Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53453

⸱

8 lutego 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.

Streszczenie

Rozwój rekombinowanej terapii doustnej pozwoliłby na bardziej bezpośrednie ukierunkowanie na układ odpornościowy błony śluzowej i poprawiłby zdolność do zwalczania zaburzeń żołądkowo-jelitowych. Dostosowanie drożdży probiotycznych w szczególności do tego podejścia niesie ze sobą kilka zalet. Szczepy te mają nie tylko potencjał do syntezy szerokiej gamy złożonych białek heterologicznych, ale są również zdolne do przetrwania i ochrony tych białek podczas transportu przez jelito. Kluczowe jest jednak to, że takie podejście wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie wielu różnych technik laboratoryjnych, które zwykle nie są stosowane w tandemie. Ponadto, chociaż poszczególne protokoły transformacji drożdży są dobrze scharakteryzowane dla powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych, kładzie się tutaj nacisk na alternatywne podejścia i znaczenie optymalizacji transformacji dla słabiej scharakteryzowanych szczepów probiotycznych. Szczegółowe omówienie tych metod ułatwi dyskusję na temat najlepszych podejść do testowania drożdży probiotycznych jako doustnych nośników leków i rzeczywiście przyczyni się do przyspieszenia rozwoju tej nowatorskiej strategii terapii przewodu pokarmowego.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy probiotyczne są intrygującym potencjalnym sposobem efektywnego i ekonomicznego dostarczania heterologicznych białek do przewodu pokarmowego. Organizmy te są zdolne do przetrwania przejścia przez przewód pokarmowy, ale nie kolonizują go1, co umożliwia kontrolowane dawkowanie i ogranicza ekspozycję na wyrażony lek. Co więcej, możliwość łatwego zmodyfikowania tych organizmów do produkcji heterologicznego białka na dużą skalę sprawia, że są one ekonomiczną alternatywą dla syntetycznych cząstek. Jednak opracowanie takiego podejścia, jak wykazano niedawno przy użyciu auksotroficznego szczepu drożdży probiotycznych Saccharomyces boulardii2, wymaga znajomości technik laboratoryjnych, które nie są tradycyjnie łączone w ramach danego badania, począwszy od drożdży i biologii molekularnej, a skończywszy na technikach obchodzenia się ze zwierzętami i metodach immunologicznych. Tak więc, chociaż poszczególne procedury opisane w niniejszym dokumencie nie są same w sobie nowymi protokołami laboratoryjnymi, celem tego manuskryptu jest przedstawienie ujednoliconego wprowadzenia do technik potrzebnych do eksperymentalnego testowania drożdży probiotycznych jako nośników leków do mysiego przewodu pokarmowego. Pod warunkiem jest kompilacja podstawowych protokołów dla: 1) generowania auksotroficznych zmutowanych szczepów drożdży, które można łatwo manipulować genetycznie; 2) transformacja kultur drożdży do ekspresji białka heterologicznego; 3) podawanie rekombinowanych drożdży do jelita przez zgłębnik jamy ustnej; oraz 4) odzyskanie żywotnych rekombinowanych drożdży probiotycznych z jelita myszy i ocena ich ekspresji białka heterologicznego.

Po pierwsze, chociaż istnieje wiele metod selekcji pozytywnej i negatywnej do manipulowania gatunkami drożdży, selekcja negatywna, taka jak za pomocą markerów auksotroficznych, zwiększa zarówno efektywność, jak i łatwość, z jaką drożdże mogą być przekształcane i selekcjonowane. Z kolei pozytywna selekcja transformantów za pomocą antybiotyków znacznie zwiększa koszt manipulacji drożdżami. Co więcej, selekcja drożdży na pożywkach stałych zawierających antybiotyki może pozwolić na zwiększony wzrost nieprzekształconych kolonii tła w porównaniu z selekcją drożdży auksotroficznych na syntetycznych pożywkach stałych typu drop out (obserwacje niepublikowane). Drożdże auksotroficzne to szczepy, w których brakuje enzymów krytycznych dla syntezy aminokwasów egzogennych lub uracylu. Takie drożdże mogą rosnąć tylko wtedy, gdy zostaną uzupełnione brakującym metabolitem lub genem metabolicznym, umożliwiając w ten sposób selekcję negatywną, gdy drożdże są posiewane na syntetycznym pożywce, która nie zawiera niezbędnego metabolitu. Wiele powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych Saccharomyces cerevisiae jest już w rzeczywistości mutantami auksotroficznymi3. Jednak przemysłowe, kliniczne i probiotyczne szczepy drożdży są zazwyczaj prototroficzne ze zdolnością do syntezy wszystkich wymaganych składników odżywczych. Aby umożliwić bardziej efektywną manipulację genetyczną takimi drożdżami, geny auksotroficzne mogą być selektywnie ukierunkowane w celu wytworzenia szczepów, które można wyselekcjonować bez antybiotyków. Specyficzne ukierunkowanie na geny markerów auksotroficznych można osiągnąć poprzez rozerwanie genów za pośrednictwem PCR, polegające na rekombinacji homologicznej lub, ostatnio, poprzez CRISPR/Cas9 ukierunkowane na 4-6. Alternatywnie, mutageneza UV może szybko generować mutanty auksotroficzne nawet w szczepach drożdży, dla których transformacja z wieloma plazmidami jest technicznie trudna7. Podczas gdy celowanie PCR i CRISPR/Cas9 zostały szeroko opisane w innym miejscu, w pierwszej części tego manuskryptu przedstawiono szczegółowy protokół opisujący podejście mutagenezy UV w celu stworzenia szczepów auksotroficznych, które pozwolą na selekcję negatywną, a nie pozytywną selekcję antybiotykową transformantów drożdżowych.

