Kolumna z przepływem kurtyny: optymalizacja wydajności i czułości

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do działania i optymalizacji kolumny Active Flow Technology (AFT) w trybie Curtain flow (CF) dla zwiększenia wydajności separacji.

Streszczenie

Technologia Active Flow (AFT) to forma technologii kolumnowej, która zwiększa wydajność separacji kolumny HPLC poprzez zastosowanie specjalnie specjalnie zbudowanego wieloportowego łącznika końcowego. Kolumny Curtain Flow (CF) należą do zestawu kolumn AFT, w szczególności kolumna CF jest zaprojektowana tak, że próbka jest wstrzykiwana do promieniowego centralnego obszaru złoża, a przepływ kurtynowy fazy ruchomej otaczający wtrysk substancji rozpuszczonej zapobiega promieniowemu rozpraszaniu próbki do ściany. Kolumna funkcjonuje jako kolumna o "nieskończonej średnicy". Celem projektu jest przezwyciężenie niejednorodności promieniowej łoża kolumny, a jednocześnie maksymalizacja obciążenia próbki w promieniowym obszarze centralnym łoża kolumny, co służy zwiększeniu czułości wykrywania. Opisany tutaj protokół przedstawia konfigurację systemu i kolumny CF oraz proces dostrajania zoptymalizowanej "wirtualnej" kolumny o nieskończonej średnicy.

Wprowadzenie

W ostatnich latach technologia kolumnowa dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) znacznie się rozwinęła; szczytowe zdolności znacznie wzrosły, głównie dzięki zastosowaniu mniejszych rozmiarów cząstek i bardziej wydajnych cząstek powłoki rdzenia. Ponieważ separacje są na ogół bardziej wydajne, efektem przepływu jest wzrost czułości, ponieważ piki są teraz ostrzejsze, a tym samym wyższe^{od 1 do 8}.

Niemniej jednak, niejednorodność złoża promieniowego jest nadal czynnikiem ograniczającym wydajność wszystkich kolumn, ale nie jest to nowa historia, ponieważ chromatografowie wiedzą o tym od wielu lat. Łoża słupów są niejednorodne zarówno w kierunku promieniowym^9-12, jak i wzdłuż osi słupa^10,12-15. Szczególnie efekt ściany jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do utraty wydajności separacji^7,16-18. Shalliker i Ritchie⁷ dokonali niedawno przeglądu aspektów niejednorodności łoża kolumny, dlatego nie ma potrzeby dalszego omawiania tego tematu. Chociaż wystarczy powiedzieć, że różnice w gęstości upakowania łoża kolumny i efekty ścian prowadzą do zniekształcenia czopa substancji rozpuszczonej, tak że pasma wymywają się przez kolumnę w korkach, które przypominają częściowo wypełnione miski na zupę, a nie cienkie, płaskie, stałe krążki7^{, które są} zwykle przedstawiane w podstawowych tekstach nauczania. Gdy przeprowadzono eksperymenty w taki sposób, że można było uwidocznić migrację substancji rozpuszczonej przez złoże, profile korków wewnątrz kolumny były częściowo puste, a sekcja ogonowa pasma jest w dużej mierze elementem ściennym korka próbki. Efekt końcowy jest taki, że potrzeba znacznie więcej płytek, aby oddzielić te "częściowo puste" korki, niż byłoby to wymagane, gdyby tarcze były solidne i płaskie^12,14,17. Aby przezwyciężyć problemy związane z poszerzaniem pasma związane z efektami ścian i zmiennością promieniowej gęstości upakowania, zaprojektowano nową formę technologii kolumnowej znaną jako technologia aktywnego przepływu (AFT)^7,19. Celem tej konstrukcji było usunięcie efektów ścian poprzez fizyczne oddzielenie elucji rozpuszczalnika wzdłuż obszaru ścianki, od elucji fazy ruchomej w promieniowym obszarze centralnym kolumny¹⁹. Istnieją dwa główne typy kolumn AFT; Kolumny z równoległym przepływem segmentowym (PSF) i kolumny z przepływem kurtynowym (CF) ⁷. Ponieważ protokół ten ma na celu wykorzystanie i optymalizację kolumn CF, kolumny PSF nie będą dalej omawiane.

