Tutaj prezentujemy protokół działania i dostrajania kolumn chromatografii przepływowej z równoległymi segmentami, aby umożliwić detekcję multipleksowaną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tutaj prezentujemy protokół działania i dostrajania kolumn chromatografii przepływowej z równoległymi segmentami, aby umożliwić detekcję multipleksowaną.
Technologia aktywnego przepływu (AFT) to nowa forma technologii kolumnowej, która została zaprojektowana w celu przezwyciężenia niejednorodności przepływu w celu zwiększenia wydajności separacji pod względem wydajności i czułości oraz umożliwienia multipleksowanej detekcji. Ta forma AFT wykorzystuje kolumnę o przepływie równoległym (PSF). Końcówka wylotu kolumny PSF składa się z 2 lub 4 portów, które można multipleksować w celu podłączenia do 4 detektorów. Kolumna PSF umożliwia nie tylko platformę do detekcji multipleksowej, ale także na jednoczesne połączenie detektorów niszczących i nieniszczących, bez dodatkowych przewodów o martwej objętości. Wielkość przepływu przez każdy port można również dostosować za pomocą zarządzania ciśnieniem, aby dopasować ją do wymagań konkretnego detektora (detektorów). Aby osiągnąć detekcję multipleksową za pomocą kolumny PSF, istnieje szereg parametrów, które można kontrolować, aby zapewnić optymalną wydajność separacji i jakość wyników; To są wymiary rurki dla każdego portu, wybór portu dla każdego typu detektora i regulacja przepływu. Protokół ten ma na celu pokazanie, jak używać i dostrajać kolumnę PSF działającą w multipleksowanym trybie wykrywania.
Kolumny technologii Active Flow
Kolumny chromatograficzne z technologią aktywnego przepływu (AFT) zostały niedawno opracowane w celu przezwyciężenia nieefektywności separacji związanej z niejednorodnością przepływu1-6, a także w celu umożliwienia detekcji multipleksowej. W tej konkretnej komunikacji szczegółowo opisujemy proces operacyjny kolumny z równoległym przepływem segmentowym (PSF) z detekcją multipleksową. Kluczowymi zaletami funkcjonalnymi kolumny PSF są: (1) przepływ z promieniowego obszaru centralnego łoża kolumny jest odizolowany od obwodowego lub ściennego obszaru przepływu, (2) objętość fazy ruchomej, która musi być przetworzona przez źródło detekcji, jest zmniejszona, oraz (3) źródła detekcji mogą być multipleksowane w celu rozszerzenia informacji o próbce bez wprowadzania opóźnień wykrywania w każdym procesie wykrywania, lub w związku z tym konieczne jest rozszczepienie strumienia przepływu na słupie7,8. Kluczową cechą konstrukcji kolumny PSF, która umożliwia korzystanie z detekcji multipleksowej, jest nowatorska armatura wylotowa i zespół frytki. Rysunek 1 przedstawia zdjęcie kolumny AFT w porównaniu z konwencjonalną kolumną. Ważne jest, aby zrozumieć, że proces podziału uzyskany przy użyciu równoległych segmentowanych kolumn przepływu nie jest taki sam, jak podział strumienia przepływu po kolumnie. W podzielonym strumieniu przepływu po kolumnie próbkowanie odbywa się równomiernie (tj. osiowo) w całym paśmie próbki od krawędzi natarcia do krańców ogona, w wyniku czego każdy strumień przepływu jest równy pod względem wydajności i czułości; Wielkość czułości jest w ten sposób dzielona przez liczbę rozdwojoną. Jednak w PSF proces rozdzielania próbkuje pasmo promieniowo, a nie osiowo. W związku z tym port centralny pobiera próbki z wierzchołka piku — najbardziej skoncentrowanego obszaru szczytu. W związku z tym czułość jest tutaj najwyższa, ponieważ pik nie jest rozcieńczany przez rozproszony obszar ogonowy. Elucja próbki z portów peryferyjnych nie jest tak wydajna jak w strefie centralnej, ale ponieważ pasmo jest próbkowane promieniowo, a nie osiowo, szerokość piku jest węższa niż w przypadku procesu próbkowania, który dzieli pik w kierunku osiowym, tj. podział kolumny końcowej. W związku z tym czułość z detektorem zależnym od stężenia nie jest zmniejszona.
