Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53459

⸱

22 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Streszczenie

Głównym parametrem decydującym o powodzeniu zabiegu przeszczepu kości jest unaczynienie obszaru otaczającego przeszczep. Postawiliśmy hipotezę, że implantacja autoprzeszczepu kostnego wywoła większą regenerację kości poprzez obfite tworzenie naczyń krwionośnych. Aby zbadać wpływ przeszczepu na neowaskularyzację w miejscu ubytku, opracowaliśmy metodę mikrotomografii komputerowej (μCT) w celu scharakteryzowania nowo tworzących się naczyń krwionośnych, która polega na ogólnoustrojowej perfuzji zwierzęcia polimeryzującym środkiem kontrastowym. Metoda ta umożliwia szczegółową analizę naczyniową narządu w całości. Dodatkowo perfuzję krwi oceniano za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (FLI) czynnika fluorescencyjnego przenoszonego przez krew. Tworzenie się kości określono ilościowo za pomocą FLI przy użyciu sondy ukierunkowanej na hydroksyapatyt i analizy μCT. Rekrutację komórek macierzystych monitorowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) myszy transgenicznych, które eksprymują lucyferazy pod kontrolą promotora osteokalcyny. W tym artykule opisano i zademonstrowano przygotowanie przeszczepu allogenicznego, chirurgii ubytku kości calowej, protokoły badania metodą μCT do badania neowaskularyzacji i analizy tworzenia kości (w tym perfuzji in vivo środka kontrastowego) oraz protokół analizy danych.

Analiza 3D naczyń krwionośnych w wysokiej rozdzielczości wykazała znacznie większą angiogenezę u zwierząt z wszczepionymi autoprzeszczepami, szczególnie w odniesieniu do tworzenia tętniczek. W związku z tym perfuzja krwi była znacznie wyższa w grupie autoprzeszczepu do 7dnia po operacji. Zaobserwowaliśmy lepszą mineralizację kości i zmierzyliśmy większą formację kości u zwierząt, które otrzymały autoprzeszczepy. Implantacja autoprzeszczepu indukowała rekrutację rezydentnych komórek macierzystych do szwu kostnego przeszczep-gospodarz, gdzie komórki różnicowały się w komórki kościotwórcze między 7. a 10.dniem po operacji. Odkrycie to oznacza, że zwiększone tworzenie kości można przypisać zwiększonemu odżywianiu naczyniowemu, które charakteryzuje implantację autoprzeszczepu. Przedstawione metody mogą służyć jako optymalne narzędzie do badania regeneracji kości pod kątem ściśle związanego tworzenia kości i neowaskularyzacji.

Wprowadzenie

Utrata kości twarzoczaszki spowodowana urazem, resekcją guza, kraniotomią dekompresyjną i wadą wrodzoną rzadko goi się sama i stanowi wyraźną niezaspokojoną potrzebę kliniczną. Autologiczne przeszczepy kostne i allogeniczne przeszczepy kostne są szeroko stosowane w leczeniu tych schorzeń1.

Powszechnie przyjmuje się, że osteogeneza jest ściśle związana z angiogenezą2,3. W związku z tym pełne badanie proponowanej terapii regeneracji kości powinno obejmować kompleksowe badanie tworzącego się drzewa naczyniowego w całym miejscu ubytku. Istnieje kilka dostępnych metod charakteryzowania unaczynienia w modelach badawczych. Drzewo naczyniowe można zbadać za pomocą analizy histologicznej. Ponieważ histologia opiera się na cięciu tkanki, istnieje duże prawdopodobieństwo, że uzyskany obraz zostanie zniekształcony. Aby rozwiązać ten problem, można wykonać mikroskopię przyżyciową w celu zobrazowania nienaruszonych naczyń krwionośnych4; Jednak ta metoda jest ograniczona do obrazowania jednopłaszczyznowego. Skanowanie μCT próbek pobranych od zwierzęcia poddanego perfuzji środka kontrastowego umożliwia obrazowanie 3D sieci naczyniowej, która zasila miejsce regeneracji5. Takie podejście pozwala na bardzo szczegółowe zademonstrowanie unaczynienia narządu jako całości, a także na skrupulatną analizę rozmieszczenia naczyń krwionośnych. Ponadto μCT umożliwia różnicowanie różnych średnic naczyń krwionośnych, które charakteryzują różne podtypy naczyń krwionośnych.

