Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Summary

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Abstract

Dla większości patogenów ssaków, badania profilowania ekspresji genów były ograniczone przez trudności techniczne w dokładnym ilościowym określeniu transkryptów genów patogenów z zakażonych tkanek. RNA patogenu stanowi niewielką część całkowitego RNA wyizolowanego z zakażonych próbek tkanek. Zarówno technologie mikromacierzy, jak i RNAseq mają trudności z generowaniem wiarygodnych odczytów dla genów patogenów o słabej ekspresji. Zmutowane szczepy patogenów o zmniejszonej proliferacji in vivo stanowią jeszcze większe wyzwanie. W tym miejscu opisujemy protokół profilowania ekspresji genów in vivo, który jest bardzo szybki, niezwykle czuły i wysoce powtarzalny. Protokół ten opracowaliśmy podczas naszych badań patogenu grzybowego Candida albicans w mysim modelu kandydozy rozsianej hematogennie. Korzystając z tego protokołu, udokumentowaliśmy przebiegi czasowe dynamicznie regulowanej ekspresji genu C. albicans podczas infekcji nerek i odkryliśmy nieoczekiwane cechy odpowiedzi ekspresji genów na leczenie lekami przeciwgrzybiczymi in vivo.

Introduction

Dynamika ekspresji genów zawiera istotne informacje o tym, jak komórka reaguje na zmiany środowiskowe. W przypadku zakażonego drobnoustroju dane dotyczące ekspresji genów mogą dostarczyć klinicznie istotnych informacji na temat tego, w jaki sposób patogen przystosowuje się do środowiska infekcji i powoduje uszkodzenia gospodarza. W ciągu ostatnich dwóch dekad badania ekspresji genów, zarówno in vitro, jak i in vivo, przyniosły dużą ilość danych i stworzyły podstawy do zrozumienia biologii zakażeń^1-3. Jednak obecne technologie profilowania, w tym mikromacierze i RNAseq, nie są optymalne do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji. RNA gospodarza stanowi przytłaczającą część (zwykle > 99%) całkowitego RNA wyizolowanego z zakażonych próbek tkanek. RNA gospodarza przyczynia się do wysokiego tła w mikromacierzach i dominuje w odczytach sekwencji z RNAseq. Izolacja komórek patogenu z zakażonej tkanki teoretycznie może pomóc we wzbogaceniu o RNA patogenu, ale stwarza dodatkowe problemy: wymaga dużych ilości zakażonej tkanki; procedura może być żmudna; a co najważniejsze, trudno jest zachować stan natywny lub integralność RNA podczas długotrwałego procesu. Aby uzyskać bardziej kompleksowe i dokładne dane na temat ekspresji genów patogenów podczas rzeczywistych infekcji, postanowiliśmy opracować protokół, który umożliwia wiarygodną i opłacalną kwantyfikację mniejszościowych gatunków RNA w mieszanej populacji RNA.

NanoString nCounter to niedawno opracowana platforma, która dokonuje bezpośredniego, multipleksowanego pomiaru ekspresji genów za pomocą cyfrowych par sond^{4, 5} z kodem kreskowym. Platforma ta ma poziom czułości porównywalny z QRT-PCR, ale nie wymaga amplifikacji enzymatycznej. Technologia nie obejmuje całego genomu, pozwala na wykrycie do 800 różnych genów w każdym teście. Dlatego tak ważne jest, aby wybrać geny informacyjne jako sondy do profilowania. Tutaj używamy badania profilowania ekspresji genów głównego ludzkiego patogenu, Candida albicans, podczas infekcji inwazyjnej jako przykładu, aby wykazać: 1) szczegóły techniczne procedur eksperymentalnych (protokół), 2) czułość, odtwarzalność i zakres dynamiczny tej metody (reprezentatywne wyniki) oraz 3) Ważne kwestie dotyczące projektowania i przeprowadzania eksperymentów w oparciu o ten protokół (dyskusja). Protokół ten można łatwo dostosować do różnych patogenów i został z powodzeniem zastosowany w wielu modelach infekcji^6-9.