W kolumnie PSF, złączka wylotowa składa się z wielu portów wyjściowych, a po wewnętrznej stronie tej końcowej złączki znajduje się pierścieniowa fryta. Wewnętrzna część tych pierścieniowych kanałów frytowych wypływa z kolumny przez promieniowy centralny port wylotowy, podczas gdy zewnętrzna promieniowa część kanałów wylotowych fryty wypływa z kolumny przez obwodowe lub ścienne porty wylotowe. Wewnętrzna i zewnętrzna część fryty wylotowej są oddzielone nieprzepuszczalną barierą, która zapobiega przepływowi krzyżowemu między tymi obszarami przepływu2. W wyniku tej konstrukcji centralny strumień promieniowy przepływający przez łoże słupa jest oddzielony od przepływu obszaru ściany wewnątrz słupa. Względna część przepływu z tych dwóch obszarów może być zmieniana do prawie dowolnego pożądanego stosunku poprzez zarządzanie ciśnieniem w celu optymalizacji różnych aspektów funkcjonalnych technologii kolumn, takich jak wydajność separacji lub czułość wykrywania. Zasadniczo, projekt ten skutecznie ustanawia w kolumnie o większym formacie "wirtualną" kolumnę o węższej średnicy wewnętrznej, a zatem kolumna funkcjonuje jako prawdziwa kolumna bezścienna, pokonując niejednorodność łoża kolumny i efekt ściany9,10.
Głównymi zaletami kolumn PSF są poprawa wydajności kolumn, minimalizacja przetwarzania rozpuszczalnika dla źródła (źródeł) detekcji i umożliwienie detekcji multipleksowej. Jednak dodatkową zaletą jest to, że ponieważ obszary ogonowe i czołowe dowolnego pasma są usuwane z ogólnego profilu elucji, substancja rozpuszczona podczas elucji lub wykrywania jest obecna w wyższym stężeniu, niż byłoby to obserwowane dla tego samego wtrysku substancji rozpuszczonej i obciążenia stężeniem na konwencjonalnej kolumnie, w zależności od zastosowanego współczynnika segmentacji. W konsekwencji często obserwuje się wzrost intensywności sygnału dla separacji przeprowadzanych na kolumnach PSF2. W rzeczywistości, jeśli współczynnik segmentacji zostanie dostosowany w taki sposób, że 25% przepływu wychodzi z każdego z czterech portów wyjściowych, intensywność sygnału obserwowana za pomocą detekcji ultrafioletowej (UV) pokazuje praktycznie dokładnie taką samą intensywność sygnału, jak pokazano przy użyciu konwencjonalnej kolumny, w której analizowana jest cała (100%) faza ruchoma7. Ponadto precyzyjne dostrojenie stosunku wylotu między obszarami przepływu centralnego i ściennego pozwala na optymalizację wydajności kolumny. Przyrost wydajności kolumny zaobserwowany przy użyciu kolumn AFT nie może być określony w jednej wartości, ponieważ ten przyrost wydajności jest funkcją trzech czynników: (1) natężenia przepływu, (2) współczynnika segmentacji i (3) współczynnika retencji substancji rozpuszczonej. Niemniej jednak prawie zawsze obserwuje się wzrost wydajności w porównaniu z konwencjonalnymi kolumnami, a czasami wzrost ten wynosi ponad 100% w liczbie teoretycznych tabliczek1,2. Możliwość dostrojenia współczynnika segmentacji pozwala analitykowi na skuteczne dopasowanie średnicy "wirtualnej" kolumny, a to jest ważny czynnik w odniesieniu do procesu detekcji. Na przykład wirtualna kolumna o średnicy wewnętrznej (ID) 2,1 mm jest tworzona z fizycznej kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm, gdy współczynnik segmentacji wynosi 21% elucji fazy ruchomej z promieniowego centralnego portu wyjściowego. W tych warunkach wirtualna kolumna o średnicy wewnętrznej 2,1 mm działa z wydajnością, która może być o ponad 70% większa niż konwencjonalna kolumna o średnicy wewnętrznej 2,1 mm, w zależności od natężenia przepływu i współczynnika retencji substancji rozpuszczonej10.
