Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Zrozumienie struktury białek na poziomie atomowym jest kluczem do odkrycia molekularnych podstaw biologicznych szlaków i chorób. Rentgenowska krystalografia białek jest najpowszechniej stosowaną/aplikacyjną metodą określania struktur makromolekularnych. Głównym wyzwaniem tej metody jest uzyskanie odpowiedniej ilości odpowiednio sfałdowanego, czystego białka. Staje się to problemem szczególnie podczas pracy z wydzielanymi białkami ssaków, które podlegają specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym.

Białka o ekspresji bakteryjnej są głównym źródłem skrystalizowanych białek zdeponowanych w Banku Danych Białkowych¹. Bakteryjne systemy ekspresji są w dużej mierze preferowane, ponieważ są szybkie, niedrogie i zazwyczaj dają wysokie plony białka. Jednak zewnątrzkomórkowe domeny białek ssaków ulegające ekspresji u bakterii często nie są prawidłowo pofałdowane, w którym to przypadku do uzyskania jednorodnie pofałdowanego białka wymagane jest ponowne fałdowanie i rozległe etapy oczyszczania. Ponadto wiele białek ssaków wymaga glikozylacji potranslacyjnej, aby osiągnąć prawidłowe fałdowanie². Chociaż ekspresja i glikozylacja w komórkach drożdży lub owadów mogą przezwyciężyć problem fałdowania, modyfikacje potranslacyjne, w tym glikozylacja, różnią się znacznie od tych w komórkach ssaków³, dając białka o nieprawidłowych lub niejednorodnych modyfikacjach.

Komórki ssaków wyrażają wszystkie wymagane molekularne mechanizmy, aby zapewnić prawidłowe modyfikacje potranslacyjne i fałdowanie; jednak te systemy ekspresji nie są zazwyczaj preferowane przez większość laboratoriów, ze względu na ograniczoną wydajność i wysokie koszty odczynników i materiałów eksploatacyjnych. Polietylenoimina, standardowy odczynnik do transfekcji, jest stosunkowo tania, ale narzuca znaczną cytotoksyczność i niską skuteczność transfekcji, co skutkuje zwiększonymi kosztami pożywek komórkowych, DNA i sprzętu do hodowli. Wiele alternatyw dla PEI jest zbyt drogich. Rozwiązujemy te problemy, opisując połączenie ulepszonych narzędzi do hodowli komórkowej i chemicznie zmodyfikowanego PEI w celu uzyskania szybkiej i stosunkowo niedrogiej metody ekspresji wydzielanych białek ssaków, po której następuje jednoetapowe oczyszczanie. Ta solidna metoda daje wystarczającą wydajność do badań funkcjonalnych i biochemicznych⁴, a w niektórych przypadkach daje białko podatne na krystalizację bez dalszego oczyszczania.

Ten protokół opisuje kilka technik maksymalizacji ekspresji i wydajności wydzielanych białek ssaków w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) 293F hodowanych w zawiesinie. Wydajność (i koszt) transfekcji, produkcja i oczyszczanie białek są znacznie zwiększone dzięki przestrzeganiu tego protokołu. PEI modyfikowany przez dodanie karbaminianów w jednoetapowej reakcji otwarcia pierścienia (PEI-TMC-25, synteza i właściwości opisane szczegółowo w ref ⁵) znacznie poprawia wydajność transfekcji, zmniejsza cytotoksyczność wynikającą z rozerwania błony kationowej i odpowiednio zmniejsza koszty eksperymentu. Co więcej, żywotność komórek i ekspresja białek ulegają znacznej poprawie dzięki dodaniu suplementów hodowlanych w celu dostarczenia glukozy i witamin. Co ważne dla produkcji białek glikozylowanych, leczenie kifunensyną, nietoksycznym inhibitorem chemicznym mannozydazy I, wytwarza białka z określonymi, niedojrzałymi glikanami, które mogą być usunięte przez endoglikozydazę EndoHf w celu uzyskania białek z pojedynczą N-acetyloglukozaminą zamiast pełnej długości glikanu związanego z N⁶. Wreszcie, wydzielanie białek do niezawierającej surowicy, chemicznie zdefiniowanej pożywki umożliwia szybkie i łatwe oczyszczanie do badań strukturalnych i biochemicznych. Jednoetapowe oczyszczanie żywicy kwasem niklowo-azotryoctowym (Ni-NTA) usuwa większość zanieczyszczeń w supernatancie, a w niektórych przypadkach może dać białko o czystości wystarczającej do krystalizacji.

