Artykuł metodologiczny

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

DOI:

10.3791/53459

⸱

22 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym parametrem decydującym o powodzeniu zabiegu przeszczepu kości jest unaczynienie obszaru otaczającego przeszczep. Postawiliśmy hipotezę, że implantacja autoprzeszczepu kostnego wywoła większą regenerację kości poprzez obfite tworzenie naczyń krwionośnych. Aby zbadać wpływ przeszczepu na neowaskularyzację w miejscu ubytku, opracowaliśmy metodę mikrotomografii komputerowej (μCT) w celu scharakteryzowania nowo tworzących się naczyń krwionośnych, która polega na ogólnoustrojowej perfuzji zwierzęcia polimeryzującym środkiem kontrastowym. Metoda ta umożliwia szczegółową analizę naczyniową narządu w całości. Dodatkowo perfuzję krwi oceniano za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (FLI) czynnika fluorescencyjnego przenoszonego przez krew. Tworzenie się kości określono ilościowo za pomocą FLI przy użyciu sondy ukierunkowanej na hydroksyapatyt i analizy μCT. Rekrutację komórek macierzystych monitorowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) myszy transgenicznych, które eksprymują lucyferazy pod kontrolą promotora osteokalcyny. W tym artykule opisano i zademonstrowano przygotowanie przeszczepu allogenicznego, chirurgii ubytku kości calowej, protokoły badania metodą μCT do badania neowaskularyzacji i analizy tworzenia kości (w tym perfuzji in vivo środka kontrastowego) oraz protokół analizy danych.

Analiza 3D naczyń krwionośnych w wysokiej rozdzielczości wykazała znacznie większą angiogenezę u zwierząt z wszczepionymi autoprzeszczepami, szczególnie w odniesieniu do tworzenia tętniczek. W związku z tym perfuzja krwi była znacznie wyższa w grupie autoprzeszczepu do 7dnia po operacji. Zaobserwowaliśmy lepszą mineralizację kości i zmierzyliśmy większą formację kości u zwierząt, które otrzymały autoprzeszczepy. Implantacja autoprzeszczepu indukowała rekrutację rezydentnych komórek macierzystych do szwu kostnego przeszczep-gospodarz, gdzie komórki różnicowały się w komórki kościotwórcze między 7. a 10.dniem po operacji. Odkrycie to oznacza, że zwiększone tworzenie kości można przypisać zwiększonemu odżywianiu naczyniowemu, które charakteryzuje implantację autoprzeszczepu. Przedstawione metody mogą służyć jako optymalne narzędzie do badania regeneracji kości pod kątem ściśle związanego tworzenia kości i neowaskularyzacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrata kości twarzoczaszki spowodowana urazem, resekcją guza, kraniotomią dekompresyjną i wadą wrodzoną rzadko goi się sama i stanowi wyraźną niezaspokojoną potrzebę kliniczną. Autologiczne przeszczepy kostne i allogeniczne przeszczepy kostne są szeroko stosowane w leczeniu tych schorzeń1.

Powszechnie przyjmuje się, że osteogeneza jest ściśle związana z angiogenezą2,3. W związku z tym pełne badanie proponowanej terapii regeneracji kości powinno obejmować kompleksowe badanie tworzącego się drzewa naczyniowego w całym miejscu ubytku. Istnieje kilka dostępnych metod charakteryzowania unaczynienia w modelach badawczych. Drzewo naczyniowe można zbadać za pomocą analizy histologicznej. Ponieważ histologia opiera się na cięciu tkanki, istnieje duże prawdopodobieństwo, że uzyskany obraz zostanie zniekształcony. Aby rozwiązać ten problem, można wykonać mikroskopię przyżyciową w celu zobrazowania nienaruszonych naczyń krwionośnych4; Jednak ta metoda jest ograniczona do obrazowania jednopłaszczyznowego. Skanowanie μCT próbek pobranych od zwierzęcia poddanego perfuzji środka kontrastowego umożliwia obrazowanie 3D sieci naczyniowej, która zasila miejsce regeneracji5. Takie podejście pozwala na bardzo szczegółowe zademonstrowanie unaczynienia narządu jako całości, a także na skrupulatną analizę rozmieszczenia naczyń krwionośnych. Ponadto μCT umożliwia różnicowanie różnych średnic naczyń krwionośnych, które charakteryzują różne podtypy naczyń krwionośnych.