Następnym niezbędnym krokiem w użyciu takich auksotroficznych szczepów do doustnego dostarczania heterologicznego białka jest transformacja drożdży z plazmidowym DNA. Od czasu pierwszej udanej transformacji sferoplastów drożdży dla Saccharomyces cerevisiae w 1978 r.8 scharakteryzowano liczne modyfikacje mające na celu zwiększenie wydajności i łatwości, z jaką można genetycznie modyfikować gatunki drożdży. Zastosowanie elektroporacji do pomyślnej transformacji DNA w S. cerevisiae zostało po raz pierwszy opisane w 1985 roku9 i od tego czasu zostało ulepszone poprzez dodanie inkubacji 1 M sorbitolu do osmotycznie wspierających komórki10. Wykazano ponadto, że wydajność elektroporacji zależy od gatunku i szczepu drożdży, liczby komórek i fazy wzrostu, objętości elektroporacji, natężenia pola i specyficznych11. Przemiana octanu litu (LiOAc), pierwotnie opisana przez Ito i wsp. 12 jest jednym z najczęściej stosowanych protokołów transformacji, ponieważ nie wymaga specjalnego sprzętu. Dodatkowe analizy wykazały, że efektywność przemiany drożdży LiOAc znacznie wzrasta, gdy komórki są zbierane w środkowej fazie wzrostu i poddawane szokowi cieplnemu w obecności glikolu polietylenowego (PEG) i DNA w temperaturze 42 °C12. Inkubacja całych nienaruszonych drożdży z PEG jest niezbędna do efektywnej transformacji, prawdopodobnie poprzez poprawę przyczepiania DNA do błony komórkowej, a także poprzez inne efekty na błonę13. Sam lit zwiększa również przepuszczalność nienaruszonych komórek14. Chociaż większość laboratoryjnych szczepów S. cerevisiae można łatwo przekształcić za pomocą transformacji LiOAc3, inne gatunki drożdży mogą być bardziej efektywnie przekształcane przy użyciu alternatywnych protokołów. Na przykład Pichia pastoris jest najefektywniej przekształcana za pomocą elektroporacji, a nie transformacji LiOAc13. Dlatego tak ważne jest przetestowanie wielu metod transformacji oraz optymalizacja okresów inkubacji i stężeń odczynników podczas próby genetycznej modyfikacji niescharakteryzowanego szczepu drożdży. Niniejszy manuskrypt opisuje zatem zarówno transformację LiOAc, jak i elektroporację jako techniki transformacji auksotroficznego mutanta i dzikiego typu S. boulardii. Zainteresowani czytelnicy są kierowani do najnowszych przeglądów w celu uzyskania dokładnych opisów ewolucji przemian drożdży, alternatywnych protokołów i dalszych dyskusji na temat możliwych mechanizmów działania13,15. Transformacja drożdży z plazmidem kodującym łatwo wykrywalne białko jest ponadto niezbędna do dalszych badań w celu zapewnienia prawidłowej ekspresji i funkcji białka heterologicznego. Niezliczone ilości różnych białek mogą być wybierane w zależności od ostatecznego celu badania terapeutycznego i przeciwciał dostępnych do wykrywania białek za pomocą immunoblottingu, ELISA i innych technik. Protokoły dla tych technik zostały dokładnie opisane w innym miejscu16,17 i mogą być wykorzystane do określenia poziomów produkcji heterologicznych białek z transformowanych drożdży w porównaniu z krzywymi standardowymi. W celu demonstracji i pokazania udanej produkcji bardzo powszechnie stosowanego białka w biologii drożdży, w niniejszym artykule przedstawiono transformację z plazmidem kodującym białko zielonej fluorescencji (GFP), co pozwala na późniejsze wykrycie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Równie ważne dla produkcji organizmów probiotycznych, które wyrażają heterologiczne białko, jest prawidłowe podawanie i wykrywanie tych mikroorganizmów w tkankach przewodu pokarmowego, jak opisano w częściach trzeciej i czwartej. Podawanie rekombinowanych drożdży przez zgłębnik doustny pozwala na dostarczanie kontrolowanych ilości drożdży bezpośrednio do żołądka, z którego myszy C57BL/6 są naturalnie niezdolne do wymiotów18. Jednak niewłaściwe obchodzenie się ze zwierzętami i zgłębnik mogą prowadzić do uszkodzenia i perforacji przełyku, perforacji żołądka, podania tchawicy i zachłystowego zapalenia płuc19,20. Słaba technika i brak doświadczenia mogą ponadto zwiększać zmienność mysich odpowiedzi immunologicznych i wyników eksperymentalnych, które przypisuje się stresowi zwierząt po zgłębniku doustnym21,22. Praktyka w stosowaniu właściwej techniki może więc nie tylko złagodzić dyskomfort zwierząt, ale także zwiększyć precyzję wyników eksperymentów. Manuskrypt ten opisuje i demonstruje obchodzenie się ze zwierzętami i podawanie przez zgłębnik doustny w celu podawania kontrolowanych dawek drożdży rekombinowanych.