Protocol

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Badań Biomedycznych w Los Angeles (protokół 011000) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi etycznego traktowania zwierząt. Myszy trzymano w klatkach w akredytowanym przez AAALAC ośrodku znajdującym się na terenie kampusu Instytutu Badań i Edukacji Harbor-UCLA. Opiekę nad nimi sprawował pełnoetatowy lekarz weterynarii specjalizujący się w medycynie zwierząt laboratoryjnych. Trzymanie w klatkach i hodowla odbywały się zgodnie z wytycznymi zawartymi w publikacji amerykańskiej publicznej służby zdrowia "Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych". Dołożono wszelkich starań, aby traktować myszy w sposób humanitarny. Przeżywalność i stan zdrowia myszy monitorowano trzy razy dziennie. Oczywiście chore, ospałe myszy zostały oddzielone od grupy i poddane eutanazji, aby zminimalizować cierpienie. Myszy zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu (210 mg/kg), zgodnie z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych.

1. Przygotowanie tkanek, odczynników i narzędzi

1. Do wszystkich badań należy używać samców myszy Balb/c o wadze 20-22 g. Zaszczep dożylnie trzy myszy na grupę eksperymentalną komórkami C. albicans 1 x 10⁶ fazy drożdżowej. Składaj zwierzęta w ofierze i pobieraj nerki w określonych punktach czasowych po zakażeniu. Umieść każdą nerkę w probówce z nakrętką, zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszej ekstrakcji RNA⁶,
   Uwaga: Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie ze szczegółowym opisem w Xu i wsp.^{Lokal mieszkalny}
2. Przed wyjęciem nerek z zamrażarki w temperaturze -80 °C należy przygotować następujące odczynniki i narzędzia:
   1. Otwórz zestaw do ekstrakcji całkowitego RNA. Dodać 2-merkaptoetanol (1% v/v) do buforu RLT i dobrze wymieszać (przygotować 2 ml na każdą próbkę).
   2. Przygotować fenol : chloroform : alkohol izoamylowy 25:24:1 (potrzeba 600 μl na każdą próbkę).
   3. Oznaczyć probówki homogenizacyjne typu M (rurka M) i schłodzić na lodzie.
   4. Oznacz probówki z nakrętką o pojemności 2 ml i dodaj około 300 μl kulek cyrkonu do każdej probówki.
   5. Dostępne są przyrządy do sprawdzania: dysocjator tkanek, bijak do kulek, wirówka stołowa z adapterami do probówek 50 ml i płytek 96-dołkowych, fotometr.

2. Ekstrakcja RNA z zakażonych tkanek

1. Wyjąć probówki z nerkami z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie. Dodać 1,2 ml buforu RLT z 2-merkaptoetanolem do każdej nerki. Zdekantować nerkę z buforem do probówek homogenizacyjnych typu M.
2. Homogenizować nerkę za pomocą dysocjatora tkankowego przy wstępnie załadowanym ustawieniu RNA_02.01.
3. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej w temperaturze pokojowej.
4. Przenieść 600 μl homogenatu do rurki z nakrętką zawierającą kulki cyrkonu. Zachowaj pozostały homogenat na lodzie.
5. Dodać 600 μl fenolu : chloroform : alkohol izoamylowy 25:24:1 do probówek z poprzedniego kroku.
6. Zamknij szczelnie pokrywki i wiruj na ubijaku przez 3 minuty w chłodni o temperaturze 4 °C.
7. Odwirować probówki o stężeniu 15 000 x g przez 5 minut w chłodni o temperaturze 4 °C.
8. Ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, dobrze wymieszaj z równą objętością 70% etanolu, a następnie załaduj na kolumnę wirową (załaduj dwukrotnie).
9. Przemyć kolumnę wirową raz buforem RW o pojemności 700 μl, a następnie dwukrotnie buforem RPE o pojemności 500 μl. Odwirować jedną dodatkową minutę w suchej probówce, aby usunąć pozostałą ciecz z kolumny wirowej. Wykonaj wszystkie etapy wirowania przy 8 000 x g.
10. Elute RNA za pomocą 50 μl H₂O. Zmierzyć stężenie RNA przy OD₂₆₀ za pomocą spektrofotometru.

