Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Summary

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Abstract

Ilościowe uchwycenie procesów rozwojowych jest kluczowe dla uzyskania modeli mechanistycznych oraz kluczowe dla identyfikacji i opisu zmutowanych fenotypów. Przedstawiono tu protokoły przygotowania zarodków i dorosłych zwierząt C. elegans do krótko- i długoterminowej mikroskopii poklatkowej oraz metody śledzenia i oznaczania ilościowego procesów rozwojowych. Wszystkie przedstawione metody oparte są na szczepach C. elegans dostępnych w Centrum Genetyki Caenorhabditis oraz na oprogramowaniu open-source, które można łatwo wdrożyć w dowolnym laboratorium, niezależnie od zastosowanego systemu mikroskopowego. Pokazano rekonstrukcję trójwymiarowego modelu komórki przy użyciu oprogramowania do modelowania IMOD, ręczne śledzenie znakowanych fluorescencyjnie struktur subkomórkowych za pomocą wielofunkcyjnego programu do analizy obrazu Endrov oraz analizę korowego przepływu kurczliwego za pomocą PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB). Omówiono również, w jaki sposób metody te można również zastosować do ilościowego uchwycenia innych procesów rozwojowych w różnych modelach, np. śledzenia komórek i linii, śledzenia przepływu pęcherzyków.

Introduction

Dzięki stałym ulepszeniom białek fluorescencyjnych, inżynierii genomu, mikroskopii świetlnej oraz oprogramowania i sprzętu komputerowego, możliwe jest teraz rejestrowanie rozwoju wielu organizmów modelowych w niespotykanej dotąd rozdzielczości czasoprzestrzennej. Dzięki temu badacze mogą zadawać pytania, na które wcześniej nie można było odpowiedzieć, lub ponownie przyjrzeć się znanym procesom rozwojowym w celu poszukiwania przeoczonych aspektów. Postęp ten zapoczątkował dziedzinę ilościowej biologii rozwoju, której celem jest przekształcenie jakościowych, nieformalnych modeli w modele ilościowe poprzez dokładne pomiary i analizy statystyczne.

Protocol

1. Przygotowanie zarodków C. elegans do mikroskopii poklatkowej przy użyciu mikrogranulek

1. Przenieś ciężarne dorosłe robaki za pomocą szpikulca (drut platynowy) do kropli buforu M9 i usuń bakterie, najpierw energicznie mieszając, a następnie przenosząc każdego robaka do sąsiedniej kropli M9 za pomocą rzęsy zamontowanej na końcówce wykałaczki/pipety lub użyj spiczastej szklanej kapilary.
2. Rozcieńczyć dyspersję zawierającą kulki polistyrenowe o średnicy 20 μm 10-krotnie w buforze M9 (1 l buforu M9 zawiera 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, a po autoklawowaniu (20 min, 120 °C) dodać dodatkowy 1 ml 1....

Results

Korzystając z protokołów 2, 3 i 4, wykonuje się obrazowanie poklatkowe gonad u dorosłych dzikich typów C. elegans (szczep OD58 (unc-119(ed3) III; ltIs38[pAA1; pie-1::GFP::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]), wyrażający marker błonowy z promotora linii zarodkowej). Skupiając się na zwrocie gonady, na podstawie danych mikroskopowych generowany jest model 3D komórek rozrodczych (ryc. 2). Model ten pozwala analizować zmiany wielkości komórek podczas tranzytu komórek od ramienia dystalnego do proksymalneg.......

Discussion

Dzięki śledzeniu obiektów w trakcie rozwoju, w szczególności śledzeniu jądrowym, możliwe było wyjaśnienie centralnych mechanizmów wzorcowania embriogenezy C. elegans ^1,23,24. Rozszerzając tę strategię na wyższą przepustowość, udało się ostatnio odkryć dodatkowe reguły wzorców i zaproponować metodę dedukowania reguł wzorców de novo¹⁰. Jednak w przypadku wielu mutantów dokładne wady wzoru są nadal nieznane. Opisane tutaj metody są narzędziami, które mogą być pomocne w ich wyjaśnieniu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop stereoskopowy	Motic/VWR	OT4005S	Mikroskop stereoskopowy do preparowania i montażu
mikrosfer polistyrenowych Polybead,	Polysciences	18329	Montaż zarodka
20 &mikro; m
Mikrosfery polistyrenowe Polybead,	Polysciences	876	Montaż dla dorosłych zwierząt
0,1 i mikro; m
Szkiełka mikroskopowe	VWR	631-0902	Mocowanie dla dorosłych zwierząt
Szkło osłonowe 18x18 mm	VWR	631-1331	Mocowanie zarodków/dorosłych
Szkło osłonowe 24x60 mm	VWR	631-1339	Mocowanie zarodków
Skalpel	VWR	233-5455	Usuwanie zarodków
Rurka silikonowa	VWR	228-1501	Rurka do pipety doustnej
30 mm Filtr membranowy PTFE	NeoLab	Jul-01	Filtr do pipety doustnej
Rurki kapilarne	VWR	621-0003	Końcówka pipety do pipety doustnej
Wazelina	Roth	E746.1	Montaż zarodka/dorosłego
Agar	Roth	5210.5	Montaż dla dorosłych zwierząt
Di-wodorofosforan potasu	Roth	P018.2	Bufor M9 Fosforan
di-sodowy	Roth	P030.2	Bufor M9
Chlorek sodu	Roth	3957.1	Bufor M9
System konfokalny VisiScope Spinning Disc	Visitron Systems	n/a	Mikroskopia konfokalna