Na koniec, ważne jest, aby potwierdzić pomyślne dostarczenie drożdży rekombinowanych, analizując tkanki limfoidalne pod kątem obecności drożdży i heterologicznego białka. Tkanki immunologiczne przewodu pokarmowego, które można najłatwiej i najbardziej przewidywalnie zbadać pod kątem obecności drożdży, to plastry Peyera. Plamy Peyera to wtórne narządy limfatyczne wzdłuż jelita cienkiego, które są kluczowymi miejscami indukcji odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej23. Antygeny ze światła są przenoszone przezkomórkowo przez komórki mikrofałdowania (M) w nabłonku i są uwalniane do łat Peyera, narażając w ten sposób zamknięte komórki prezentujące antygen na zawartość światła jelitowego. Chociaż wychwyt cząstek przez nabłonek jelitowy może być również osiągnięty przez komórki kubkowe, wykazano, że komórki te pobierają tylko cząstki o średnicy mniejszej niż 0,02 μm24. Dendryty przeznabłonkowe wydłużone z komórek dendrytycznych CD103+ (DC) również pobierają małe cząstki ze światła jelita25; jednak obecnie nie ma doniesień wskazujących, że CD103+ DC pochłaniają cząstki większe niż bakterie. Tak więc nienaruszone drożdże probiotyczne, o średniej wielkości średnicy od 3 do 6 μm, są najprawdopodobniej pobierane przez komórki M i przenoszone do plastrów Peyera. Opisano tutaj protokół pobierania i badań przesiewowych plastrów Peyera pod kątem żywotnych drożdży rekombinowanych, chociaż procedurę tę można również łatwo dostosować do oceny wychwytu bakterii probiotycznych.

Podsumowując, ocena rekombinowanych drożdży probiotycznych pod kątem dostarczania białek terapeutycznych do jelita wymaga biegłości w technikach laboratoryjnych od biologii molekularnej po postępowanie ze zwierzętami i immunologię. Przedstawiono tutaj protokoły 1) wytwarzania i badań przesiewowych auksotroficznych szczepów drożdży, które mogą być łatwo selekcjonowane negatywnie bez antybiotyków, 2) alternatywnych protokołów transformacji drożdży i umożliwienia ekspresji białka heterologicznego, 3) demonstracji prawidłowych technik obchodzenia się ze zwierzętami i podawania przez zgłębnik do żołądka drożdży rekombinowanych oraz 4) protokołów rozwarstwiania plastrów Peyera i badań przesiewowych pod kątem żywotnych drożdży rekombinowanych i funkcjonalnego białka heterologicznego. W połączeniu protokoły te pozwolą na wygenerowanie i przetestowanie probiotycznego szczepu drożdży zdolnego do dostarczania heterologicznego białka terapeutycznego do przewodu pokarmowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mutageneza UV w celu wytworzenia auksotroficznych szczepów drożdży