Postawiliśmy hipotezę, że wszczepienie autoprzeszczepu calwarialnego wywoła większą neowaskularyzację niż implantacja przeszczepu allogenicznego, a ta zwiększona neowaskularyzacja doprowadzi z kolei do zwiększonej formacji kości. Aby zrealizować tę hipotezę, posłużyliśmy się różnymi technikami. Zbadaliśmy wzorce nowo powstałego drzewa naczyniowego, wykonując analizę opartą na μCT. Zmierzyliśmy perfuzję krwi za pomocą sondy fluorescencyjnej z pulą krwi. Następnie oceniliśmy mineralizację tkanki kostnej za pomocą FLI sondy skierowanej na hydroksyapatyt i analizę μCT. Na koniec monitorowaliśmy rekrutację i różnicowanie komórek macierzystych, wykonując BLI u myszy transgenicznych, u których lucyferazy ulegają ekspresji w komórkach osteokalcyno-dodatnich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół został opracowany zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki i wykorzystywania zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Hebrajskiego w Jerozolimie, Izrael (wniosek nr MD-12-13524-4), w placówce zatwierdzonej przez AAALAC, oraz przez IACUC Centrum Medycznego Cedars-Sinai (wniosek nr 3770). Zwierzęta były traktowane w ścisłej zgodności z wytycznymi NIH.

1. Przygotowanie allograftów kostnych

  1. Uśmierć myszy Balb/C w wieku od 7 do 8 tygodni lub dowolnej linii różniącej się od biorcy, stosując standardową metodę inhalacji CO2 lub wstrzykując dootrzewnowo 50 μl fenobarbitalu (65 mg/ml; 100 mg/kg). Potwierdź brak bicia serca i wykonaj zwichnięcie szyi. Alternatywnie, pobierz allografty z trucheł przechowywanych w temperaturze –20 °C i rozmrożonych przed pobraniem.
  2. Ogol obszar czaszki za pomocą maszynki do strzyżenia, prowadząc ją pod włos. Zdezynfekuj głowę truchła, nakładając 70% izopropanol. Rozetnij skórę głowy skalpelem nr 11 i usuń okostną.
  3. Za pomocą wiertarki stomatologicznej i trepana o średnicy wewnętrznej 4,5 mm wycinij okrągły fragment kości czaszki. Przenieś fragment kości do 100-mm plastikowej szalki zawierającej sterylną sól fizjologiczną. Na tym etapie można zaobserwować krew i tkankę miękką przytwierdzoną do fragmentu kości (Rysunek 1A). W ten sposób pobierz fragmenty kości od 22 dawców.
  4. Przechwyć jeden fragment kości za pomocą zakrzywionej pęsety. Dokładnie przetrzyj go aplikatorem z bawełnianym końcem i usuń wszelką tkankę mózgową, tkankę miękką oraz krew (Rysunek 1B). Ostrożnie odetnij za pomocą drobnych nożyczek wszelkie odłamki kostne, które pozostały przytwierdzone do przeszczepu, tak aby przeszczep miał idealnie okrągły kształt.
  5. Zanurz każdy przeszczep raz w probówce 15 ml zawierającej 70% etanol i dwukrotnie w probówkach 15 ml zawierających bufor fosforanowy (PBS), aby wypłukać etanol.
  6. Zamroź allograty w zamrażarce –80 °C w probówkach kriogenicznych na co najmniej 1 tydzień. Na tym etapie upewnij się, że allografty wyglądają na przezroczyste (Rysunek 1C).

