Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozwój rekombinowanej terapii doustnej pozwoliłby na bardziej bezpośrednie ukierunkowanie na układ odpornościowy błony śluzowej i poprawiłby zdolność do zwalczania zaburzeń żołądkowo-jelitowych. Dostosowanie drożdży probiotycznych w szczególności do tego podejścia niesie ze sobą kilka zalet. Szczepy te mają nie tylko potencjał do syntezy szerokiej gamy złożonych białek heterologicznych, ale są również zdolne do przetrwania i ochrony tych białek podczas transportu przez jelito. Kluczowe jest jednak to, że takie podejście wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie wielu różnych technik laboratoryjnych, które zwykle nie są stosowane w tandemie. Ponadto, chociaż poszczególne protokoły transformacji drożdży są dobrze scharakteryzowane dla powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych, kładzie się tutaj nacisk na alternatywne podejścia i znaczenie optymalizacji transformacji dla słabiej scharakteryzowanych szczepów probiotycznych. Szczegółowe omówienie tych metod ułatwi dyskusję na temat najlepszych podejść do testowania drożdży probiotycznych jako doustnych nośników leków i rzeczywiście przyczyni się do przyspieszenia rozwoju tej nowatorskiej strategii terapii przewodu pokarmowego.
Wprowadzenie
Mikroorganizmy probiotyczne są intrygującym potencjalnym sposobem efektywnego i ekonomicznego dostarczania heterologicznych białek do przewodu pokarmowego. Organizmy te są zdolne do przetrwania przejścia przez przewód pokarmowy, ale nie kolonizują go1, co umożliwia kontrolowane dawkowanie i ogranicza ekspozycję na wyrażony lek. Co więcej, możliwość łatwego zmodyfikowania tych organizmów do produkcji heterologicznego białka na dużą skalę sprawia, że są one ekonomiczną alternatywą dla syntetycznych cząstek. Jednak opracowanie takiego podejścia, jak wykazano niedawno przy użyciu auksotroficznego szczepu drożdży probiotycznych Saccharomyces boulard....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Mutageneza UV w celu wytworzenia auksotroficznych szczepów drożdży
- Generowanie krzywych przeżycia w celu określenia potrzebnych dawek promieniowania UV
- Przygotować pożywkę YPD (ekstrakt z drożdży, dekstroza, pepton) i inne odczynniki wymienione w Tabeli 1 zgodnie ze standardowymi procedurami26 i zaszczepić pojedyncze kolonie w 5-10 ml pożywki YPD. Inkubować kultury na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C O/N do nasycenia przez co najmniej 8 godzin.
- Określić stężenie komórek w kulturach O/N za pomocą spektrofotometru, rozcieńczając komórki w stosunku 1:10 w wodzie w plastikowej kuwecie. Rozcieńczyć komór....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykreślenie krzywej przeżywalności po napromieniowaniu UV wymaga wysiania rozcieńczonych komórek drożdży w taki sposób, aby mogły powstać wyraźne jednostki tworzące kolonie (CFU). Każda próbka o objętości 500 µl pobrana zgodnie z powyższym opisem zawiera około 5 x 106 komórek; jednakże przy liczbie przekraczającej 100 kolonii na płytce ich dokładne rozróżnienie jest utrudnione. Wysianie nieusuwanego próbki oraz seryjnych rozcieńczeń 1:10 napromieniowanych komórek zapewnia zatem.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Łącznie protokoły w niniejszym dokumencie opisują podstawowe kroki niezbędne do opracowania i testowania auksotroficznych szczepów drożdży probiotycznych w celu dostarczania heterologicznego białka terapeutycznego do jelita. Ta manipulacja i testowanie rekombinowanych drożdży probiotycznych wymaga technik i zasobów, z którymi żadne laboratorium może obecnie nie być zaznajomione. Tak więc, chociaż wiele wcześniejszych badań opisywało powyższe protokoły dla wielu szczepów drożdży i myszy, metody te, według wiedzy autorów, .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za finansowanie przez Children's Center for Immunologia and Vaccines oraz nagrodę NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) przyznaną Tracey J. Lamb. Autorzy dziękują również Natalii P. Degtyarevej za hojny wkład rad1 S. cerevisiae.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Spektrofotometr SmartSpec 3000 | BioRad | 170-2501 | Przykład spektrofotometru do oznaczania stężenia komórek i OD600 kultur drożdży |
| Bęben rolkowy New Brunswick | Eppendorf | M1053-4004 | Przykład bębna rolkowego do inkubacji kultur drożdży |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Przykład stratalinker |
| Stuart Colony Counter SC6PLUS | 11983044 | Fisher Scientific | Plate stojak z powiększeniem zapisy kolonii liczą się po wyczuciu nacisku pióra |
| Scienceware Colony Counter | F378620002 | Bel-Art Scienceware | Ręczny długopis do liczenia kolonii |
| Replika urządzenia do galwanizacji | Fisherbrand | 09-718-1 | Przykład repliki stojaka i podkładek do galwanizacji |
| Aksamitne kwadraty | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| Sterylne rozsiewacze komórek w kształcie litery L | Fisherbrand | 14665230 | |
| Kwas dezoksyrybonukleinowy, jednoniciowy z jąder łososia | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | Przykładowy nośnik DNA do przemiany drożdży LiOAc |
| Igły do zgłębnika | Braintree Scientific | N-PK 002 | Dla myszy o wadze 15-20 g sugerowaną igłą jest igła o rozmiarze 22 (kulka 1,25 mm), 1 cala długa, prosta igła wielokrotnego użytku. Dla myszy o masie ciała powyżej 20 g, 20 G lub większe proste lub zakrzywione igły do głębków mogą być używane |
| 1 ml sterylnej jednorazowej strzykawki tuberkulinowej | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| kleszcze, takie jak Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) ząbkowana końcówka, kleszcze o szerokim uchwytu | Mikroskopia elektronowa Sciences | 77937-28 | Przykład kleszczy potrzebnych do sekcji |
| Nożyczki do preparacji proste i zakrzywione | Mikroskopia elektronowa Nauki | 72966-02 i 72966-03 | Przykłady nożyczek potrzebnych do preparacji |
| IMDM | Technologie życia | 12440053 |
Bibliografia
- Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
- Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