Postawiliśmy hipotezę, że wszczepienie autoprzeszczepu calwarialnego wywoła większą neowaskularyzację niż implantacja przeszczepu allogenicznego, a ta zwiększona neowaskularyzacja doprowadzi z kolei do zwiększonej formacji kości. Aby zrealizować tę hipotezę, posłużyliśmy się różnymi technikami. Zbadaliśmy wzorce nowo powstałego drzewa naczyniowego, wykonując analizę opartą na μCT. Zmierzyliśmy perfuzję krwi za pomocą sondy fluorescencyjnej z pulą krwi. Następnie oceniliśmy mineralizację tkanki kostnej za pomocą FLI sondy skierowanej na hydroksyapatyt i analizę μCT. Na koniec monitorowaliśmy rekrutację i różnicowanie komórek macierzystych, wykonując BLI u myszy transgenicznych, u których lucyferazy ulegają ekspresji w komórkach osteokalcyno-dodatnich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Hebrajskiego w Jerozolimie, Izrael (Prośba nr. MD-12-13524-4), placówkę zatwierdzoną przez AAALAC, oraz przez Centrum Medyczne Cedars-Sinai IACUC (wniosek nr 3770). Zwierzęta były leczone w ścisłym przestrzeganiu wytycznych NIH.

1. Przygotowanie alloprzeszczepów kostnych

  1. Poddaj eutanazji 7-8-tygodniowe myszy Balb/C lub dowolny szczep inny niż biorca, stosując standardową metodę inhalacji CO2 lub dootrzewnowego wstrzyknięcia 50 μl fenobarbitalu (65 mg / ml; 100 mg / kg). Potwierdź brak bicia serca i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Alternatywnie, przeszczepy allogeniczne należy pobrać z tusz utrzymywanych w temperaturze –20 °C i rozmrożonych przed pobraniem.
  2. Ogol okolicę kości nazębnej za pomocą maszynki do strzyżenia włosów, nakładając ją w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów. Zdezynfekować głowę tuszy, stosując 70% izopropanolu. Przetnij skórę głowy za pomocą skalpela nr 11 i usuń okostną.
  3. Za pomocą wiertła dentystycznego i trepanacji o średnicy wewnętrznej 4,5 mm odłącz okrągły fragment kości nazębnej. Przenieś fragment kości do plastikowego naczynia o średnicy 100 mm zawierającego sterylną sól fizjologiczną. W tym momencie obserwuj krew i tkanki miękkie przyczepione do fragmentu kości (ryc. 1A). Pozyskaj w ten sposób fragmenty kości od 22 dawców.
  4. Przytrzymaj jeden fragment kości na raz za pomocą zakrzywionej pęsety. Przetrzyj go dokładnie za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i usuń tkankę mózgową, tkankę miękką i krew (ryc. 1B). Delikatnie odetnij wszelkie wióry kostne, które pozostały przyczepione do przeszczepu, za pomocą cienkich nożyczek, aby przeszczep miał idealnie zaokrąglony kształt.
  5. Zanurz każdy przeszczep raz w 15 ml probówce zawierającej 70% etanolu i dwa razy w 15 ml probówkach zawierających sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby przepłukać etanol.
  6. Przeszczepy allogeniczne należy zamrozić w lodówce w temperaturze –80 °C w krioprobówkach przez co najmniej 1 tydzień. W tym momencie upewnij się, że przeszczepy allogeniczne wydają się przezroczyste (ryc. 1C).