2. Operacja defektu sklepienia czaszki

  1. Jako biorców należy wykorzystać myszy transgeniczne, które wykazują ekspresję lucyferazy pod kontrolą promotora osteokalcyny6.
  2. Zdezynfekuj końcówki narzędzi chirurgicznych, używając grzałki z szklanymi kuleczkami przez 30 s. Przenieś narzędzia do słoika z 70% izopropanolem, aby utrzymać warunki sterylności. Używaj sterylnych rękawiczek.
  3. Zapodaj myszy samicy w wieku od 7 do 8 tygodni znieczulenie poprzez doodbrzuszną iniekcję mieszaniny ketaminy i medetomidyny (odpowiednio 75 mg/kg i 1 mg/kg). Uciśnij kończynę zwierzęcia, aby upewnić się, że znajduje się ono w głębokiej narkozie. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska ono wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję na brzuchu.
  4. Ogól okolicę czaszki za pomocą trymera do włosów, prowadząc go pod włos. Nałóż krem do depilacji w celu usunięcia pozostałości sierści, a następnie zetrzyj go w czasie nie dłuższym niż 2 min za pomocą suchej gazy, a następnie gazy nasączonej solą fizjologiczną. Należy zachować ostrożność, aby preparat nie dostał się do oczu. Alternatywnie, przed depilacją można zastosować weterynaryjną maść do oczu jako dodatkową warstwę ochronną. Niezbędne jest usunięcie wszelkich śladów kremu depilacyjnego, aby uniknąć możliwego podrażnienia spowodowanego nadmierną ekspozycją na czynnik chemiczny. Zdezynfekuj skórę czaszki, nakładając 5% chlorheksydynę (Rycina 1D).
  5. Wstrzyknij podskórnie 5 mg/kg karprofenu rozpuszczonego w 200 µl soli fizjologicznej. Zastosuj weterynaryjną maść do oczu, aby zapobiec ich przesuszeniu, i przez cały czas trzymaj zwierzę na macie termicznej. Umieść zwierzę pod binokularem operacyjnym.
  6. Wykonaj nacięcie skóry czaszki o kształcie owalnym i długości 1 cm, używając cienkich nożyczek i pęsety (Rycina 1E). Chwyć okostną za pomocą pęsety zakrzywionej i odetnij ją cienkimi nożyczkami.
  7. Wywierć ubytek w czaszce 2 mm przed szwem lambdoidalnym, używając wiertarki stomatologicznej i trepanu o średnicy zewnętrznej 5 mm (Rycina 1F i G). Aby uniknąć przebicia opony twardej, wywierć otwór na trzy czwarte głębokości kości, a następnie odseparuj fragment kostny za pomocą szpatułki.
  8. W przypadku implantacji autoprzeszczepu, wyjmij fragment kości i przemyj go na plastikowej płytce o średnicy 10 mm zawierającej 10 ml sterylnej soli fizjologicznej, aby usunąć zanieczyszczenia. Nie usuwaj tkanek miękkich. W przypadku implantacji alloprzeszczepu, rozmroź go wcześniej, doprowadź do temperatury pokojowej (RT), a następnie przemyj.
  9. Umieść przeszczep kostny w ubytku za pomocą zakrzywionej pęsety tak, aby nie dotykał on krawędzi ubytku (Rycina 1H). Przyklej przeszczep do kości biorcy za pomocą żelu fibrynowego (5 µl fibrynogenu o stężeniu 46 mg/ml zmieszanego z 5 µl trombiny o stężeniu 25 U/ml).
  10. Zszyj skórę, używając nici Vicryl 4-0 (Rycina 1I). Na nacięcie chirurgiczne nałóż powidon jodowy. Należy zadbać o to, aby szwy nie zostały zanieczyszczone sierścią. Oznacz ucho myszy i wstrzyknij 0,25 mg/kg Antisedanu, aby odwrócić działanie znieczulające medetomidyny.
  11. Jeśli zwierzę nie obudzi się w ciągu 10 min, upewnij się, że znajduje się na ogrzewanej macie. Wstrzyknij 200 µl sterylnej soli fizjologicznej, a w razie potrzeby 0,1 mg/kg Antisedanu. Nie zwracaj zwierzęcia po zabiegu chirurgicznym do grupy innych zwierząt aż do pełnego powrotu do zdrowia.
  12. Przez tydzień trzymaj zwierzęta w oddzielnych klatkach, aby zapobiec rozszczelnieniu szwów. Przez kilka dni po operacji umieść w naczyniu Petriego na dnie klatki pokarm dla myszy nasączony wodą. Aby łagodzić ból pooperacyjny, wstrzykuj podskórnie 200 µl roztworu karprofenu o stężeniu 1 mg/ml rozcieńczonego w sterylnej soli fizjologicznej raz dziennie przez 3 dni po operacji.