  1. Generowanie krzywych przeżycia w celu określenia potrzebnych dawek promieniowania UV
    1. Przygotować pożywkę YPD (ekstrakt z drożdży, dekstroza, pepton) i inne odczynniki wymienione w Tabeli 1 zgodnie ze standardowymi procedurami26 i zaszczepić pojedyncze kolonie w 5-10 ml pożywki YPD. Inkubować kultury na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C O/N do nasycenia przez co najmniej 8 godzin.
    2. Określić stężenie komórek w kulturach O/N za pomocą spektrofotometru, rozcieńczając komórki w stosunku 1:10 w wodzie w plastikowej kuwecie. Rozcieńczyć komórki do stężenia 10-7 komórek/ml w 20 ml sterylnej wody destylowanej.
    3. Rozcieńczone komórki przelać na sterylną plastikową szalkę Petriego i po zdjęciu pokrywki umieścić płytkę 14 cm poniżej żarówki UV.
    4. Poddać komórki szeregowemu dawkom promieniowania UV 5 000 μJ i 10 000 μJ, ekstrahując 500 μl komórek po każdym inkremenencie, tak aby próbki komórek pobierano po ekspozycji na 0 μJ, 5 000 μJ, 10 000 μJ, 15 000 μJ, 20 000 μJ, 25 000 μJ, 30 000 μJ, 40 000 μJ, i 50 000 μJ promieniowania UV. Przenieś wyekstrahowane próbki komórek do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml i seryjnie rozcieńczaj w krokach co 1:10 w sterylnej wodzie.
    5. Granulki w każdym rozcieńczeniu przez odwirowanie w mikrowirówce o stężeniu 16 000 x g przez 1 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl objętości sterylnej wody odpowiedniej do posiewu komórek drożdży. Odpipetować całą objętość zawieszonych komórek na płytkach zawierających pożywkę stałą YPD i użyć sterylnego rozsiewacza, aby równomiernie rozprowadzić komórki na każdej płytce.
    6. Owiń krawędzie płyt w Parafilm, aby zapobiec wysychaniu mediów, a płyty przykrywkowe folią aluminiową, aby zapobiec fotoreaktywacji i naprawie mutacji wywołanych promieniowaniem UV. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni, aby umożliwić wzrost żywotnych kolonii drożdży (ryc. 1).
    7. Policz liczbę rodzin, opcjonalnie za pomocą długopisu do zaznaczania policzonych kolonii, ręcznego elektronicznego długopisu do liczenia lub stojaka z powiększeniem. Wykreślić jako procent całkowitej liczby posianych komórek przy każdej dawce μJ promieniowania UV, aby wygenerować krzywą przeżycia dla napromieniowanych drożdży (Rysunek 2).
      UWAGA: Można się spodziewać, że haploidalne szczepy drożdży będą wymagały niższych dawek promieniowania UV w porównaniu ze szczepami diploidalnymi, aby osiągnąć ten sam procent przeżycia. Szczep drożdży pozbawiony funkcjonalnych enzymów naprawy DNA, taki jak mutant rad1 S. cerevisiae, może być użyty jako kontrola pozytywna wskazująca na obecność promieniowania UV w bardzo niskich dawkach.
    8. Określić dawkę mutagenezy UV, która ma być stosowana do badań przesiewowych, odnosząc się do krzywej przeżycia ustalonej w ppkt 1.1.7. Wartość x punktu wzdłuż krzywej przeżycia, w którym y jest równe 50, to dawka promieniowania UV, przy której przeżywa 50% drożdży. Badania przesiewowe mutantów przy tak niskim procencie przeżywalności mogą skutkować wyższą wydajnością pomyślnie zmutowanych szczepów, szczególnie w przypadku drożdży diploidalnych. 50% dawka przetrwania dla WT S. boulardii, jak pokazano na rycinie 2, wynosi około 18 000 μJ.
      UWAGA: Chociaż tak wysokie dawki promieniowania UV zwiększają ryzyko mutacji w genach szlaków komórkowych innych niż gen markera auksotroficznego, który jest przedmiotem zainteresowania, wadę tę należy zrównoważyć z potrzebą indukowania mutacji w obu kopiach genu markera auksotroficznego. W przypadku szczepów haploidalnych, w których tylko jedna kopia genu musi być zmutowana, badania przesiewowe przy wyższym procencie przeżycia, na przykład na poziomie 90%, zmniejszają ryzyko dodatkowych mutacji i nadal pozwalają na wystarczające wytworzenie mutantów auksotroficznych.
  2. Mutageneza UV i badania przesiewowe w kierunku auksotroficznych szczepów drożdży
    1. Przygotuj drożdże zgodnie z opisem w krokach 1.1.1-1.1.3.
    2. Wystawić drożdże na działanie dawki promieniowania UV odpowiadającej 50% przeżyciu, jak określono w ppkt 1.1.8. W przypadku WT S. boulardii dawkę tę określono na około 18 000 μJ (ryc. 2).
    3. Zebrać 1 ml objętości drożdży i osadów napromieniowanych promieniami UV przez odwirowanie w mikrowirówce przy 16 000 x g przez 1 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnej wody.
      1. Selekcja mutantów
        1. W przypadku stosowania selekcji, takiej jak w przypadku mutantów auksotroficznych ura3-, drożdże napromieniowane płytką należy umieścić na pożywce zawierającej kwas 5-fluoroorotyczny (5-FOA) w celu wyselekcjonowania komórek pozbawionych funkcjonalnego enzymu Ura3.
          UWAGA: Wszelkie drożdże zawierające funkcjonalne kopie Ura3 przekształcą 5-FOA w toksynę 5-fluorouracyl, prowadząc do śmierci komórki i umożliwiając łatwą selekcję kolonii ura3, które nie mają funkcjonalnego Ura327. Analogiczne podejścia selekcyjne są możliwe dla LYS2 i LYS5; TRP1; oraz markery MET2 i MET15 przy użyciu pożywek zawierających kwas α-aminoadypinowy28; kwas 5-fluoroantranilowy29; i metylortęci30,31.