1. Produkcja miligramowych ilości plazmidowego DNA do transfekcji przejściowej na dużą skalę

1. Sklonuj białko będące przedmiotem zainteresowania do wektora ekspresji ssaków o wysokiej liczbie kopii, stosując klonowanie miejsca restrykcji lub inną odpowiednią technikę.
   1. Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj wektora pHLsec ⁷, który ma wbudowany C-końcowy znacznik 6His, silną sekwencję Kozaka promotora i zoptymalizowany sygnał wydzielania.
2. Przekształć plazmid w kompetentne komórki.
   1. Dodać 20 μl kompetentnych komórek E. coli do 1 μg plazmidowego DNA i inkubować na lodzie przez 30 minut.
   2. Komórki szoku cieplnego w temperaturze 42 °C przez 35 sekund, a następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.
   3. Dodać 300 μl pożywki do wzrostu drobnoustrojów (SOC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.
   4. Płytki komórkowe na płytce agarowej z odpowiednim doborem antybiotyków.
      1. Użyj 100 μg/ml karbenicyliny, jeśli plazmid znajduje się w wektorze pHLsec.
3. Hodowla kolonii w 250 ml bulionu Luria (LB) Podłoże uzupełnione 100 μg/ml antybiotyku (karbenicyliny) O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 220 obr./min.
4. Oczyść DNA z hodowli za pomocą zestawu Hi-Speed Plasmid Maxi Kit zgodnie z protokołem producenta.
   1. Eluować DNA w buforze EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), zamiast buforu TE.
   2. Podwielokrotnić oczyszczony plazmid w ilości potrzebnej do transfekcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Hodowla na dużą skalę i transfekcja przejściowa komórek 293F

1. Uzupełnij 1 L 293F pożywki z 10 ml glutaminy i 5 ml Pen/Strep (oba 100x). Przechowywać w temperaturze 4 °C. 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca ma wystarczającą moc w warunkach bez surowicy, a zmniejszone stężenie antybiotyku poprawia żywotność komórek podczas transfekcji, co poprawia wydajność białka.
2. Hodowla komórek 293F w 300 ml pożywce w 1 l poliwęglanowym kolbach Erlenmeyera z wentylowanymi nakrętkami w temperaturze 37 °C z 8% CO_{2 podczas} wytrząsania w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych.
3. Rozcieńczyć komórki do gęstości 5 x 10⁵/ml na jeden dzień przed transfekcją.
4. W dniu transfekcji należy uzupełnić pożywkę hodowlaną, dodając 10% objętości 2% w/v Cell Boost w pożywce 293F.
   1. Zmierz stężenie glukozy za pomocą glukometru zgodnie z instrukcją producenta i w razie potrzeby stosuj suplementy, aby osiągnąć stężenie glukozy 500 mg/dl.
5. Na tym etapie dodać kifunenzynę (1 μg/ml stężenie końcowe) w celu kontrolowania glikozylacji białek.
6. Obliczyć objętość DNA wymaganą dla 1 μg plazmidu na 1 x 10⁶ komórek. W sterylnych warunkach rozcieńczyć DNA w 5 ml pożywki bez surowicy.
7. Obliczyć objętość odczynnika do transfekcji wymaganą dla 1 μg plazmidu na 2 μl odczynnika do transfekcji. W sterylnych warunkach rozcieńczyć odczynnik do transfekcji (PEI-TMC-25) w 5 ml pożywki wolnej od surowicy.
8. Dodawać odczynnik do transfekcji do roztworu DNA w odstępach co 1 ml, delikatnie mieszając. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej do powstania kompleksów odczynnik-DNA. Następnie dodaj roztwór do komórek kroplami.
9. Pozwól transfekowanym komórkom na ekspresję białka przez 72-96 godzin. Uzupełnij ~10% objętości Cell Boost Media codziennie lub w razie potrzeby, aby utrzymać odczyt glukozy na poziomie 400-600 mg / dl.