Przepływ kurtyny (CF)

Formaty kolumn Curtain Flow (CF) wykorzystują końcówki AFT zarówno na wlocie, jak i wylocie kolumny. Końcówki AFT składają się z pierścieniowej frytki umieszczonej wewnątrz złączki wieloportowej. Fryta składa się z trzech części: porowatej promieniowej części środkowej, która jest wyrównana z centralnym portem złączki końcowej, porowatej części zewnętrznej, która jest wyrównana z portem (portami) obwodowym złączki końcowej oraz nieprzepuszczalnego pierścienia, który oddziela dwie porowate części, zapobiegając jakiemukolwiek przepływowi krzyżowemu między promieniowymi obszarami środkowymi i zewnętrznymi fryty¹⁹. Rysunek 1 ilustruje konstrukcję fryty AFT, a rysunek 2 ilustruje format kolumny CF. W tym trybie pracy (CF) próbka jest wstrzykiwana do promieniowego centralnego portu złączki wlotowej, podczas gdy dodatkowa faza ruchoma jest wprowadzana przez port obwodowy wlotu, aby "zasłonić" migrację substancji rozpuszczonych przez promieniowy obszar centralny kolumny. W związku z tym próbka wchodzi do złoża w promieniowym centralnym obszarze kolumny, przy czym zewnętrzny obszar kolumny ma fazę ruchomą tylko przez nią przechodzącą. Badania wykazały, że stosunek objętościowego natężenia przepływu wynoszący około 40:60 (centralny:port peryferyjny) dla końcówki wlotowej kolumny o średnicy wewnętrznej (ID) 4,6 mm wynosi^{optymalne 6,7,16}. Wylot AFT kolumny CF umożliwia regulację przepływu centralnego i obwodowego do ich względnej części i może być zmieniany do prawie dowolnego pożądanego stosunku poprzez zarządzanie ciśnieniem. Optymalizacja kolumny CF może znacznie poprawić różne aspekty funkcjonalne technologii kolumn, takie jak wydajność separacji lub czułość wykrywania. W ten sposób ustanawia się kolumnę "bez ścian", o "nieskończonej średnicy" lub "wirtualną"^6,10,18,20. Celem kolumn CF jest aktywne zarządzanie migracją próbki przez kolumnę, aby zapobiec przedostawaniu się próbki do obszaru ściany. W ten sposób stężenie substancji rozpuszczonej po wyjściu do detektora jest maksymalizowane, zwiększając czułość około 2,5 razy większą niż w przypadku konwencjonalnego formatu kolumnowego przy zastosowaniu detekcji ultrafioletowej (UV)¹⁶, a nawet większą przy zastosowaniu detekcji widma masowego⁶.

Kolumny CF idealnie nadają się do próbek o niskim stężeniu, ponieważ zwiększa się czułość wykrywania. Co więcej, idealnie nadają się do łączenia z detektorami o ograniczonym natężeniu przepływu, takimi jak spektrometr masowy (MS)⁶. Na przykład kolumna AFT w formacie średnicy wewnętrznej 4,6 mm może być dostrojona tak, aby dostarczała taką samą objętość rozpuszczalnika do detektora, jak standardowa kolumna o średnicy wewnętrznej 2,1 mm, gdy pracuje z tymi samymi prędkościami liniowymi, dostosowując wyjściowy przepływ centralny do 21%. Podobnie, kolumna AFT może być również dostrojona tak, aby dostarczała takie samo obciążenie objętościowe do detektora, jak kolumna o średnicy wewnętrznej 3,0 mm, dostosowując wyjściowy przepływ centralny do 43%. W rzeczywistości każdy "wirtualny" format kolumny może być wyprodukowany zgodnie z wymogiem analitycznym^6,18,22. Zastosowanie tych specjalnie zaprojektowanych łączników końcowych na wlocie i wylocie zapewnia utworzenie prawdziwej kolumny bez ścian

.

Istnieją dwa sposoby ustawienia systemu dostarczania rozpuszczalnika do centralnego i peryferyjnego portu wlotu: system dzielonego przepływu⁶ i system dwóch pomp^6,7. Rysunek 3 ilustruje każdą z tych konfiguracji systemu CF.

System dzielonego przepływu

W systemie z dzielonym przepływem (Rysunek 3A) przepływ pompy prowadzący do wtryskiwacza jest dzielony przez wtryskiwacz za pomocą trójnika o zerowej objętości martwej, gdzie jeden strumień przepływu fazy ruchomej jest podłączony do wtryskiwacza, który jest następnie podłączony do centralnego portu końcówki wlotowej kolumny. Drugi strumień przepływu fazy ruchomej omija wtryskiwacz i jest podłączony do portu obwodowego na wlocie kolumny. Podczas rozdzielania przepływu procentowy strumień przepływu jest regulowany na 40:60 (środek:obrzeże) przed podłączeniem przewodów do kolumny, tj. od wtryskiwacza do środka i pompy do obwodu.