        2. Odpipetować 100 μl zawieszonych komórek na minimalną ilość pożywki zawierającej 5-FOA i użyć sterylnego rozsiewacza, aby równomiernie pokryć płytkę. Owinąć płytki w Parafilm i inkubować do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni, aby umożliwić wzrost żywotnych kolonii drożdży.
        3. Potwierdź fenotyp ura3- dowolnej kolonii pojawiającej się na płytkach 5-FOA, ponownie nanosząc smugi na płytki YPD, uracylu i 5-FOA (ryc. 3). Użyj końcówki sterylnej wykałaczki, aby zebrać część pojedynczej kolonii i delikatnie przeciągnij komórki po świeżych płytkach YPD, uracylu i 5-FOA. Ponownie inkubować owinięte płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
          UWAGA: Żywotne kolonie będą wyglądać jak wypukłe, mniej więcej okrągłe narośla, podczas gdy niezdolne do życia komórki pojawią się tylko jako nieprzezroczysty rozmaz bez żadnych wypukłych narośli (ryc. 3).
      2. Badania przesiewowe mutantów
        1. W przypadku wytwarzania mutanta auksotroficznego, dla którego metody selekcji nie są dostępne, należy przygotować seryjne rozcieńczenia komórek drożdży napromieniowanych promieniami UV w skali 1:10 w sterylnej wodzie i pipetować rozcieńczenia na pożywkę YPD, używając sterylnego rozsiewacza do równomiernego pokrycia płytki.
        2. Zawiń płytki w Parafilm i inkubuj do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni. Określ, które rozcieńczenie pozwoliło na wzrost poszczególnych kolonii, które można łatwo odróżnić od siebie, zwykle nie więcej niż około 100 kolonii na płytkę.
        3. Powtórzyć mutagenezę UV próbek drożdży, jak opisano w ppkt 1.2.1-1.2.3 i komórek płytki w tym oznaczonym rozcieńczeniu. Rozcieńczone drożdże należy pipetować na pożywce YPD, rozprowadzić komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza i inkubować owinięte płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
        4. Badanie przesiewowe w kierunku auksotrofów poprzez replikowanie posiewu na selektywnych pożywkach pozbawionych metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania. Najpierw przymocuj sterylną aksamitną podkładkę do stojaka na talerze i odwróć płytkę z koloniami napromieniowanymi promieniowaniem UV na aksamit, zaznaczając orientację płytki.
        5. Następnie odwróć świeżą płytkę pozbawioną metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania na aksamit i lekko dociśnij, aby przenieść komórki z aksamitu na płytkę. Oryginalną płytkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Owinąć i inkubować nową płytkę do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
        6. Jako alternatywę dla posiewu replik, należy przeprowadzić badania przesiewowe mutantów poprzez ponowne rozpylenie kolonii z YPD na selektywne pożywki. Użyj końcówki sterylnej wykałaczki, aby zebrać część pojedynczej kolonii i delikatnie przeciągnij komórki po świeżej płytce YPD i płytce pozbawionej interesującego metabolitu. Ponownie inkubować owinięte płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
          UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby wybrać pojedyncze kolonie i wielokrotnie rozszczepiać kolonie, aby potwierdzić jednorodną populację prawdziwych komórek auksotroficznych.
    4. Dalej potwierdzić fenotyp napromienianych komórek poprzez inokulację pojedynczych kolonii w 5-10 ml zarówno YPD, jak i pożywki pozbawionej odpowiedniego metabolitu (np. w pożywce uracylowej dla mutanta ura3-). Inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C O/N w celu potwierdzenia wzrostu komórek w pożywce YPD, ale nie pod nieobecność metabolitu.
      UWAGA: Chociaż wzorce wzrostu na pożywkach stałych powinny wyraźnie wskazywać na auksotroficzny status drożdży, możliwe jest, że niektóre drożdże tolerują stresy i tworzą małe, wolno rosnące kolonie na pożywkach stałych, ale nie tolerują tych samych warunków w pożywkach płynnych (obserwacje niepublikowane). Inokulacja do płynnych kultur powinna być zatem przeprowadzona w celu dokładnego potwierdzenia wzorców wzrostu mutantów napromieniowanych promieniowaniem UV.
    5. W celu długotrwałego przechowywania potwierdzonych mutantów auksotroficznych należy przygotować zapasy glicerolu poprzez zaszczepienie komórek w 10 ml YPD i inkubację na bębnie rolkowym O/N w temperaturze 30 °C. Komórki osadu należy oczyścić przez odwirowanie przez 3 minuty przy 2 500 x g i odessać pożywkę. Ponownie zawiesić komórki w 50% sterylnym przefiltrowanym glicerolu, przenieść do kriowialu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Drożdże mutagenne UV mogą zawierać mutacje w wielu genach innych niż w markerze auksotroficznym, który jest przedmiotem zainteresowania. Przed kontynuowaniem stosowania zweryfikowanych mutantów auksotroficznych, szczepy te powinny być dalej analizowane poprzez sekwencjonowanie genów i ocenę odporności na pH, stres kwasów żółciowych i inne cechy istotne dla szczepów probiotycznych, jak opisano w innym miejscu2. Dodatkowo, jako alternatywę dla mutagenezyUV 4-6 należy rozważyć zastosowanie homologii pcr lub celowania CRISPR/Cas9 w celu bardziej selektywnej mutacji markerów auksotroficznych.