3. Oczyszczanie

1. Zdekantować kulturę do kolby wirówkowej, wirować przez 20 minut przy 1 300 x g w celu osadzenia komórek, a następnie zebrać supernatant. W razie potrzeby odwirować po raz drugi i/lub użyć filtra 0,22 μm do sklarowania supernatantu.
2. Dodaj 10% objętości 10x bufor wiążący Ni-NTA (1,5 M NaCl, 0,5 M K₂HPO₄, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol).
3. Przygotować kolumnę grawitacyjną, dodając 2 ml zawiesiny Ni-NTA do kolumny i równoważąc z 10 objętościami kolumny (CV) 1x buforu wiążącego. Jeśli to możliwe, wszystkie stopnie kolumny należy wykonywać w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C. Alternatywnie, schłodź białko i wszystkie na lodzie przed krokiem kolumny i utrzymuj białko i zebrane przepływy na lodzie.
   Uwaga: Gnojowica Ni-NTA składa się w 50% z żywicy objętościowo, a podana przez producenta zdolność wiązania wynosi 50 mg / ml. Koraliki Ni-NTA mogą być ładowane do wielu zastosowań
4. Przelej supernatant na żywicę i zbierz przepływ. Powtórz ten krok.
5. Przemyć 10 CV buforu do przemywania (300 mM NaCl, 50 mM K₂HPO₄, 20 mM imidazol pH 8).
6. Eluować białko w 5 CV buforu elucyjnego (300 mM NaCl, 50 mM K₂HPO₄, 250 mM imidazol pH 8).
7. Jeśli wymagana jest deglikozylacja:
   1. Aby uzyskać końcową objętość 0,5 ml, zagęścić eluację do 0,43 ml za pomocą koncentratora wirówkowego. Jeśli dojdzie do powstania osadów, wszelkie zanieczyszczenia należy rozdrobnić przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
   2. Dodać 50 μl 500 mM na-cytrynianu o pH 5,5.
   3. Dodać 20 μl EndoHf (1 x 10⁶ j./ml). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godz.
      Uwaga: Enzym działa optymalnie w temperaturze 37 °C, co może powodować agregację skoncentrowanego białka. Przedłużyć inkubację RT, jeśli deglikozylacja, oceniana za pomocą SDS-PAGE lub immunoblottingu, jest niekompletna. Enzym nie wykazuje aktywności w temperaturze 4 °C.
   4. Aby usunąć EndoHf: Przemyj żywicę amylozową 3x w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub końcowym buforze do przechowywania. Inkubować białko z żywicą przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g, aby zebrać granulki i zebrać supernatant.
   5. Zagęścić białko za pomocą odpowiedniego filtra wirującego odcinającego masę cząsteczkową i wymiany buforu do buforu magazynowego (150 mM NaCl i 20 mM HEPES pH 7,5).