2. Chirurgia ubytku kości nazębnej

  1. Dla biorców należy użyć myszy transgenicznych, które eksprymują lucyferazy pod kontrolą promotora osteokalcyny6.
  2. Sterylizuj końcówki narzędzi chirurgicznych za pomocą podgrzewacza z kulkami szklanymi przez 30 sekund. Przenieś narzędzia do słoika zawierającego 70% izopropanolu, aby utrzymać sterylne warunki. Używaj sterylnych rękawiczek.
  3. Znieczulenie myszy w wieku od 7 do 8 tygodni przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i medetomidyny (odpowiednio 75 mg/kg i 1 mg/kg). Uszczypnij kończynę zwierzęcia, aby upewnić się, że jest głęboko znieczulona. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
  4. Ogol okolicę kości nazębnej za pomocą maszynki do strzyżenia włosów, nakładając ją w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów. Nałóż krem do usuwania włosów, aby usunąć wszelkie resztki sierści i wytrzyj go nie dłużej niż 2 minuty suchą gazą, a następnie gazą nasączoną solą fizjologiczną. Należy zachować ostrożność, aby nie dostać się do oczu. Alternatywnie, maść do oczu weterynarza może być nałożona przed depilacją jako dodatkowa warstwa ochronna dla oczu. Konieczne jest usunięcie wszystkich śladów kremu do depilacji, aby uniknąć ewentualnego podrażnienia spowodowanego nadmiernym narażeniem na środek chemiczny. Zdezynfekuj skórę głowy, nakładając 5% chlorheksydyny (ryc. 1D).
  5. Wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karprofenu rozcieńczonego w 200 μl soli fizjologicznej. Zastosuj maść do oczu weterynarza, aby zapobiec wysuszeniu i przez cały czas trzymaj zwierzę na podkładce termicznej. Umieść zwierzę pod lornetką operacyjną.
  6. Wykonaj owalne nacięcie na skórze głowy o długości 1 cm za pomocą cienkich nożyczek i pęsety (ryc. 1E). Przytrzymaj okostną za pomocą zakrzywionej pęsety i odetnij cienkimi nożyczkami.
  7. Wywiercić ubytek nazębny 2 mm przed szwem lambdoidalnym za pomocą wiertła dentystycznego i trepanacji o średnicy zewnętrznej 5 mm (ryc. 1F i G). Aby uniknąć penetracji opony twardej, wywiercić trzy czwarte drogi w kości i odłączyć fragment kości za pomocą szpatułki.
  8. Aby wszczepić autoprzeszczep, należy pobrać fragment kości i umyć go na plastikowej płytce o średnicy 10 mm zawierającej 10 ml sterylnej soli fizjologicznej w celu usunięcia zanieczyszczeń. Nie usuwaj tkanek miękkich. Aby wszczepić przeszczep allogeniczny, należy wcześniej rozmrozić przeszczep allogeniczny i znormalizować go do RT, a następnie umyć.
  9. Umieść przeszczep kostny w ubytku za pomocą zakrzywionej pęsety, aby nie dotykał marginesów ubytku (ryc. 1H). Przyklej przeszczep do kości gospodarza za pomocą żelu fibrynowego (5 μl 46 mg/ml fibrynogenu zmieszanego z 5 μl 25 U/ml trombiny).
  10. Zszyj skórę za pomocą szwu vicryl 4-0 (ryc. 1I). Nałóż powidon-jod na cięcie chirurgiczne. Należy zachować ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu szwu sierścią. Oznaczyć ucho myszy i wstrzyknąć 0,25 mg/kg leku Antisedan w celu odwrócenia znieczulającego działania medetomidyny.
  11. Jeśli zwierzę obudzi się w ciągu 10 minut, upewnij się, że znajduje się na rozgrzanej podkładce. Wstrzyknąć 200 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej, a w razie potrzeby wstrzyknąć 0,1 mg/kg leku Antisedan. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
  12. Trzymaj zwierzęta w oddzielnych klatkach przez tydzień, aby zapobiec otwieraniu szwów. Umieść mysią karmę namoczoną w wodzie na szalce Petriego na podłodze klatki na kilka dni po operacji. Wstrzyknij podskórnie 200 μl 1 mg/ml roztworu karprofenu rozcieńczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej raz dziennie przez 3 dni po zabiegu w celu leczenia bólu pooperacyjnego.