2. Przemiana drożdży

  1. Przemiana LiOAc drożdży
    1. Inokulować pojedyncze kolonie drożdży w 5-10 ml pożywki YPD i inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30°C O/N.
    2. Aby indukować wzrost w fazie logarytmicznej i zwiększyć efektywność wychwytu plazmidu, należy określić stężenie komórek za pomocą spektrofotometru w celu zmierzenia rozcieńczenia komórek w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie w plastikowej kuwecie. Rozcieńczyć kultury O/N do OD600 0,16-0,2 (około 2 x 10 6-2,5 x 10 6 komórek/ml) w 50 ml świeżego ciepłego YPD i inkubować komórki na wytrząsarce platformy orbitalnej ustawionej na 200 obr./min, aż hodowla osiągnie około 1 x 107 komórek/ml, zwykle około 4 godz.
      UWAGA: Wydajność przemiany można zmierzyć jako funkcję liczby pomyślnie przekształconych jednostek tworzących kolonie drożdży (CFU) na μg plazmidowego DNA. Zwiększona wydajność skutkuje większą liczbą przekształconych kolonii na μg plazmidowego DNA. Hodowla komórek drożdży i zbieranie ich podczas wzrostu w fazie logarytmicznej jest jednym z czynników zwiększających wydajność transformacji12.
    3. Granulki przez odwirowanie przy 2.500 x g przez 3 min.
    4. Odessać supernatant i przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, ponownie zawieszając osad w 1 ml sterylnej wody.
    5. Granulki przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce, odessać supernatant i przepłukać komórki przez ponowne zawieszenie w 1 ml buforu TE/LiOAc (Tris EDTA LiOAc).
    6. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić komórki w buforze TE/LiOAc do stężenia 2 x 109 komórek/ml.
    7. Przygotować mieszaniny transformacyjne z każdym z poniższych: 50 μl przygotowanych drożdży w buforze TE/LiOAc, 5 μl DNA nośnika (10 μg/μl) i 1 μl plazmidowego DNA (1 μg). Mikrogramy plazmidowego DNA można miareczkować, ponieważ zwiększanie ilości DNA może, ale nie musi, prowadzić do zwiększenia wydajności transformacji32
      UWAGA: W przypadku zmutowanego szczepu drożdży pozbawionego jednego markera auksotroficznego, tylko jeden plazmid kodujący marker może zostać przekształcony na próbkę. Co więcej, zastosowanie plazmidu kodującego łatwo wykrywalne białko, takie jak GFP, pozwoli na skuteczne określenie prawidłowego fałdowania i ekspresji białka heterologicznego przez szczep drożdży po transformacji.
    8. Do każdego preparatu dodać 300 μl PEG/LiOAc/TE i dokładnie wymieszać. Inkubacja nienaruszonych komórek za pomocą PEG jest niezbędna do efektywnej transformacji13.
    9. Inkubować preparaty w temperaturze 30 °C przez 30 minut z mieszaniem, umieszczając probówki do mikrowirówek w zlewce umieszczonej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min.
    10. Dodać 35 μl DMSO do każdej reakcji i komórek szoku cieplnego przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C. Chociaż istnieją sprzeczne doniesienia o dodatkowych korzyściach płynących z DMSO33, wykazano, że szok cieplny nienaruszonych komórek drożdży znacznie zwiększa wydajność transformacji12.
    11. Przemyć komórki przez granulowanie przez odwirowanie, jak w ppkt 2.1.5, zasysanie lub pipetowanie supernatantu i ponowne zawieszenie w 1 ml sterylnej wody. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozbić osad komórek.
      UWAGA: Bardzo ważne jest dokładne usunięcie supernatantu, ponieważ pożywki używane do generowania kompetentnych komórek mogą hamować wzrost drożdży i tworzenie kolonii.
    12. Powtórzyć granulowanie komórek, jak w ppkt 2.1.5, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnej wody. Odpipetować całą objętość na selektywną płytkę i za pomocą sterylnego rozsiewacza równomiernie pokryć płytkę przetworzonymi drożdżami.
    13. Owinąć brzegi powlekanych płytek w Parafilm, aby zapobiec wysuszeniu pożywki i inkubować do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2 dni, aby umożliwić wzrost przekształconych komórek drożdży. Udana, wydajna transformacja i auksotroficzna selekcja Saccharomyces cerevisiae daje dużą liczbę kolonii na preparat transformacyjny, chociaż wydajność może być znacznie niższa w przypadku innych szczepów (ryc. 4).
    14. Przechowywać płytki drożdży przez krótki okres (zwykle 1-3 tygodnie) do góry nogami i przykryć w temperaturze 4 °C. Przygotować zapasy glicerolu przetworzonych drożdży zgodnie z opisem w ppkt 1.2.5 do długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Konieczne są dalsze badania testujące transformowany CFU w celu określenia stabilności plazmidu i oceny prawidłowej ekspresji białka heterologicznego. Dokładne opisy stabilności plazmidu34, zastosowania immunoblottingu do wykrywania zdenaturowanych białek odzyskanych z próbek komórkowych17, testu immunoenzymatycznego (ELISA) do wykrywania prawidłowo sfałdowanych białek trójwymiarowych 16 oraz zastosowania GFP w badaniach drożdży35 są dostępne gdzie indziej. Rycina 6 przedstawia reprezentatywny obraz udanej ekspresji GFP w przekształconych S. cerevisiae w porównaniu z nieprzekształconymi komórkami. Zastosowanie takiego białka fluorescencyjnego jest jednym ze sposobów skutecznego określenia udanej produkcji białek heterologicznych.
  2. Elektroporacja drożdży
    1. Zaszczepić pojedyncze kolonie drożdży w 5-10 ml pożywki YPD i inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C O/N.
    2. Określ stężenie komórek za pomocą spektrofotometru, aby zmierzyć rozcieńczenie komórek w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie. Rozcieńczyć kultury O/N w 100 ml świeżej, ciepłej pożywki YPD do poziomu odpowiadającego OD600 wynoszącemu około 0,3. Inkubować subkultury w temperaturze 30 °C na wytrząsarce platformy orbitalnej ustawionej na 200 obr./min, aż do osiągnięcia OD600 około 1,6, zwykle 4-5 godzin. Każda subkultura o objętości 100 ml wygeneruje wystarczającą ilość kondycjonowanych komórek do dwóch reakcji transformacji.
    3. Granulki przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 3 min. Odessać supernatant i przepłukać komórki przez ponowne zawieszenie w 50 ml lodowatej sterylnej wody. Powtórz pranie, granulując komórki, odsysając supernatant i ponownie zawieszając w świeżych 50 ml lodowatej sterylnej wody.
    4. Ponownie zagnieździć ogniwa i ponownie zawiesić w 50 ml lodowatego buforu do elektroporacji (1 M sorbitol, 1 mM CaCl2).
    5. Powtórzyć wirowanie jak w ppkt 2.2.3, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 ml 0,1 M LiOAc/10 mM DTT. Zawiesinę komórek inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Preinkubacja komórek w LiOAc i DTT synergistycznie zwiększa efektywność elektroporacji36.
    6. Rozpylić ogniwa jak w ppkt 2.2.3, usunąć supernatant i przemyć przez ponowne zawieszenie w 50 ml lodowatego buforu do elektroporacji. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić komórki w lodowatym buforze do elektroporacji do końcowej objętości 1 ml.
    7. Przygotuj na lodzie: kondycjonowane komórki drożdży, sterylne kuwety do elektroporacji i plazmidowe DNA. Natychmiast po ostatecznym ponownym zawieszeniu kondycjonowanych komórek w 1 ml buforu do elektroporacji, połącz 400 μl kondycjonowanych komórek drożdży z około 1 μg plazmidowego DNA i dodaj do lodowato zimnej kuwety do elektroporacji o wielkości 0,2 μm. Zastosowanie zwiększonych ilości DNA może nieznacznie zwiększyć efektywność przemiany11. Inkubować reakcję na lodzie przez 5 minut, a następnie elektroporować elektroporatorem ustawionym na 2,5 kV i 25 μF.
      UWAGA: Jak opisano w 2.1.7, zmutowany szczep drożdży pozbawiony jednego markera auksotroficznego może być przekształcony przy użyciu tylko jednego plazmidu kodującego zmutowany marker na próbkę. Ponadto użycie plazmidu, który koduje łatwo wykrywalne białko, takie jak GFP, pozwala na skuteczne określenie prawidłowego fałdowania i ekspresji heterologicznego białka po transformacji.
    8. Przenieść elektroporowane komórki do 8 ml mieszaniny sorbitolu YPD:1 M w stosunku 1:1 i pozostawić komórki do inkubacji na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C przez 60 minut.
    9. Osadzać ogniwa jak w ppkt 2.2.3 i ponownie zawiesić w 100 μl sorbitolu 1:1 YPD:1 M. Umieścić całą objętość na selektywnej pożywce zawierającej 1 M sorbitol, owinąć krawędzie płytek w Parafilm i inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-5 dni, aby umożliwić wzrost przekształconych komórek drożdży.
      UWAGA: Kluczowe znaczenie ma testowanie drożdży transformowanych w celu oceny prawidłowej ekspresji białka heterologicznego, jak opisano w 2.1.14 i 2.2.7.

