Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Summary

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).

Abstract

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD). Główną trudnością w dostosowaniu PCD do nowoczesnych systemów i kolumn HPLC jest potrzeba stosowania cewek reakcyjnych o dużej objętości, które umożliwiają mieszanie odczynników, a następnie zachodzi reakcja derywatyzacji. Ta duża objętość martwa po kolumnie prowadzi do poszerzenia pasma, co skutkuje utratą obserwowanej skuteczności separacji, a nawet czułości wykrywania. W przepływie reakcji po derywatyzacji kolumnowej (RF-PCD) odczynniki do derywatyzacji są pompowane w kierunku przeciwnym do przepływu fazy ruchomej do jednego lub dwóch zewnętrznych portów kolumny przepływu reakcyjnego, gdzie mieszają się ze ściekami z kolumny wewnątrz fryty umieszczonej w łączniku końcowym kolumny. Technika ta pozwala na bardziej efektywne mieszanie ścieków z kolumny i odczynników do derywatyzacji, co oznacza, że objętość pętli reakcyjnych może zostać zminimalizowana lub nawet całkowicie wyeliminowana. Stwierdzono, że metody RF-PCD działają lepiej niż konwencjonalne metody PCD pod względem obserwowanej skuteczności separacji i stosunku sygnału do szumu. Kolejną zaletą technik RF-PCD jest możliwość monitorowania ścieków pochodzących z portu centralnego w stanie niedosytowym. RF-PCD jest obecnie testowany w stosunkowo niewielkim zakresie reakcji po kolumnie, jednak obecnie nie ma powodu, aby sugerować, że RF-PCD nie może być dostosowany do żadnej istniejącej jedno- lub dwuskładnikowej (o ile oba odczynniki są dodawane w tym samym czasie) reakcji derywatyzacji po kolumnie.

Introduction

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) w połączeniu z derywatyzacją po kolumnie (PCD) to potężne narzędzie, które jest przydatne w rozwiązywaniu wielu problemów w laboratorium analitycznym. Może być stosowany do wykrywania związków, które w inny sposób są niewykrywalne za pomocą zestawu detektorów^{dostępnych 1,2}, zwiększania sygnału docelowego analitu, co pozwala na niższe granice wykrywania i oznaczania ilościowego^3-5 lub selektywnego wyprowadzania docelowego analitu w celu uniknięcia efektów matrycowych⁶. Powszechnie stosowane reakcje PCD obejmują reakcję amin, takich jak aminokwasy, z orto-ftaladehydem^7-9, ninhydryną....

Protocol

Uwaga: Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) dla wszystkich materiałów i odczynników (tj. Karty charakterystyki dla metanolu). Należy zapewnić stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z rozpuszczalnikami i eluentem z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy zapewnić właściwe wykorzystanie kontroli inżynieryjnych HPLC, wagi analitycznej i oprzyrządowania detektora oraz zapewnić stosowanie środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami).

Uwaga: Protokół ten opisuje 3 metody technik derywatyzacj....

Results

Pierwszą metodą PCD, która została zaadaptowana do użycia przez RF-PCD, była derywatyzacja przeciwutleniaczy przy użyciu rodnika 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu (^DPPH•)²⁴. Reakcja ta została wprowadzona przez Koleva i wsp.²⁵ i od tego czasu jest szeroko stosowany. Detekcja polega na odbarwianiu rodnika DPPH^• w obecności reaktywnych form tlenu, stąd obecność przeciwutleniaczy powoduje spadek obserwowanej absorbancji. Reakcja ^DPPH• często wykorzystuje duże pęt.......

Discussion

RF-PCD pozwala na efektywne mieszanie odczynnika do derywatyzacji z postkolumną ściekową HPLC bez użycia cewek reakcyjnych, minimalizując efekty poszerzenia pasma i poprawiając wydajność separacji. Metody RF-PCD wykazały również poprawę odpowiedzi sygnału w odniesieniu do metody wykrywania. Camenzuli i wsp.^{Firma 28} jako pierwsza poinformowała o zastosowaniu kolumn przepływowych z DPPH^• do wykrywania ROS w próbce kawy espresso. Ich badania obejmowały analizę i optymalizację warunków RF w cel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przyrząd HPLC	Agilent	1290 Series HPLC
Dodatkowa pompa (pompy) do systemu derywatyzacji	Kolumna
RF	Niekomercyjne
	Waga analityczna Aldrich	Z290882
4-punktowa			waga analityczna
Stoper			Sprzęt nienaukowy
Fiolki do zbierania eluentów			Wystarczy dowolna mała fiolka z płaskim dnem, np. , fiolki HPLC Fiolki
		HPLC	Zależy od użytego
instrumentuNaczynia do fazy ruchomej i roztworu(ów) do derywatyzacjiSigma	Aldrich	Z232211
General Laboratory Szkło			Kolby miarowe, pipety, etc. Ilość i objętość będą zależeć od metody przygotowania próbki.
Metanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Octan amonu	Sigma Aldrich	17836
Amoniak	Sigma Aldrich	320145
acetonitryl	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4- Aminoantypiren	Acros Organics BVBA	AC103151000
Żelazocyjanek potasu	AnalaR	B10204-30