figure-protocol-1
Rycina 1. Przygotowanie alloprzeszczepu kości kalwarycznej i chirurgia ubytku kości kalwarycznej. Fragment kości jest izolowany z okolicy kości kalwarycznej (A). Tkanki miękkie, szpik kostny i krew są pobierane wymazy (B), a przeszczep jest płukany w 70% etanolu, a następnie dwukrotnie przepłukiwany solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (C, AG = przeszczep allogeniczny). Mysz biorczyni jest przygotowywana do zabiegu poprzez golenie i dezynfekcję skóry w okolicy łydki (D). W skórze głowy tworzy się owalne cięcie, a okostna zostaje usunięta (E). Następnie ubytek kalwaryczny jest wiercony za pomocą trepanacji (F) o średnicy 5 mm. Fragment kości odłącza się za pomocą szpatułki w kształcie łyżki, pozostawiając nienaruszoną zatokę strzałkową górną (G). Przeszczep allogeniczny jest następnie umieszczany w ubytku i zabezpieczany za pomocą żelu fibrynowego (H). Na koniec skóra jest zszywana (I). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Tomografia mikrokomputerowa do charakterystyki drzewa naczyniowego

  1. Przygotuj heparynizowaną sól fizjologiczną. Waż 2,000 U heparyny sodowej i umieść ją w plastikowej tubie o pojemności 50 ml. Dodaj 20 ml soli fizjologicznej i dobrze wstrząśnij probówką. Napełnij 20-mililitrową strzykawkę Luer lock 15 ml podgrzanej heparynizowanej soli fizjologicznej i podłącz strzykawkę do zestawu 23-G do żył skóry głowy. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić ją tak, aby pompowała 10 ml z prędkością 1 ml/min.
  2. Uspokoić mysz za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 50 μl fenobarbitalu (65 mg/ml; 100 mg/kg). Uszczypnij kończynę zwierzęcia, aby upewnić się, że jest głęboko uspokojone. Przymocuj mysz na plecach do płyty mocującej owiniętej chłonną wkładką powierzchniową (Rysunek 2A). Umieść stałą mysz w dygestorium, aby zapobiec narażeniu personelu na opary.
  3. Przeciąć skórę od brzucha do szyi za pomocą cienkich nożyczek i pęsety (ryc. 2B). Przeciąć ścianę brzucha aż do wyrostka mieczykowatego (ryc. 2C). Przetnij klatkę piersiową wzdłuż jej bocznej części. Unikaj zranienia płuc i serca oraz upewnij się, że serce jest całkowicie odsłonięte. Użyj hemostatu, aby cofnąć mostek (ryc. 2D).
  4. Wbić igłę motylkową 3 mm do lewej komory (Rysunek 2E). Przyklej igłę do serca i ściany klatki piersiowej za pomocą 3-sekundowego kleju (Rysunek 2F).
  5. Natychmiast aktywuj pompę. Po minucie należy wyciąć żyłę główną dolną w celu obniżenia ciśnienia w układzie naczyniowym (ryc. 2G). Przechyl deskę tak, aby płyny spływały z głowy. Udana perfuzja spowoduje oczyszczenie wątroby i naczyń krwionośnych.
  6. Po zakończeniu perfuzji soli fizjologicznej w heparyni należy przelać 10 ml 4% formaldehydu. Unikać przenikania pęcherzyków powietrza do układu naczyniowego i unikać narażenia na opary formaldehydu. Udana perfuzja formaldehydu spowoduje usztywnienie ogona. Wypłukać formaldehyd 10 ml heparynizowanej soli fizjologicznej.
  7. Nieprzezroczysty dla promieni rentgenowskich środek kontrastowy należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj będzie to wymagało zmieszania związku, rozcieńczalnika i utwardzacza. Użyć pipet serologicznych i wymieszać roztwór w plastikowej tubce o pojemności 15 ml.
  8. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z mieszaniną środków kontrastowych z szybkością 1 ml/min. Obserwuj naczynia krwionośne naczyń wieńcowych, jelitowych i wątrobowych i upewnij się, że żółkną po perfuzji 2-3 ml, co wskazuje na pomyślną perfuzję (ryc. 2H). Po zakończeniu perfuzji odetnij rurkę igły motylkowej, uzyskaj samą tuszę i owiń ją papierem toaletowym, aby zapobiec wyciekowi roztworu do okolicy kalwarii. Pozwolić na polimeryzację w temperaturze 4 °C O/N.
  9. Rozwiń okolicę kości kalwarycznej (ryc. 2I); Najpierw użyj skalpela, aby przeciąć skórę tak bokiem, jak to możliwe, unikając uszkodzenia interesującego obszaru czaszki. Zlokalizuj przeszczep kostny, a następnie użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć kość czaszki w odległości 10 mm od przeszczepu.
  10. Zeskanuj izolowaną próbkę kości nazębnej za pomocą skanera μCT; ustaw pole widzenia na 20,5 mm, energię promieniowania rentgenowskiego 55 kVp, intensywność 145 μA, używając 1 000 projekcji na 360° i czas całkowania 200 ms. Dostosuj parametry μCT7, aby zobrazować inne modele ubytków kostnych.
  11. Obserwuj zrekonstruowane w 2D wycinki, które zostały wygenerowane przez oprogramowanie μCT. Upewnij się, że obszar zainteresowania jest prawidłowo zeskanowany, a następnie zlokalizuj ubytek kalwarii. Oceń jakość perfuzji. Po pomyślnej identyfikacji naczyń krwionośnych (ryc. 2J) kontynuuj i odwapniaj próbkę za pomocą 6% kwasu trichlorooctowego (TCA) rozcieńczonego w wodzie podwójnie destylowanej (DDW).
  12. Ponownie zeskanować próbkę, stosując parametry wskazane w sekcji 3.10. Zlokalizuj szew Lambdoid w zrekonstruowanych wycinkach 2D. Określ cylindryczną objętość zainteresowania (VOI) o wysokości 2 mm i średnicy 8 mm, która jest styczna do szwu – jest to anatomiczne miejsce ubytku.
  13. Segmentacja tkanki kostnej od tkanek miękkich przy użyciu procedury globalnego progowania; ustaw dolny próg na 130 i zastosuj ograniczony filtr Gaussa 3D (sigma [σ] = 2,0 i wsparcie = 2), aby częściowo stłumić szumy w objętościach. Wygeneruj rekonstrukcję 3D i upewnij się, że VOI jest prawidłowo ustawiony (Rysunek 2K).
  14. Wygeneruj mapę grubości za pomocą oprogramowania IPL i funkcji "dt_object_param" (Rysunek 2L).
    UWAGA: Ta funkcja opisuje objętość naczynia dla każdej średnicy naczynia.