3. Zgłębnik jamy ustnej myszy z przetworzonymi drożdżami

  1. Wykonywać wszystkie procedury związane z opieką nad zwierzętami i obchodzeniem się ze zwierzętami zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystaniem oraz zatwierdzeniem przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
  2. Przygotować kultury drożdży O/N poprzez inokulację pojedynczych kolonii przekształconych drożdży auksotroficznych w 5-10 ml selektywnych pożywek. Inkubować kultury O/N przez co najmniej 8 godzin na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C, aż do nasycenia.
    UWAGA: Zastosowanie białek testowych kodujących plazmid, takich jak GFP, pozwoli na łatwe badanie ekspresji białek w drożdżach gavlarnych, jak opisano w 4.7.
  3. W celu maksymalnej indukcji ekspresji białka i indukcji wzrostu w fazie logarytmicznej, należy przygotować subkultury z kultur O/N przez rozcieńczenie do równoważnika OD600 około 0,16-0,2 w 50 ml odpowiedniej pożywki, jak opisano w 2.1.2.
  4. Oznaczyć stężenie subkulturowanych komórek, jak w ppkt 1.1.2 i dostosować do 109 komórek/ml. Przygotować dawkę 100 μl dla każdej myszy, z kilkuset μl dodatkowej objętości na grupę, aby poprawić dokładność i łatwość ładowania próbki.
  5. Granulki należy rozdmuchiwać przez odwirowanie w ilości 2 500 x g przez 3 minuty lub w mikrowirówce przy stężeniu 16 000 x g przez 1 minutę. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając równą objętość sterylnej wody i delikatnie pipetując w górę iw dół.
  6. Przymocuj odpowiednią igłębkę do pomiaru (22 G dla myszy 15-20 g) na sterylnej strzykawce o pojemności 1 ml i załaduj próbkę drożdży, upewniając się, że usunąłeś wszelkie pęcherzyki i ustaw tłok na przyrost 100 μl. Załaduj dodatkową strzykawkę sterylną wodą, aby zgłębnikować myszy kontrolne i sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczających drożdży.
  7. Podnieś mysz, która ma być zgłębnikowana, używając ręki niedominującej, z palcem wskazującym i kciukiem mocno chwytającymi skórę wokół szyi (ryc. 6A). Wsuń ogon pod mały palec, aby zapobiec ruchom dolnej części ciała. Upewnij się, że uchwyt jest bezpieczny i nie pozwala myszy poruszać głową, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek wewnętrznych podczas gavage.
    UWAGA: Oszacuj, jak daleko należy wprowadzić igłębkę, przytrzymując igłę przy myszy tak, aby bańka była równa z wyrostkiem mieczykowatym mostka. Włożenie tej długości igły zazwyczaj pozwoli gruszkowi igły do żołądka dostać się do żołądka.
  8. Używając dominującej ręki, delikatnie włóż igłębkę do przełyku myszy, ustawiając igłę pod kątem wzdłuż podniebienia i tylnej części gardła, trzymając się nieco na lewo od środka. Poczekaj, aż mysz połknie gruszkę igły i pozwól, aby igła opadła nieco dalej do punktu oszacowanego w ppkt 3.7 (Rysunek 6B). Jeśli podczas wbijania igły do zgłębnika odczuwany jest jakikolwiek opór lub jeśli mysz w dowolnym momencie zaczyna sapać, delikatnie wyjmij igłę i ponownie spróbuj znaleźć przełyk.
  9. Po połknięciu przez mysz gruszki igły do zgłębnika, delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby podać 100 μl (108 CFU) drożdży bezpośrednio do żołądka myszy.
    UWAGA: Chociaż myszy nie są w stanie zwymiotować żadnego roztworu zgłębnika po podaniu18,19, możliwe jest wystąpienie refluksu podczas zgłębnika21,37. Prawidłowe wprowadzenie igły do zgłębnika, a także regulacja objętości i lepkości roztworu, może pomóc w ograniczeniu refluksu i zapewnieniu dokładnego dawkowania.
  10. Ostrożnie wyjmij igłębkę z żołądka i przełyku myszy i włóż mysz z powrotem do klatki. Sprawdź, czy mysz oddycha i porusza się normalnie po zgłębniku, aby upewnić się, że igła do zgłębnika została prawidłowo wprowadzona podczas całej procedury i że nie zassano żadnego roztworu.