3. Profilowanie ekspresji genów za pomocą cyfrowego kodu kreskowego

1. Zestaw kodów rozmrażania reportera (zielona rurka nasadkowa) i zestaw kodów przechwytywania (szara rurka nasadkowa) na lodzie.
2. Dodaj 130 μl buforu hybrydyzacyjnego do zestawu kodów reportera, odwróć, aby wymieszać i odwirować.
3. Dodać 20 μl mieszanki do każdej z 12 probówek reakcyjnych.
4. Dodać 10 μg całkowitego tkankowego RNA (w objętości 5 μl) do każdej probówki. Wymieszać pipetując.
5. Dodaj zestaw kodów przechwytywania 5 μl do każdej probówki. Wymieszaj, obracając rurkę, a następnie szybko odwiruj.
6. Inkubować reakcje w temperaturze 65 °C w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką O/N (~18 godzin).
7. Wyjąć jeden wkład z próbką w temperaturze -20 °C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
8. Wyjąć dwie płytki z odczynnikiem z 4 °C i odwirować przy 670 x g przez 2 minuty w wirówce stołowej.
9. Skonfiguruj stację przygotowawczą, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierz opcję wysokiej czułości.
10. Usuń reakcje z termocyklera i natychmiast załaduj stację przygotowawczą. Wybierz, aby uruchomić program o wysokiej czułości (3 godziny).
11. Po zakończeniu programu stacji przygotowawczej wyjmij wkład i uszczelnij tory przezroczystą taśmą. Nałóż olej mineralny na spód wkładu (tylko dla pierwszej generacji nCounter, późniejsze generacje nie wymagają tego kroku), a następnie załaduj wkład do analizatora cyfrowego.
12. Skonfiguruj analizator cyfrowy, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierz opcję skanowania w wysokiej rozdzielczości.
13. Wybierz opcję wysokiej rozdzielczości (600 pól), uruchom program skanowania (~4,5 godziny).
14. Po zakończeniu programu skanowania pobierz wyniki (lub wybierz opcję otrzymywania wyników pocztą e-mail) i zaimportuj nieprzetworzone dane do oprogramowania producenta. Oprogramowanie automatycznie sprawdzi jakość danych i podniesie flagi, jeśli jakość danych wykracza poza normalny zakres. Wykonaj regulację techniczną za pomocą wbudowanej funkcji (opcjonalnie, postępuj zgodnie z instrukcjami w oprogramowaniu), a następnie wyeksportuj dane jako plik Excel.
15. Znormalizuj dane przy użyciu jednej z następujących metod: całkowita liczba wszystkich genów w zestawie kodów; jeden lub kilka genów kontroli wewnętrznej; średnia geometryczna genów o wysokiej ekspresji (patrz dyskusja).
16. Oblicz średnie wartości ekspresji dla każdego genu (jeśli eksperyment przeprowadzono w powtórzeniach lub trzech powtórzeniach), a następnie oblicz stosunek poziomów ekspresji między różnymi grupami eksperymentalnymi.
17. (opcjonalnie) Analizuj i wizualizuj wyniki profilowania za pomocą funkcji wbudowanych w oprogramowanie nSolver lub program do klastrowania, taki jak MultiExperiment Viewer¹⁰.

Results

Jednym z głównych wyzwań dla profilowania ekspresji genów patogenów in vivo jest uzyskanie wystarczającej ilości odczytów z RNA patogenu. Biorąc pod uwagę niski odsetek transkryptów patogenu w całkowitym RNA, do każdej reakcji należy użyć dużej ilości całkowitego RNA (>10 μg). Platforma ma wyjątkową zaletę w tej perspektywie: wykorzystuje zarówno sondę wychwytującą, jak i sondę raportową w celu zwiększenia swoistości, tak aby przytłaczająca ilość RNA gospodarza nie powodowała znacznego poziomu szumu. Jak pokazano na rysunku 1 (zaadaptowanym z odnośnika 6), surowe liczby w tle z niezakażonej próbki tkanki (czerwone kropki) były poniżej 10, podczas gdy surowe liczby z dwóch zakażonych próbek tkanek (niebieskie kropki) były powyżej 10. Dane wyrażeń generowane przy użyciu tego protokołu są wysoce powtarzalne. Jak pokazano na rysunku 1 (zaadaptowanym z odnośnika 6), surowe zliczenia z dwóch replik biologicznych (niebieskie kropki, 48-godzinne próbki nerek po zakażeniu) miały bardzo dobrą korelację, przy czym wartość R-kwadrat wynosiła 0,945. Platforma zapewnia również wystarczający zakres dynamiczny, aby objąć naturalne poziomy ekspresji biologicznej (rysunek 1, surowe liczby mieściły się w zakresie od 10¹ do 10⁶).