Proces przeszczepiania tkanek; obrazy chirurgiczne z zastosowaniem hydrożelu AG; integracja naczyniowa.
Rycina 1. Przygotowanie allograftu kalwarialnego i operacja ubytku w sklepieniu czaszki. Fragment kości zostaje wyizolowany z obszaru sklepienia czaszki (A). Tkanki miękkie, szpik kostny i krew zostają usunięte za pomocą wymazu (B), a następnie przeszczep jest płukany w 70% etanolu, po czym wykonuje się dwa płukania w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (C, AG = allograft). Mysz biorca zostaje przygotowana do operacji poprzez ogolenie i dezynfekcję skóry w obrębie sklepienia czaszki (D). W skórze głowy wykonuje się nacięcie owalne i usuwa okostną (E). Następnie, za pomocą trepana o średnicy 5 mm, wykonuje się otwór w miejscu ubytku kalwarialnego (F). Fragment kości zostaje oddzielony przy użyciu szpatułki w kształcie łyżki, pozostawiając nienaruszony zatokę sagitalną górną (G). Allograft zostaje następnie umieszczony w ubytku i zabezpieczony żelem fibrynowym (H). Na koniec skórę zszywa się szwami (I). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Mikrotomografia komputerowa w celu charakterystyki drzewa naczyniowego