System dwóch pomp

Kolumna CF wymaga dwóch strumieni przepływu na końcu wlotu kolumny. W zależności od typu automatycznego podajnika próbek/wtryskiwacza urządzenia HPLC, konfiguracja z dzielonym przepływem może nie być możliwa, a więc CF można uzyskać za pomocą 2 pomp (rysunek 3B²¹). Każda pompa jest przydzielana i podłączana do portu centralnego lub peryferyjnego, a natężenie przepływu jest ustawione tak, aby reprezentowało 40% przepływu dla portu centralnego i 60% dla portu peryferyjnego. Na przykład, jeśli całkowite natężenie przepływu wynosi 1,0 ml ^min-1, natężenie przepływu pompy centralnej jest ustawione na 0,4 ml ^min-1, a pompa obwodowa jest ustawiona na 0,6 ml ^min-1.

Wybór trybu działania zależy w dużej mierze od oprzyrządowania HPLC i chromatograficznego trybu działania. Na przykład w niektórych automatycznych podajnikach próbek może dojść do zmiany ciśnienia między położeniem obciążenia próbki a pozycją wtrysku próbki, zakłócając stosunek przepływu dzielonego, dlatego w tym przypadku zaleca się konfigurację podwójnej pompy w celu uzyskania optymalnej wydajności CF. Niezależnie od konfiguracji systemu dostarczania rozpuszczalnika wybranego dla wlotu kolumny CF, optymalizacja wylotu CF pozostaje taka sama. Centralny port wylotowy kolumny CF jest podłączony do detektora światła ultrafioletowego (UV-Vis) z najmniejszą możliwą objętością rurki, aby zminimalizować skutki martwej objętości po kolumnie. Ponieważ kolumny CF naśladują kolumny o wąskim otworze, martwa objętość między wylotem kolumny a detektorem jest szkodliwa dla wydajności separacji kolumny CF. Bardzo ważne jest, aby zapewnić jak najmniejszą objętość przewodów między portem centralnym a detektorem UV-Vis, aby zminimalizować skutki martwej objętości, takie jak poszerzenie pasma, utrata wydajności i czułości. W związku z tym zaleca się stosowanie węży o wąskim otworze (średnica wewnętrzna 0,1 mm), aby umożliwić łatwą regulację ciśnienia bez dodawania nieodpowiedniej objętości martwej. Rurki są również podłączone do portu peryferyjnego i kierowane do odpadów. Po wyjściu kolumny CF współczynnik segmentacji można dostosować do dowolnego wskaźnika, który odpowiada celom analityka. Na przykład, gdy używany jest CF o średnicy wewnętrznej 4,6 mm, często wygodnie jest ustawić współczynnik na 43:57 lub 21:79 (środek: peryferium), aby z szacunkiem emulować "wirtualną" kolumnę o średnicy wewnętrznej 3,0 mm lub kolumnę o średnicy wewnętrznej 2,1 mm. W ten sposób wydajność separacji jest łatwo określana na podstawie kryterium. Współczynnik segmentacji mierzy się poprzez ważenie ilości przepływu wychodzącego z detektora, który jest podłączony do portu centralnego, i przepływu wychodzącego z portu peryferyjnego w danym okresie. Następnie można określić procentowy przepływ przez każdy port, a proporcje można regulować, zmieniając długość dołączonego przewodu lub używając rurki o innej średnicy wewnętrznej (id).

Ten protokół wideo szczegółowo opisuje działanie i procedury optymalizacyjne kolumny CF w celu zwiększenia wydajności chromatograficznej.

Protokół

Uwaga: Proszę zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) dla wszystkich materiałów i odczynników przed użyciem (np. MSDS dla metanolu). Należy zapewnić stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z rozpuszczalnikami i eluentem z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy zapewnić właściwe wykorzystanie kontroli inżynieryjnych HPLC, wagi analitycznej i oprzyrządowania detektora oraz zapewnić stosowanie środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami).

Uwaga: Ten protokół zawiera instrukcje, jak używać kolumny CF w systemie HPLC sprzężonym z detektorem UV-Vis. Protokół został napisany przy założeniu, że czytelnik posiada podstawową wiedzę i doświadczenie w chromatografii.