Obecny projekt kolumny PSF, który jest używany do detekcji multipleksowej, zawiera 4-portową złączkę wylotową, ale kolumna może być również wyposażona w 2-portową końcówkę, jednak ogranicza to wykrywanie tylko do dwóch detektorów. Podstawowa zasada działania tych kolumn jest jednak taka sama, z wyjątkiem tego, że cztery detektory mogą być jednocześnie sprzężone z 4-portową kolumną PSF na wyjściu, co rozszerza zakres detekcji multipleksowej. Oprócz rurek łączących przed i po kolumnie, jedynymi dodatkowymi wymaganiami dotyczącymi obsługi kolumny PSF są rurki, które można podłączyć do peryferyjnych portów wylotowych, oraz sposób, za pomocą którego można zmierzyć ilość fazy ruchomej przechodzącej przez każdą rurkę, zwykle pomiar masy lub pomiar objętościowy. Aby ułatwić strojenie, średnica wewnętrzna wszystkich rurek wylotowych powinna być taka sama. Stosunek przepływu między obwodowymi i promieniowymi centralnymi portami wyjściowymi jest następnie zmieniany za pomocą zarządzania ciśnieniem, po prostu poprzez zmianę długości rurki znajdującej się na obwodowej złączce wylotowej lub długości detektora przewodów na promieniowym centralnym porcie wylotowym.
Wykrywanie multipleksowane za pomocą kolumn PSF
Ważną zaletą kolumn PSF jest to, że każdy z portów wyjściowych może być podłączony bezpośrednio do źródła detekcji, umożliwiając w ten sposób detekcję multipleksową. W dobrze zaprojektowanym systemie detekcji pojedyncza analiza z detekcją multipleksową może dostarczyć istotnych informacji na temat charakteru składników w próbce. Co ważne, badania niszczące i nieniszczące mogą być prowadzone dokładnie w tym samym czasie, bez opóźnień w wykrywaniu. Pozwala to na bezwzględne przypisanie np. przeciwutleniaczy za pomocą odczynnika DPPH•, przy czym zaobserwowano, że składniki eluują się w odpowiedzi wykrywania UV i/lub spektrometrii mas (MS)7,11. Dzięki temu cztery niezależne detektory mogą pracować jednocześnie, a odpowiednie porcje przepływu są kierowane do każdego detektora przez dowolny z czterech portów wylotowych. Ponieważ przepływ przez te porty można łatwo regulować, ilość substancji rozpuszczonej docierającej do dowolnego z detektorów można dostosować do czułości danego źródła detektora. Należy jednak zauważyć, że najbardziej efektywną migrację substancji rozpuszczonej obserwuje się przez promieniowy centralny port wylotowy. Każdy z portów peryferyjnych oferuje równoważną wydajność separacji, która po ustawieniu na 25% przez każdy port jest tylko nieznacznie mniej wydajna niż konwencjonalna kolumna. W związku z tym ważne jest, aby detektor ilościowy był ustawiony na analizę próbki z promieniowego centralnego portu wyjściowego.
Podczas ustawiania kolumny PSF w celu wykrywania multipleksowania należy wziąć pod uwagę szereg czynników, które należy wziąć pod uwagę, aby osiągnąć efektywne i wysokiej jakości wyniki; to są wymiary lamp dla każdego portu, wybór portu dla typu detektora i regulacja przepływu.
Wymiary rurki dla każdego portu
W chromatografii długość rurki po kolumnie odgrywa kluczową rolę w efektywności i wydajności separacji. Duża objętość martwa wynikająca z długich lub szerokich przewodów o średnicy wewnętrznej od wylotu kolumny do detektora spowoduje utratę wydajności, rozdzielczości i czułości. W związku z tym podczas ustawiania kolumny PSF należy zastosować odpowiednie wymiary przewodów, aby osiągnąć maksymalny potencjał w zapewnieniu wydajnej separacji przy jednoczesnym zapewnieniu korzyści płynących z multipleksowania.