  1. Przygotować sól fizjologiczną z heparyną. Odważyć 2 000 U heparyny sodowej i umieścić ją w plastikowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 20 ml soli fizjologicznej i dobrze wstrząsnąć probówką. Napełnić 20-mililitrową strzykawkę z Luer-lock 15 ml podgrzanej soli fizjologicznej z heparyną i połączyć strzykawkę z zestawem do wkłuć w żyłę głową 23-G. Przymocować strzykawkę do pompy infuzyjnej i ustawić podawanie 10 ml w tempie 1 ml/min.
  2. Uśpić mysz, stosując dożylne wstrzyknięcie do jam brzusznej 50 µl fenobarbitalu (65 mg/ml; 100 mg/kg). Uszczypnąć kończynę zwierzęcia, aby upewnić się, że znajduje się ono w głębokiej sedacji. Unieruchomić mysz na grzbiecie na desce do fiksacji owiniętej chłonną wyściółką (Rysunek 2A). Umieścić unieruchomioną mysz w dygestorium, aby zapobiec ekspozycji personelu na opary.
  3. Naciąć skórę od brzucha do szyi, używając precyzyjnych nożyczek i pęsety (Rysunek 2B). Przeciąć ścianę brzusną aż do wyrostka mieczowatego (Rysunek 2C). Przeciąć klatkę piersiową wzdłuż jej bocznej strony. Unikać uszkodzenia płuc i serca, upewniając się, że serce jest w pełni odsłonięte. Użyć hemostatu do odsunięcia mostka (Rysunek 2D).
  4. Wprowadzić igłę motylkową na głębokość 3 mm do lewej komory serca (Rysunek 2E). Przykleić igłę do serca i ściany klatki piersiowej za pomocą kleju szybkoschnącego (Rysunek 2F).
  5. Natychmiast uruchomić pompę. Po minucie wypreparować żyłę główną dolną, aby obniżyć ciśnienie w naczyniach krwionośnych (Rysunek 2G). Przechylić deskę tak, aby ciecze odpływały od głowy. Prawidłowa perfuzja doprowadzi do odbarwienia wątroby i naczyń krwionośnych.
  6. Po zakończeniu perfuzji solą fizjologiczną z heparyną, przeprowadzić perfuzję 10 ml 4% formaldehydu. Unikać przedostania się pęcherzyków powietrza do naczyń oraz unikać ekspozycji na opary formaldehydu. Prawidłowa perfuzja formaldehydem spowoduje stwardnienie ogona. Przepłukać formaldehyd 10 ml soli fizjologicznej z heparyną.
  7. Przygotować radioprecyzyjny środek kontrastowy zgodnie z instrukcją producenta. Zazwyczaj wymaga to zmieszania związku, rozcieńczalnika i utwardzacza. Użyć pipet seryjnych i wymieszać roztwór w plastikowej probówce o pojemności 15 ml.
  8. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia mieszaniną środka kontrastowego z prędkością 1 ml/min. Obserwować naczynia wieńcowe, jelitowe i wątrobowe i upewnić się, że po perfuzji 2–3 ml zmieniają one kolor na żółty, co wskazuje na prawidłowy przebieg procedury (Rysunek 2H). Po zakończeniu perfuzji odciąć dren igły motylkowej, wyjąć samą tuszkę i owinąć ją papierem toaletowym, aby zapobiec wyciekowi roztworu do obszaru sklepienia czaszki. Pozostawić do polimeryzacji w 4 °C przez noc (O/N).
  9. Wypreparować obszar sklepienia czaszki (Rysunek 2I). Najpierw użyć skalpela, aby naciąć skórę jak najbardziej bocznie, unikając uszkodzenia analizowanego obszaru czaszki. Zlokalizować przeszczep kostny, a następnie za pomocą precyzyjnych nożyczek wyciąć kość czaszki w odległości 10 mm od przeszczepu.
  10. Zeskanować wyizolowany fragment kości sklepienia czaszki za pomocą skanera μCT; ustawić pole widzenia (FOV) na 20,5 mm, energię promieni Rentgena na 55 kVp, natężenie na 145 μA, stosując 1 000 projekcji na 360° i czas integracji 200 msec. Dostosować parametry μCT7 w celu obrazowania innych modeli defektów kostnych.
  11. Przeanalizować zrekonstruowane przekroje 2D wygenerowane przez oprogramowanie μCT. Upewnić się, że obszar zainteresowania został prawidłowo zeskanowany, a następnie zlokalizować defekt sklepienia czaszki. Ocenić jakość perfuzji. Po pomyślnej identyfikacji naczyń krwionośnych (Rysunek 2J), przejść do dekalkulacji próbki przy użyciu 6% kwasu trichlorooctowego (TCA) rozcieńczonego w podwójnie destylowanej wodzie (DDW).
  12. Ponownie zeskanować próbkę, używając parametrów wskazanych w sekcji 3.10. Zlokalizować szew lambdoidalny na zrekonstruowanych przekrojach 2D. Zdefiniować cylindryczną objętość zainteresowania (VOI) o wysokości 2 mm i średnicy 8 mm, styczną do szwu – jest to anatomiczne miejsce defektu.
  13. Przeprowadzić segmentację tkanki kostnej od tkanek miękkich za pomocą procedury globalnego progowania; ustawić próg dolny na 130 i zastosować ograniczony filtr Gaussa 3D (sigma [σ] = 2,0 i support = 2), aby częściowo stłumić szum w objętościach. Wygenerować rekonstrukcję 3D i upewnić się, że VOI jest prawidłowo ustawione (Rysunek 2K).
  14. Wygenerować mapę grubości za pomocą oprogramowania IPL i funkcji „dt_object_param” (Rysunek 2L).
    UWAGA: Funkcja ta opisuje objętość naczynia dla każdej średnicy naczynia.