figure-protocol-2
Ryc. 2. Perfuzja przy użyciu środka nieprzezroczystego promieniotwórczo przez dostęp kardiologiczny. Mysz jest przymocowana do płyty mocującej (A), a skóra jest cięta wzdłuż brzucha aż do szyi (B). Ściana brzucha jest cięta wzdłuż linii przyśrodkowej aż do wyrostka mieczykowatego (C), a klatka piersiowa jest przecinana bocznie (D). Igłę motylkową wprowadza się do lewej komory, unikając wkłucia do prawej komory, która jest znacznie ciemniejsza (E, prawa komora jest oznaczona białą przerywaną linią), a igłę przymocowuje się do serca i ściany klatki piersiowej (F). Heparynizowana sól fizjologiczna (2-3 ml) jest pompowana do serca, a żyła główna dolna jest preparowana (G, biała strzałka wskazuje żyłę główną dolną). Formaldehyd (4%) jest perfuzjony i wypłukiwany; Następnie następuje perfuzja barwnika barwnikowego, nieprzezroczystego dla promieni rentgenowskich, środka kontrastowego. Udana perfuzja będzie widoczna po oczyszczeniu naczyń krwionośnych, które zmieniają kolor na żółty (H). Po polimeryzacji izoluje się okolicę kalwarii (I, AG = przeszczep allogeniczny) i obrazuje za pomocą skanera μCT w celu potwierdzenia prawidłowej perfuzji (J, objętość zainteresowania jest oznaczona kolorem pomarańczowym). Próbka jest odwapniana i ponownie skanowana (K), a następnie generowana jest kolorowa mapa grubości (L). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Obrazowanie fluorescencyjne mineralizacji kości i perfuzji krwi