Port do detektora
Rysunek 2 jest ilustracją przykładowej konfiguracji detekcji multipleksowanej (wykrywanie ultrafioletowo-widzialnej (U-Vis), spektrometru masowego (MS) i 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (DPPH•)). Ilustracja pokazuje, że port centralny jest podłączony do detektora MS, podczas gdy detektory DPPH• i UV-Vis są podłączone do portów peryferyjnych. Ponieważ MS jest najbardziej czułym detektorem z trzech, przepływ do tego detektora był kierowany z centralnego portu wylotowego. Ponieważ detekcja DPPH• jest selektywna w stosunku do obecności przeciwutleniaczy, a najmniej czuła i najbardziej tolerancyjna na poszerzanie pasma, przepływ do tego detektora był kierowany z portu peryferyjnego. UV-Vis był wtórnym detektorem "ogólnym", więc przepływ do tego detektora był kierowany z drugiego portu peryferyjnego.
Regulacja przepływu
Po podłączeniu odpowiedniego przewodu z portu do detektora, przepływ wyjściowy z każdego z detektorów może być dostosowany do wymaganej ilości. Prostym sposobem pomiaru wielkości przepływu wychodzącego z każdego detektora jest zważenie ilości fazy ruchomej, która wymywa się przez każdy port w danym okresie czasu. W ten sposób można określić przepływ procentowy, a współczynniki przepływu można regulować poprzez skrócenie lub wydłużenie rurki podłączonej do przewodu wylotowego detektorów, odpowiednio do wymagań wybranych detektorów. Różne detektory mają różne wymagania dotyczące przepływu, na przykład cela przepływowa detektora fluorescencyjnego (FLD) nie jest ograniczona natężeniem przepływu, ale należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia w komorze przepływowej. W związku z tym kontrolę przepływu przez FLD uzyskuje się zwykle poprzez regulację spadku ciśnienia na innych detektorach, a pozostała część przepływu przechodzi następnie przez FLD. Detektorem, który jest czuły na wielkość dostarczanego przepływu, jest MS. Ogólnie rzecz biorąc, obecne wysokiej klasy spektrometry masowe mogą z łatwością przetwarzać około 1 do 1,5 ml / min umiarkowanie wodnej fazy ruchomej. Powyżej tego natężenia przepływu zalanie źródła może spowodować, że MS nie będzie działał. Jednak czułość wykrywania w większości spektrometrów masowych jest korzystna dzięki zastosowaniu niższych natężeń przepływu; w związku z tym możliwości rozdzielania przepływu PSF są niezwykle przydatne w zastosowaniach związanych z wykrywaniem stwardnienia rozsianego. Można wykorzystać wysokie objętościowe natężenia przepływu w kolumnie, ale przy małych obciążeniach transportowanych do detektora MS. Dostrojenie przepływu do detektora MS musi być jednak wykonane poprzez regulację spadku ciśnienia przed detektorem MS, a nie po MS. W tym przypadku bardzo przydatne jest zastosowanie wężyka o wąskim otworze (średnica wewnętrzna 0,1 mm), ponieważ ciśnienie można łatwo regulować bez dodawania nieodpowiedniej objętości martwej.