Kroki sekcji myszy, lokalizacja nadnerczy, analiza histologiczna, schemat badania anatomicznego.
Rysunek 2. Perfuzja z użyciem środka radiokontrastowego poprzez dostęp przezserdecowy. Mysz jest przymocowana do deski ustalającej (A), a skórę nacinamy wzdłuż brzucha aż do szyi (B). Ścianę brzucha rozcinamy wzdłuż linii pośrodkowej aż do wyrostka mieczykowatego (C), a klatkę piersiową rozcinamy bocznie (D). Igłę motylkową wprowadzamy do lewej komory, unikając wprowadzenia jej do prawej komory, która jest wyraźnie ciemniejsza (E, prawa komora zaznaczona jest białą przerywaną linią), a następnie igłę przymocowujemy do serca i ściany klatki piersiowej (F). Do serca wpompowuje się sól fizjologiczną z heparyną (2–3 ml) i wykonuje przecięcie żyły głównej dolnej (G, biała strzałka wskazuje żyłę główną dolną). Przeprowadzamy perfuzję i wypłukanie formaldehydem (4%), a następnie perfuzję żółtego barwnika radiokontrastowego. Poprawność perfuzji będzie widoczna po oczyszczeniu naczyń krwionośnych, które zmienią kolor na żółty (H). Po polimeryzacji izoluje się obszar sklepienia czaszki (I, AG = allograft) i wykonuje obrazowanie za pomocą skanera µCT w celu potwierdzenia prawidłowej perfuzji (J, obszar zainteresowania zaznaczono kolorem pomarańczowym). Próbkę dekalcyfikuje się i skanuje ponownie (K), po czym generuje się kolorową mapę grubości (L). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

4. Obrazowanie fluorescencyjne mineralizacji kości i perfuzji krwi

  1. Zrekonstytuować sondy do stężenia 2 nmol/100 µl PBS w probówce 1,5 ml (użyć fluorescencyjnej sondy sprzężonej z bisfosfonianem do monitorowania mineralizacji kości oraz fluorescencyjnego czynnika przenoszonego przez krew do pomiaru perfuzji krwi). Delikatnie pipetować kilka razy, aby zapewnić jednorodne rozpuszczenie sondy.
  2. Na 24 h przed wyznaczoną sesją obrazowania wykonać obraz w punkcie zero; zanestezjować 3 myszy, stosując inhalację 100% tlenu medycznego z przepływem 2 L/min, wzbogaconego o 3% izofluranu w komorze indukcyjnej. Po uzyskaniu odpowiedniej anestezji obniżyć stężenie izofluranu do 1,5% – 2%.
  3. Nałożyć weterynaryjną maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, i upewnić się, że mata grzewcza jest przez cały czas włączona. Uszczypnąć kończynę zwierzęcia, aby upewnić się, że znajduje się ono w głębokiej anestezji. Nie zostawiać zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję brzuszna.
  4. Ogolić okolicę czaszki za pomocą maszynki do strzyżenia, prowadząc ją pod prąd wzrostu włosem. Usunąć pozostałości futra za pomocą kremu do depilacji. Każda pozostałość futra będzie zakłócać obrazowanie optyczne. Usunąć szwy za pomocą precyzyjnych nożyczek i pęsety.
  5. Umieścić trzy zwierzęta na platformie IVIS podgrzanej do 37 °C dla każdej sesji obrazowania. Ustawić czas ekspozycji na auto, pole widzenia na C i dostosować filtry. np. dla fluorescencyjnej sondy sprzężonej z bisfosfonianem, charakteryzującej się maksymalnym wzbudzeniem przy długości fali światła 680 nm, użyć filtra wzbudzenia 675 nm i filtra emisji Cy5.5. Podobnie, przy użyciu fluorescencyjnego czynnika przenoszonego przez krew z szczytem wzbudzenia przy długości fali światła 750 nm, użyć filtra wzbudzenia 710 nm i filtra emisji 780 nm.
  6. Obrazować myszy za pomocą oprogramowania Living Image, naciskając przycisk „Acquire”. Upewnić się, że obszar czaszki jest całkowicie widoczny (Rysunek 3B). W celu uzyskania szczegółowych wytycznych zaleca się zapoznać z publikacją Lim et al 20098.
  7. Pozwolić myszom obudzić się, wdychając 100% tlenu.
  8. Wstrzyknąć 2-nmol fluorescencyjnej sondy drogą dożylną przez ogon. Podczas wyznaczonej sesji obrazowania przeprowadzić badanie zgodnie z powyższym opisem.