  1. Rozpuść sondy do stężenia 2 nmol/100 μl PBS w probówce o pojemności 1,5 ml (użyj sondy fluorescencyjnej sprzężonej z bisfosfonianami do monitorowania mineralizacji kości i środka fluorescencyjnego na bazie krwi do pomiaru perfuzji krwi). Delikatnie odpipetuj kilka razy, aby zapewnić jednorodne rozpuszczenie sondy.
  2. Na 24 godziny przed wyznaczoną sesją obrazowania wykonaj zdjęcie w czasie zero; znieczulij 3 myszy za pomocą inhalacji 2 l/min 100% tlenu medycznego uzupełnionego 3% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po ustaleniu odpowiedniego znieczulenia należy obniżyć stężenie izofluranu do 1,5% – 2%.
  3. Nałóż maść do oczu weterynarza, aby zapobiec wysuszeniu i upewnij się, że podkładka termiczna jest zawsze włączona. Uszczypnij kończynę zwierzęcia, aby upewnić się, że jest głęboko znieczulona. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
  4. Ogol okolicę kości nazębnej za pomocą maszynki do strzyżenia włosów, nakładając ją w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów. Usuń resztki sierści za pomocą kremu do usuwania włosów. Wszelkie resztki futra będą zakłócać obrazowanie optyczne. Usuń szwy za pomocą cienkich nożyczek i pęsety.
  5. Umieść trzy zwierzęta na stoliku IVIS podgrzanym do 37 °C podczas każdej sesji obrazowania. Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, pole widoku na C i dostosuj filtry. Na przykład w przypadku sondy fluorescencyjnej sprzężonej z bisfosfonianami charakteryzującej się maksymalnym wzbudzeniem przy długości fali światła 680 nm należy zastosować filtr wzbudzający o długości fali 675 nm i filtr emisyjny Cy5,5. Podobnie, w przypadku stosowania krwionośnego środka fluorescencyjnego o szczytowym wzbudzeniu przy długości fali światła 750 nm, należy użyć filtra wzbudzającego o długości fali 710 nm i filtra emisyjnego o długości fali 780 nm.
  6. Zobrazuj myszy za pomocą oprogramowania Living Image, naciskając przycisk "Pobierz". Upewnij się, że obszar kalwarii jest całkowicie widoczny (ryc. 3B) Aby uzyskać kompleksowy przewodnik, poradź Lim i in. 20098.
  7. Pozwól myszom obudzić się, wdychając 100% tlenu.
  8. Wstrzyknąć sondę fluorescencyjną 2-nmol poprzez dożylne wstrzyknięcie ogonowe. Podczas wyznaczonej sesji obrazowania należy wykonać obrazowanie zgodnie z powyższym opisem.

5. Tomografia mikrokomputerowa do regeneracji kości

  1. W celu ilościowego określenia tworzenia się kości należy znieczulić mysz przez inhalację 3% izofluranu, jak pokazano w krokach 4.2 - 4.3. Przenieś mysz do stołu skanera μCT i umieść ją w skanerze.
  2. Ustaw energię potencjalną lampy rentgenowskiej skanera μCT na 55 kVp i intensywność średniej rozdzielczości 145 μA. Korzystając z pola widzenia 20,5 mm, wykonaj skanowanie zwiadowcze (pojedyncze zdjęcie rentgenowskie) i zdefiniuj obszar zainteresowania rozciągający się od oczu myszy do tyłu czaszki. Wykonaj tomografię komputerową, używając 1 000 projekcji na 360° i czasu integracji wynoszącego 200 ms.
  3. Zrekonstruuj przekroje 2D przy użyciu nominalnej rozdzielczości przestrzennej 20 μm. Wyrównaj marginesy defektów do znormalizowanej pozycji za pomocą oprogramowania μCT9.
  4. Podobnie jak w kroku 3.20, zdefiniuj interesującą objętość cylindryczną i zastosuj ograniczony filtr Gaussa 3D (σ = 0,8 i podpora = 1), aby częściowo stłumić szumy w woluminach. Segmentacja tkanki kostnej od tkanek miękkich za pomocą globalnej procedury progowania.
  5. Określ objętość zmineralizowanej tkanki kostnej w objętości będącej przedmiotem zainteresowania.