W zależności od typu detektora, dostosowanie współczynnika segmentacji może być wykonane zarówno przed jak i po detektorze. Jeśli używany jest detektor nieniszczący, taki jak UV-Vis, procent przepływu zostanie zmierzony i dostrojony po detektorze. Jeśli w konfiguracji multipleksu używany jest pojedynczy detektor niszczący, procent przepływu jest określany przez wsteczne obliczenia w odniesieniu do innych procentów przepływu w portach. Jeśli używany jest detektor oparty na odczynniku, taki jak DPPH•, procent przepływu jest mierzony po detektorze bez dodawania odczynnika; A jeśli używane są dwa lub więcej detektorów niszczących, wówczas stosunek przepływu jest mierzony przez detektor wstępny. Systemy detekcji, które mogą wymagać dodatkowego oprzyrządowania, takie jak DPPH•, będą miały dodatkowe ciśnienie w układzie, które może zmienić procent przepływu po podłączeniu do systemu wykrywania. Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na ciśnienie w układzie detektora niszczącego podczas regulacji procentowego przepływu detektora wstępnego. Niezależnie od współczynnika przepływu, który jest ustalany przez którykolwiek z portów, informacje ilościowe powinny być uzyskiwane poprzez odpowiednią standaryzację. Jednak po ustaleniu stosunków przepływu są one wytrzymałe i nie zmieniają się nawet w warunkach elucji gradientowej7,
Szczegółowy protokół wideo towarzyszący temu rękopisowi ma na celu pokazanie, jak używać i dostroić kolumnę PSF działającą w multipleksowanym trybie wykrywania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Uwaga: Ten protokół zawiera instrukcje, jak używać kolumny PSF w systemie HPLC sprzężonym z wieloma detektorami do detekcji multipleksowej. Protokół został napisany przy założeniu, że czytelnik posiada podstawową wiedzę i doświadczenie w zakresie chromatografii i różnych metod detekcji HPLC.
Uwaga: Proszę zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) dla wszystkich materiałów i odczynników przed użyciem (np. MSDS dla metanolu). Należy zapewnić stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z rozpuszczalnikami i eluentem z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy zapewnić właściwe wykorzystanie kontroli inżynieryjnych HPLC, wagi analitycznej i oprzyrządowania detektora oraz zapewnić stosowanie środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami).
1. Konfiguracja instrumentu HPLC
2. Konfiguracja detektorów UV-Vis i MS
3. Przygotowanie odczynnika 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (DPPH•) Konfiguracja odczynnika DPPH• Detektor systemu
4. Konfiguracja kolumny PSF
5. Dostrajanie kolumny PSF do detekcji multipleksowej
6. Ostateczne warunki konfiguracji
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przeprowadzono multipleksową analizę HPLC z wykorzystaniem kolumny AFT w trybie PSF (Rysunek 1), zgodnie z układem przedstawionym na Rysunku 2. Taki układ umożliwił jednoczesną analizę próbki kawy przy użyciu detekcji UV-Vis, DPPH• oraz MS w trybie całkowitej liczby jonów (TIC). Związki w próbce kawy wykazujące odpowiedź na DPPH• można było następnie łatwo przypisać do odpowiedzi UV-Vis i MS-TIC na podstawie zgodności czasów retencji, co zilustrowano na Rysu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie to obejmuje charakterystykę i profilowanie kawy przy użyciu HPLC z detekcją multipleksową z wykorzystaniem kolumny o równoległym przepływie segmentowym (PSF). Multipleksowana HPLC z wykorzystaniem kolumn PSF umożliwia charakterystykę i identyfikację kluczowych jednostek chemicznych poprzez zmniejszenie złożoności danych próbki przy jednoczesnym uzyskaniu większego stopnia informacji specyficznych dla cząsteczki w ułamku czasu potrzebnego przy użyciu konwencjonalnych procesów wielokrotnej detekcji. Kolumna PSF umo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Ta praca była wspierana przez UWS i ThermoFisher Scientific. Jeden z autorów (DK) potwierdza otrzymanie australijskiej nagrody podyplomowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przyrząd | Wiele detektorów do wyboru do wykrywania multipleksowego. Wybrane detektory mogą wymagać dodatkowego oprzyrządowania, np. , pompy. | ||
| Kolumna HPLC z przepływem równoległym | Thermo Fisher Scientific | Nie zdefiniowano | Wkrótce zostanie skomercjalizowany |
| Metanol | Dowolna marka | Rurki HPLC Grade | |
| PEEK | Dowolna marka | Różne długości i średnica wewnętrzna | |
| Ograniczniki kolumn | Dowolna marka | Do blokowania nieużywanych portów peryferyjnych. | |
| Obcinak do rur PEEK | Dowolna marka | ||
| Waga analityczna | Dowolna marka | ||
| Stoper | Dowolna marka | ||
| Naczynia do zbierania eluentów | Fiolki na próbki dowolnej marki | 1-2 ml mogą być używane jako naczynia do zbierania eluentu |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.