5. Mikrotomografia komputerowa w regeneracji kości

  1. W celu ilościowego oznaczenia tworzenia kości, znieczul mysz poprzez inhalację 3% izofluranu, zgodnie z opisem w krokach 4.2 - 4.3. Przenieś mysz na stół skanera μCT i umieść ją w urządzeniu.
  2. Ustaw napięcie lampy rentgenowskiej skanera μCT na 55 kVp oraz natężenie na 145 µA (rozdzielczość średnia). Przy polu widzenia (FOV) wynoszącym 20,5 mm wykonaj skan wstępny (pojedynczy obraz rentgenowski) i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) rozciągający się od oczu myszy do tylnej części czaszki. Wykonaj skan CT, stosując 1000 projekcji na 360° i czas integracji wynoszący 200 msec.
  3. Zrekonstruuj przekroje 2D, stosując nominalną rozdzielczość przestrzenną 20 µm. Wyrównaj krawędzie ubytku do ustandaryzowanej pozycji za pomocą oprogramowania μCT9.
  4. Podobnie jak w kroku 3.20, zdefiniuj cylindryczną objętość zainteresowania (VOI) i zastosuj ograniczony filtr Gaussa 3D (σ = 0.8 oraz support = 1), aby częściowo stłumić szumy w objętościach. Wyodrębnij tkankę kostną z tkanek miękkich, stosując procedurę globalnego progowania.
  5. Wyznacz objętość zmineralizowanej tkanki kostnej w zdefiniowanej objętości zainteresowania.