6. Obrazowanie bioluminescencyjne rekrutacji i różnicowania komórek macierzystych

  1. Przygotować mysz do obrazowania, jak pokazano w sekcjach 4.2-4.4 i obudzić myszy poprzez wdychanie 100% tlenu.
  2. Każdej myszy należy podać 126 mg/kg lucyferyny chrząszcza we wstrzyknięciu dootrzewnowym i umieścić zwierzę z powrotem w komorze indukcyjnej. Po 2 minutach znieczulić zwierzę za pomocą 3% izofluranu. Umieść myszy na rozgrzanym etapie IVIS.
  3. Za pomocą oprogramowania Living Image ustaw czas ekspozycji na "auto", a pole view na C. Wyobraź sobie myszy 5 minut po podaniu lucyferyny. Wyobraź sobie zwierzęta tak, jak pokazano w kroku 4.6, używając modalności "Bioluminescencja" Zdefiniuj obszary zainteresowania, ponieważ ekspresja transgenu różni się u myszy. Znormalizuj sygnał kalwaryczny do ogona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neowaskularyzacja została oceniona za pomocą analizy objętościowej μCT i FLI przy użyciu fluorescencyjnego środka krwionośnego do ilościowego określenia perfuzji krwi. Siedem dni po operacji tomografia komputerowa wykazała znacznie większą objętość naczyń krwionośnych o małej i średniej średnicy u myszy, które otrzymały autoprzeszczepy, niż u myszy, które otrzymały przeszczepy allogeniczne pobrane z C57BL / 6 (ryc. 3A). Co ciekawe, w grupie autoprzeszczepu nowo powstałe drzewo naczyniowe zdawało się doci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem opisanych tu podejść do obrazowania multimodalnego jest umożliwienie skrupulatnego zbadania osi angiogeneza-osteogeneza w kontekście przeszczepu kości czaszki. Neowaskularyzację zobrazowano za pomocą protokołu μCT, co pozwoliło na dokładną demonstrację 3D w wysokiej rozdzielczości drzewa naczyniowego zasilającego cały ubytek czaszki. Dane μCT można łatwo analizować za pomocą zaawansowanych narzędzi, takich jak oprogramowanie IPL. Na przykład analiza grubości pokazana na rycinie 3C wykazała, że głów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy potwierdzają finansowanie z NIDCR (Grant No. DE019902) oraz z Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant nr 382/13).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL/C  MyszyHarlan laboratories57
FVB/n MyszyHarlan laboratories862
FenobarbitalWest waroNDC 0641-0477-25
Maszynka do strzyżenia włosów gryzoniWahl animal8786-451A
Skalpel 11Miltex27111504
Dental micro motormarathon III
5 mm trephineFine Science tools18004-50
Krem do depilacjiVeet
KetaVed (Ketamine)VedcoNDC 50989-996-06
DomitorZoetisNADA 141-267
karprofenNorbrook02000/4229
Maść do oczuPuralubeNDC 17033-211-38
Lornetka operacyjnaKent scientificKSCXTS-1121
Drobne nożyczki Narzędzia do nauk ścisłych14060-11
Pęseta do krzywejNarzędzia do nauk ścisłych11274-20
Szpatułka w kształcie łyżkiNarzędzia do nauki o naukach10090-13
Zestaw żeli Tisseel Fibin 718971Baxter
Narzędzia do nauki12060-01
szew vicryl 4-0EthiconJ392H
AntisedanZoetisNADA#141033
HeparynaSigmaH3393
20 ml luerlock BD302830
23G zestaw żył skóry głowy (igła motylkowa)BD367342
HemostatNarzędzia do nauki pięknej13008-12
Pompa strzykawkowaAparat HarvardPHD 2000
3-sec klej żelowy Szkocka
tablica do preparacji gryzoniLeica38DI02313
Microfil MV-122flow-techMV-122
μ Skaner CT40Scancoμ CT40
TCA6%SigmaT6399
Osteosense 680PerkinElmarNEV10020EX
Angiosense750PerkinElmarNEV10011
Oxigen 100%
Baxter1001936040
IVIS kinetykaKsenogen
Chrząszcz lucyferynaPromegaE160A
Uchwyt na igłę do izofluran (furan) klasy medycznej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
  2. Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
  3. Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
  4. Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
  5. Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
  6. Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
  7. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  8. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
  9. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
  10. Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
  11. Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
  12. Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562(2014).
  13. Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
  14. Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
  15. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
  16. Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
  17. Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
  18. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
  19. Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
  20. Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
  21. Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
  22. Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
  23. Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
  24. Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
  25. Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
  26. Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
  27. Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cranial Bone GraftsMicro CT ScanningFluorescence ImagingBioluminescence ImagingBone Regeneration AnalysisNeovascularization AssessmentStem Cell RecruitmentHydroxyapatite Targeted ProbeHeparinized Saline Perfusion

Powiązane artykuły