernatant na żywicę i zbierz przepływ. Powtórz ten krok.
5. Przemyć 10 CV buforu do przemywania (300 mM NaCl, 50 mM K₂HPO₄, 20 mM imidazol pH 8).
6. Eluować białko w 5 CV buforu elucyjnego (300 mM NaCl, 50 mM K₂HPO₄, 250 mM imidazol pH 8).
7. Jeśli wymagana jest deglikozylacja:
   1. Aby uzyskać końcową objętość 0,5 ml, zagęścić eluację do 0,43 ml za pomocą koncentratora wirówkowego. Jeśli dojdzie do powstania osadów, wszelkie zanieczyszczenia należy rozdrobnić przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
   2. Dodać 50 μl 500 mM na-cytrynianu o pH 5,5.
   3. Dodać 20 μl EndoHf (1 x 10⁶ j./ml). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godz.
      Uwaga: Enzym działa optymalnie w temperaturze 37 °C, co może powodować agregację skoncentrowanego białka. Przedłużyć inkubację RT, jeśli deglikozylacja, oceniana za pomocą SDS-PAGE lub immunoblottingu, jest niekompletna. Enzym nie wykazuje aktywności w temperaturze 4 °C.
   4. Aby usunąć EndoHf: Przemyj żywicę amylozową 3x w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub końcowym buforze do przechowywania. Inkubować białko z żywicą przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g, aby zebrać granulki i zebrać supernatant.
   5. Zagęścić białko za pomocą odpowiedniego filtra wirującego odcinającego masę cząsteczkową i wymiany buforu do buforu magazynowego (150 mM NaCl i 20 mM HEPES pH 7,5).

Results

Oto wyniki tego systemu ekspresji zastosowanego do wydzielanej domeny immunoglobiny (Ig) o sile 13 kDa z receptora wyzwalającego białko ludzkie, które ulega ekspresji na komórkach szpikowych 2 (hTREM2, reszty 19-132). TREM2 jest białkiem transbłonowym typu I zawierającym pojedynczą zewnątrzkomórkową domenę Ig, która ma dwa wiązania dwusiarczkowe i dwa miejsca glikozylacji sprzężone z N. W przeciwieństwie do wielu innych białek domeny Ig⁸, TREM2 nie był podatny na ponowne fałdowanie z ciał inkluzyjnych bakterii...

Discussion

Komórki HEK 293F oferują solidną produkcję białek wymagających modyfikacji potranslacyjnych. System ten umożliwia szybką i skalowalną ekspresję natywnie pofałdowanych białek zawierających dwusiarczki, glikozylację i fosforylację, które w przeciwnym razie byłyby nieobecne przy użyciu bardziej rutynowych narzędzi do ekspresji. Ponadto system ten może być używany do ekspresji i oczyszczania kompleksów wielobiałkowych po prostu poprzez kotransfekcję wielu plazmidów. Oprócz TREM2, system ten był szeroko stosowany do badań fun...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kolby hodowlane	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Stosować zamiast
odczynnika do transfekcji	Oz Biosciences	HY01500
293odczynnik do transfekcji fektyn	Life Technologies
Odczynnik do transfekcji PEI	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Żywica amyloza	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Suplement do hodowli komórkowych
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	System monitorowania glukozy
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Pożywka wolna od surowicy do transfekcji DNA
Bulion Luria (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Kompetentne komórki	Sigma-Aldrich	G2919