6. Obrazowanie bioluminescencyjne rekrutacji i różnicowania komórek macierzystych

  1. Przygotować mysz do obrazowania zgodnie z opisem w sekcjach 4.2-4.4 i wybudzić zwierzęta poprzez inhalację 100% tlenu.
  2. Podać każdemu zwierzęciu 126 mg/kg lucyferyny żukowej poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, a następnie umieścić zwierzę z powrotem w komorze indukcyjnej. Po 2 min zanestetyzować zwierzę, stosując 3% izofluranu. Umieścić myszy na podgrzewanym stole systemu IVIS.
  3. W oprogramowaniu Living Image ustawić czas naświetlania na „auto”, a pole widzenia na C. Wykonać obrazowanie myszy 5 min po podaniu lucyferyny. Obrazować zwierzęta zgodnie z opisem w kroku 4.6, korzystając z trybu „Bioluminescence”. Zdefiniować obszary zainteresowania (ROI), ponieważ ekspresja transgenu różni się między myszami. Znormalizować sygnał z czaszki względem sygnału z ogona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Neowaskularyzację oceniono za pomocą analizy wolumetrycznej µCT oraz FLI z wykorzystaniem fluorescencyjnego środka kontrastowego do ilościowego określenia perfuzji krwi. Siedem dni po operacji skanowanie µCT wykazało znacznie większą objętość naczyń krwionośnych o małej i średniej średnicy u myszy, które otrzymały autoprzeszczepy, w porównaniu do myszy, które otrzymały alloprzeszczepy pobrane od C57BL/6 (Rycina 3A). Co ciekawe, w grupie autoprzeszczepów nowo powstałe drzewo naczyniowe zdawało się obejmow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem opisanych tu podejść do obrazowania multimodalnego jest umożliwienie skrupulatnego zbadania osi angiogeneza-osteogeneza w kontekście przeszczepu kości czaszki. Neowaskularyzację zobrazowano za pomocą protokołu μCT, co pozwoliło na dokładną demonstrację 3D w wysokiej rozdzielczości drzewa naczyniowego zasilającego cały ubytek czaszki. Dane μCT można łatwo analizować za pomocą zaawansowanych narzędzi, takich jak oprogramowanie IPL. Na przykład analiza grubości pokazana na rycinie 3C wykazała, że głów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy potwierdzają finansowanie z NIDCR (Grant No. DE019902) oraz z Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant nr 382/13).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL/C  MyszyHarlan laboratories57
FVB/n MyszyHarlan laboratories862
FenobarbitalWest waroNDC 0641-0477-25
Maszynka do strzyżenia włosów gryzoniWahl animal8786-451A
Skalpel 11Miltex27111504
Dental micro motormarathon III
5 mm trephineFine Science tools18004-50
Krem do depilacjiVeet
KetaVed (Ketamine)VedcoNDC 50989-996-06
DomitorZoetisNADA 141-267
karprofenNorbrook02000/4229
Maść do oczuPuralubeNDC 17033-211-38
Lornetka operacyjnaKent scientificKSCXTS-1121
Drobne nożyczki Narzędzia do nauk ścisłych14060-11
Pęseta do krzywejNarzędzia do nauk ścisłych11274-20
Szpatułka w kształcie łyżkiNarzędzia do nauki o naukach10090-13
Zestaw żeli Tisseel Fibin 718971Baxter
Narzędzia do nauki12060-01
szew vicryl 4-0EthiconJ392H
AntisedanZoetisNADA#141033
HeparynaSigmaH3393
20 ml luerlock BD302830
23G zestaw żył skóry głowy (igła motylkowa)BD367342
HemostatNarzędzia do nauki pięknej13008-12
Pompa strzykawkowaAparat HarvardPHD 2000
3-sec klej żelowy Szkocka
tablica do preparacji gryzoniLeica38DI02313
Microfil MV-122flow-techMV-122
μ Skaner CT40Scancoμ CT40
TCA6%SigmaT6399
Osteosense 680PerkinElmarNEV10020EX
Angiosense750PerkinElmarNEV10011
Oxigen 100%
Baxter1001936040
IVIS kinetykaKsenogen
Chrząszcz lucyferynaPromegaE160A
Uchwyt na igłę do izofluran (furan) klasy medycznej

Bibliografia

  1. Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
  2. Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
  3. Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
  4. Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
  5. Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
  6. Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
  7. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  8. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
  9. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
  10. Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
  11. Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
  12. Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562(2014).
  13. Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
  14. Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
  15. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
  16. Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
  17. Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
  18. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
  19. Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
  20. Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
  21. Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
  22. Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
  23. Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
  24. Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
  25. Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
  26. Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
  27. Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeszczepy kostne czaszkimikrotomografia komputerowa (micro CT)obrazowanie fluorescencyjneobrazowanie bioluminescencyjneanaliza regeneracji kościocena neowaskularyzacjirekrutacja komórek macierzystychsonda celowana na hydroksyapatytperfuzja solą fizjologiczną z heparyną
Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.