Oto wyniki tego systemu ekspresji zastosowanego do wydzielanej domeny immunoglobiny (Ig) o sile 13 kDa z receptora wyzwalającego białko ludzkie, które ulega ekspresji na komórkach szpikowych 2 (hTREM2, reszty 19-132). TREM2 jest białkiem transbłonowym typu I zawierającym pojedynczą zewnątrzkomórkową domenę Ig, która ma dwa wiązania dwusiarczkowe i dwa miejsca glikozylacji sprzężone z N. W przeciwieństwie do wielu innych białek domeny Ig8, TREM2 nie był podatny na ponowne fałdowanie z ciał inkluzyjnych bakterii9. Późniejsza mutageneza potwierdziła, że glikany sprzężone z N są wymagane do prawidłowej ekspresji i fałdowania. Aby ułatwić badania strukturalne i funkcjonalne, TREM2 wprowadzono do wektora pHLsec z C-końcowym znacznikiem 6His-tag7 przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Przejściowa ekspresja w HEK293F komórkach traktowanych kifunenzyną dała białko, które oczyszczono za pomocą chromatografii Ni-NTA (Figura 1B, tor 2), a następnie próbkę zdeglikozylowano, aby wytworzyć natywnie pofałdowane, jednorodne białko (Figura 1B, ścieżka 3). Ekspresja 293F TREM2 wytwarzała 5-10 mg / L (5-10 μg / milion transfekowanych komórek). Po wymianie buforu do bufora magazynowego, białko to uległo krystalizacji (ryc. 1C). Pomimo końcowej czystości około 80%, kryształy te niezawodnie się rozmnażały, załamywały i wykazano, że srebrne barwienie zawiera tylko białko TREM2 (ryc. 1D). Obserwacja ta sugeruje, że biochemiczna jednorodność białka (tj. fałdowanie i modyfikacje potranslacyjne) może w niektórych przypadkach być bardziej krytyczna dla powodzenia krystalizacji niż ogólna czystość.

Oprócz krystalizacji, ten system oferuje solidne narzędzie do badań strukturalnych i funkcjonalnych. Jest wykorzystywany do produkcji natywnie glikozylowanego białka i osiągania czystości >95% za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar (Figura 1E, F). Ten dodatkowy etap oczyszczania, który pokazuje zachowanie białka w roztworze, jest również idealnym sposobem monitorowania jakości białka. Oczyszczone białko powinno wymuwać się w objętości odpowiadającej jego masie cząsteczkowej i powinno być najliczniej występującym gatunkiem w próbce. Nienormalnie duże ilości zagregowanego białka mogą wskazywać na niestabilne białko i dostarczać wskazówek dotyczących optymalizacji produkcji i oczyszczania białka. Co więcej, to końcowe oczyszczone białko jest doskonałe do wykorzystania w ilościowych eksperymentach biofizycznych, takich jak spektroskopia dichroizmu kołowego, stabilność termiczna i badanie interakcji białko-ligand. Wreszcie, kontrolowanie zakresu glikozylacji zapewnia solidne narzędzie do badania funkcji zależnych od glikanów.

Rysunek 1. System ekspresji ssaków: (A) Schemat ekspresji białek z kontrolowaną lub natywną glikozylacją u ssaków w komórkach HEK 293F. (B) SDS-PAGE hTREM2 oczyszczonego z NiNTA wyrażonego pod kifunenzyną pokazaną przed (tor 2) i po (tor 3) deglikozylacji EndoHf. (C) Kryształy wytwarzane z białka oczyszczonego i zdeglikozylowanego NiNTA. (D) Srebrna plama wejściowa krystalizacji (ścieżka 1) i zebranych kryształów (tory 2 i 3) ujawnia, że kryształy zawierają tylko TREM2. (E) Dalsze oczyszczanie TREM2 osiągnięto za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość oczyszczonego z NiNTA TREM2 wytworzonego w komórkach 293F bez kifunensyny. Gwiazdki (*) oznaczają objętość elucji wzorców masy cząsteczkowej. Białka eluowane w TBS przy użyciu analitycznej kolumny S200 (GE). (F) Analiza SDS-PAGE oczyszczonego z wykluczenia wielkości TREM2: białko wejściowe (tor 2) i zgięty pik (tor 3). Zwróć uwagę, jak pełne, niejednorodne glikany działają przy wyższej pozornej masie cząsteczkowej z szerokim rozmazem za pomocą SDS-PAGE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.