4. Zbiór mysich plam Peyera i izolacja żywotnych kolonii drożdży

  1. W odpowiednim momencie po zgłębniku, zwykle po 4 godzinach, należy złożyć ofiary myszy przy użyciu metod zatwierdzonych przez IACUC. Sprawdź, czy nie ma braku reakcji po uszczypnięciu palca u nogi i użyj dodatkowego środka, takiego jak zwichnięcie szyjki macicy, aby poświęcić mysz. Można również przetestować dodatkowe punkty czasowe, ponieważ liczne badania wykazały, że wydajność i czas wchłaniania przez nabłonek jest zależny od cząstek38,39.
  2. Połóż mysz z całkowicie odsłoniętym brzuchem i wysterylizuj obszar brzucha, spryskując 70% EtOH. Wykonaj nożyczkami poprzeczne nacięcie przez futro i skórę, uważając, aby nie uszkodzić żadnych tkanek wewnętrznych. Ręcznie podważ nacięcie jeszcze bardziej, aby odsłonić otrzewną, cienką błonę surowiczą pokrywającą narządy jamy brzusznej. Delikatnie unieś otrzewną i wykonaj poprzeczne nacięcie, aby odsłonić jelita.
  3. Ostrożnie używaj kleszczy, aby odciągnąć jelito cienkie od tętnic krezkowych, tłuszczu i innych tkanek. Odsłoń jelito cienkie z żołądka, w lewym górnym kwadrancie brzucha myszy, do jelita ślepego, dużej kieszonki tkanki jelitowej na początku jelita grubego.
  4. Wyizoluj łaty Peyera, szukając 1-3 mm mniej więcej okrągłych plam nieprzezroczystej tkanki wzdłuż jelita cienkiego (ryc. 7). Za pomocą zakrzywionych nożyczek preparacyjnych odetnij kopułę łaty Peyera, pozostawiając marginesy, aby upewnić się, że żadna z otaczających blaszek właściwych nie zostanie zebrana.
    UWAGA: Większość myszy ma od 4 do 8 łatwo widocznych łat Peyera. Wykonanie zabiegu w obszarze z bezpośrednim oświetleniem górnym zwiększy łatwość, z jaką można uwidocznić plamy Peyera.
  5. Zbierz wypreparowane łaty Peyera w kompletnym zmodyfikowanym nośniku dulbecco Iscove'a (IMDM).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby stosować technikę sterylną i włączać antybiotyki do pożywki zbiorczej, aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteryjnemu płytek drożdży.
  6. Odcedź plastry Peyera przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm, aby wyeliminować pożywkę zbierającą. Przemyć plastry Peyera preparatem fresh complete IMDM w tubce o pojemności 50 ml i za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml delikatnie rozbić plastry Peyera. Odcedzone komórki osadu przez odwirowanie z prędkością 1 800 obr./min przez 7 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w końcowej objętości około 100 μl.
  7. Nałóż odcedzone komórki na selektywne podłoże drożdżowe i użyj rozsiewacza płytkowego, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Owinąć brzegi płytki w Parafilm i inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2 dni, aby umożliwić wzrost wszelkich żywotnych drożdży odzyskanych z mysich łat Peyera.
    UWAGA: Konieczne są dalsze badania po odzyskaniu drożdży z plastrów Peyera, aby potwierdzić, że szczepy są w stanie dostarczyć odpowiednio pofałdowane białko heterologiczne do tych tkanek odpornościowych. Jak opisano w 2.1.14, takie metody mogą obejmować immunoblotting, ELISA lub mikroskopię fluorescencyjną w celu wykrycia białek fluorescencyjnych, takich jak GFP2,40.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykreślenie krzywej przeżywalności po napromieniowaniu UV wymaga wysiania rozcieńczonych komórek drożdży w taki sposób, aby mogły powstać wyraźne jednostki tworzące kolonie (CFU). Każda próbka o objętości 500 µl pobrana zgodnie z powyższym opisem zawiera około 5 x 106 komórek; jednakże przy liczbie przekraczającej 100 kolonii na płytce ich dokładne rozróżnienie jest utrudnione. Wysianie nieusuwanego próbki oraz seryjnych rozcieńczeń 1:10 napromieniowanych komórek zapewnia zatem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Łącznie protokoły w niniejszym dokumencie opisują podstawowe kroki niezbędne do opracowania i testowania auksotroficznych szczepów drożdży probiotycznych w celu dostarczania heterologicznego białka terapeutycznego do jelita. Ta manipulacja i testowanie rekombinowanych drożdży probiotycznych wymaga technik i zasobów, z którymi żadne laboratorium może obecnie nie być zaznajomione. Tak więc, chociaż wiele wcześniejszych badań opisywało powyższe protokoły dla wielu szczepów drożdży i myszy, metody te, według wiedzy autorów, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie przez Children's Center for Immunologia and Vaccines oraz nagrodę NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) przyznaną Tracey J. Lamb. Autorzy dziękują również Natalii P. Degtyarevej za hojny wkład rad1 S. cerevisiae.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spektrofotometr SmartSpec 3000BioRad170-2501Przykład spektrofotometru do oznaczania stężenia komórek i OD600 kultur drożdży
Bęben rolkowy New BrunswickEppendorfM1053-4004Przykład bębna rolkowego do inkubacji kultur drożdży
UV Stratalinker 2400Stratagene400075-03Przykład stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS11983044Fisher ScientificPlate stojak z powiększeniem zapisy kolonii liczą się po wyczuciu nacisku pióra
Scienceware Colony Counter F378620002Bel-Art SciencewareRęczny długopis do liczenia kolonii
Replika urządzenia do galwanizacjiFisherbrand09-718-1Przykład repliki stojaka i podkładek do galwanizacji 
Aksamitne kwadratyFisherbrand09-718-2
Sterylne rozsiewacze komórek w kształcie litery L Fisherbrand14665230
Kwas dezoksyrybonukleinowy, jednoniciowy z jąder łososiaSigma-AldrichD7656-1MLPrzykładowy nośnik DNA do przemiany drożdży LiOAc
Igły do zgłębnikaBraintree ScientificN-PK  002Dla myszy o wadze 15-20 g sugerowaną igłą jest igła o rozmiarze 22 (kulka 1,25 mm), 1 cala długa, prosta igła wielokrotnego użytku. Dla myszy o masie ciała powyżej 20  g, 20 G lub większe proste lub zakrzywione igły do głębków mogą być używane
1 ml sterylnej jednorazowej strzykawki tuberkulinowejBecton DickinsonBD 309659
kleszcze, takie jak Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) ząbkowana końcówka, kleszcze o szerokim uchwytuMikroskopia elektronowa Sciences77937-28Przykład kleszczy potrzebnych do sekcji 
Nożyczki do preparacji proste i zakrzywioneMikroskopia elektronowa Nauki72966-02 i 72966-03Przykłady nożyczek potrzebnych do preparacji
IMDMTechnologie życia12440053

Bibliografia

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14 (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13 (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921(2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transformacja drożdży probiotycznychmutagenza UVgavage doustny u myszyizolacja kępek Peyeratransformacja octanem litutechnika elektroporacjistężenie komórek drożdżyheterologiczna ekspresja białekanaliza regeneracji drożdży
Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.