Korzystając z zestawu sond określającego 248 genów reakcji środowiskowej, byliśmy w stanie dostrzec dwie fazy ekspresji genów patogenu (Rysunek 2, zaadaptowany z Ref. 6): wczesna odpowiedź ekspresji genów obejmuje geny, których poziomy RNA znacznie różnią się między inokulum a próbkami po 12 godzinach od infekcji (P<0,05 i >2-krotna zmiana ekspresji), a późna odpowiedź ekspresji genów obejmuje geny, których poziomy RNA znacznie różnią się między 12-godzinnym punktem czasowym po 48 godzinach od infekcji próbek (P<0,05 a >2-krotną zmianą ekspresji). Wyniki te wskazują, że ekspresja genu C. albicans jest dynamicznie regulowana podczas inwazyjnego zakażenia ssaczego gospodarza.

Rysunek 1. Surowe liczby z zakażonych i niezakażonych tkanek nerkowych (zaadaptowane z Ref. 6). Liczba próbek dla dwóch zakażonych (48 godzin po zakażeniu, niebieskie punkty danych) i jednej niezakażonej (czerwone punkty danych) próbek nerek jest przedstawiana jako wykres punktowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Ekspresja genów reagujących na środowisko C. albicans podczas infekcji inwazyjnej (zaadaptowana z Ref. 6). Zmiany w poziomach ekspresji podczas inwazji nerek myszy dla 248 genów C. albicans przedstawiono w formacie mapy cieplnej. Średnie wartości biologicznych potrójnych podano dla regulacji w górę (kolor żółty) i regulacji w dół (kolor niebieski) genów w 12, 24 i 48 godzinach po zakażeniu w stosunku do średnich poziomów inokulum (0 godzin). Nasycenie kolorów reprezentuje zakres zmiany ekspresji, z pełnym nasyceniem przy 10-krotnej regulacji w górę lub w dół. Fragmenty mapy cieplnej są rozszerzone, aby zilustrować reprezentatywne geny z wczesną regulacją w górę (na górze), późne geny (w środku) i wczesne geny regulowane w dół (na dole). W tych porcjach poszczególne próbki są prezentowane oddzielnie w celu zilustrowania odtwarzalności. Wczesne zmiany ekspresji definiujemy jako znaczące różnice między inokulum a próbkami z 12 godzin. Późne zmiany ekspresji definiujemy jako znaczące różnice między próbkami 12 i 48 godzinnymi. Istotność odnosi się do zmian >2-krotności i wartości p <0,05. Dane dla każdej próbki zostały znormalizowane do poziomów RNA z genu kontrolnego TDH3 przed obliczeniem średnich wartości. Nasze kryteria przypisania pozwalają niektórym dynamicznie regulowanym genom należeć zarówno do wczesnej, jak i późnej klasy ekspresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten został opracowany w celu optymalizacji profilowania transkrypcyjnego zakażonych drobnoustrojów przy użyciu platformy nanoString nCounter. Cała procedura, od pobrania tkanek do danych dotyczących odciągu, zajmuje mniej niż 48 godzin. Czas pracy wynosi około 4 godzin dla 12 próbek. Jedną z kluczowych zmiennych w tym protokole jest ilość buforu RLT dodawanego do tkanki na samym początku. Zbyt duża ilość buforu rozcieńczy homogenat i doprowadzi do obniżenia stężenia RNA, podczas gdy zbyt mała ilość buforu może prowadzić do powstania lepkich żeli po etapie ekstrakcji chloroformu fenolowego i nie pozostawić fazy wodnej do odzyskania RNA. Empirycznie wyznaczone optymalne objętości buforu RLT dla tkanek myszy (przy typowych rozmiarach) to: nerka (1,2 ml), język (1,0 ml) i płuca (2,0 ml). W przypadku patogenów mikrobiologicznych, zwłaszcza tych uprawianych w postaci nitkowatej, etap ubijania koralików pomaga rozbić grubą ścianę komórkową, aby w pełni uwolnić zawartość komórkową. Na etapie elucji, w celu zwiększenia końcowego stężenia RNA, eluat z pierwszej rundy można dodać z powrotem do kolumny i wymywać po raz drugi. Z jednej kolumny wirowej RNeasy można odzyskać około 100 μg całkowitego tkankowego RNA (~2 μg/μl x 50 μl). Jeśli potrzebna jest większa ilość RNA, można wykonać drugi preparat z pozostałego homogenatu tkankowego. Na wszelki wypadek nie wyrzucaj pozostałego homogenatu, dopóki nie zostanie zmierzone stężenie RNA.

W zależności od modelu infekcji, wielkości inokulum i szczepu patogenu, procent RNA patogenu w całkowitym RNA tkanki waha się od 0%-2% i zwykle mieści się w zakresie 0,05%-0,5%. Na przykład 10 μg całkowitego tkankowego RNA z nerki zakażonej C. albicans może wygenerować surową liczbę równą 10 ng czystego RNA C. albicans z hodowli in vitro (10 ng/10 μg = 0,1%). Ponieważ procent RNA patogenu w całkowitym tkankowym RNA różni się w szerokim zakresie, trudno jest określić ilość RNA patogenu w danej ilości całkowitego RNA. Aby uniknąć marnowania zestawu kodów (dla reakcji 250 genów x 192 koszt reakcji wynosi około 200 USD) na próbkach z RNA patogenu poniżej poziomu wykrywania, można przeprowadzić etap kontroli jakości RNA w celu określenia poziomu RNA patogenu w każdej próbce. Można to zrobić za pomocą Q-RTPCR lub małego zestawu kodów zawierającego kilka genów porządkowych.

Normalizacja za pomocą genów patogenów jest krytycznym krokiem, zanim profile ekspresji będą mogły być porównane między różnymi próbkami. Istnieją trzy powszechnie stosowane metody normalizacji. 1. Użyj całkowitej liczby wszystkich genów w zestawie kodów. 2. Użyj jednego lub kilku genów "sprzątania". 3. Użyj średniej geometrycznej (N^-ty pierwiastek z iloczynu N liczb) genów o wysokiej ekspresji. W przypadku dużego zestawu kodowego (>100 genów) zawierającego losowo wybrane sondy, dobrym wyborem może być użycie całkowitej liczby do normalizacji, ponieważ całkowita liczba niepowiązanych genów może wiernie odzwierciedlać ilość wejściowego RNA. W przypadku małego zestawu kodowego (<100 genów) zawierającego sondy skoncentrowane na określonym procesie (takim jak wzrost strzępek, biorąc pod uwagę, że geny wzrostu strzępek mają tendencję do współregulacji), niezbędny jest wybór jednego lub kilku genów porządkowych jako kontroli normalizacji. TDH3, gen metaboliczny o silnej ekspresji, dobrze służył jako kontrola w wielu eksperymentach. Trzecia metoda jest hybrydą metody 1 i 2, z naciskiem na równy udział genów o wysokiej ekspresji.

Chociaż platforma nCounter nie obejmuje całego genomu, umożliwia ilościowe określenie poziomu ekspresji dla maksymalnie 800 genów w jednym teście. Dlatego wybór najbardziej pouczających genów do analizy ma kluczowe znaczenie dla powodzenia profilowania. Zastosowano dwa podejścia do wyboru sond. Pierwsze podejście jest "oparte na wiedzy". Informacje z opublikowanych danych dotyczących ekspresji i funkcji są kompilowane w celu zbadania genów, które mogą być interesujące dla obecnego badania, takich jak geny odpowiedzi środowiskowej^6-9. Takie podejście umożliwia łatwe porównywanie danych profilowania in vivo z wieloma istniejącymi zestawami danych, zapewniając w ten sposób kontekst do interpretacji danych. Drugie podejście jest "oparte na eksploracji". Do badań wybiera się kategorię genów w genomie drobnoustrojów, taką jak wszystkie geny określające czynniki transkrypcyjne, kinazy lub białka ściany komórkowej. Podejście to pozwala na identyfikację nowych czynników wirulencji i odkrycie nowych zależności regulacyjnych w oparciu o dane z profilowania in vivo ⁶.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS Disocjator	Miltenyl Biotec	130-093-235
rurka gentelMACS M	Miltenyl Biotec	130-093-236
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
2-merkaptoetanol	Sigma	M-3148
Fenol: CHCl3:IAA	Sigma	P-2069
Koraliki cyrkonowe	Biospec Products	11079110zx
Mini-Beadbeater-16	Biospec Products	607
System analizy	nCounter Technologie
Zestawy kodów ekspresji genów	nCounter Technologie
nSolver Narzędzie analityczne	nanoString Technologies