1. Konfiguracja instrumentu HPLC

Uwaga: Ta sekcja może być zmieniona zgodnie z potrzebami analityków, tj. wyborem rozpuszczalników, długości fali detektora i natężenia przepływu, które są odpowiednie dla interesującej próbki.

1. Przygotuj przyrząd HPLC ze 100% ultraczystą wodą (np. Wodą Milli-Q) dla linii A i 100% metanolem dla linii B jako fazą ruchomą i przepłucz pompy zgodnie z wymaganiami producenta.
2. Ustaw detektor UV-Vis na 254 nm.
3. Wybierz tryb konfiguracji z podziałem przepływu przed wtryskiem lub konfigurację z podwójnym przepływem pompy. W przypadku trybu dzielonego przepływu przejdź do kroku 2, a w przypadku trybu podwójnej pompy przejdź do kroku 3.

2. Ustawienia systemu z dzielonym przepływem

1. Odłączyć przewód pompy od zaworu wtryskiwacza automatycznego próbnika.
2. Przymocuj trójnik do przewodu pompy.
3. Podłącz 15-centymetrowy kawałek rurki o średnicy wewnętrznej 0.13 mm do każdego portu trójnika.
4. Podłącz jedną rurkę z trójnika do zaworu wtryskiwacza automatycznego samplera.
5. Ustawić pompę na 1,0 ml ^min-1.
6. Przed podłączeniem przewodów pompy do wlotu kolumny CF należy dostroić współczynnik segmentacji przepływu do 40%:60% (linia środkowa: linia obwodowa) w następujący sposób w kroku 2.7.
7. Dostrajanie współczynnika wlotu CF w systemie dzielonego przepływu
   1. Zmierzyć masę dwóch pustych naczyń zbiorczych za pomocą wagi analitycznej i oznaczyć jedno naczynie zbiorcze centralnym, a drugie obwodowym (jedno dla przewodu od automatycznego pobierania próbek do portu środkowego i jedno dla przewodu od trójnika do portu obwodowego).
   2. Przez 1,0 min zbierać wychodzącą fazę ruchomą z przewodu wychodzącego z wtryskiwacza (w punkcie, który będzie połączony z kolumną) do naczynia zbiorczego, którego masa została zmierzona w ppkt 2.7.1.
   3. Ponownie zważyć naczynie zbiorcze na wadze analitycznej i określić masę pobranej fazy ruchomej.
   4. Powtórzyć kroki od 2.7.2 do 2.7.3 dla eluentu wychodzącego z przewodu z trójnika, który ma być podłączony do portu peryferyjnego.
   5. Określić procent przepływu (ml ^min-1) z każdej linii przepływu zgodnie z następującymi równaniami:
      
   6. Dostosuj stosunek przepływu do 40%:60% (± 2%) (linia od wtryskiwacza do portu centralnego: linia od trójnika do portu peryferyjnego). Jeśli procent przepływu w przewodzie od wtryskiwacza do portu centralnego przekracza 40%, zwiększ spadek ciśnienia, zmniejszając wewnętrzną średnicę rurki lub zwiększając jej długość. Jeśli procent przepływu w przewodzie od wtryskiwacza do portu centralnego jest mniejszy niż 40%, zwiększ średnicę wewnętrzną rurki lub zmniejsz długość rurki.
   7. Po dostrojeniu proporcji przepływu wyłącz przepływ pompy.
   8. Podłącz przewód od wtryskiwacza do centralnego portu wlotu kolumny, a przewód od trójnika do portu obwodowego wlotu kolumny.
   9. Powoli zwiększaj natężenie przepływu do 1,0 ml ^min-1 przy 100% linii B.
   10. Wyrównać kolumnę (4,6 mm średnicy wewnętrznej x 100 mm długości), pozwalając 100% metanolowi (linia B) na przepływ przez kolumnę w temperaturze 1,0 ml ^min-1 przez 10 minut. Czas ten jest skalowany zgodnie z wymiarami innych kolumn, z których użytkownik może skorzystać.
   11. Aby uzyskać informacje na temat strojenia wylotu CF, przejdź do kroku 4. 'Strojenie przepływu wylotu CF'
   .

3. Konfiguracja systemu podwójnej pompy

1. Podłączyć pompę systemu HPLC do wtryskiwacza, a następnie podłączyć przewód od wtryskiwacza do centralnego portu wlotowego kolumny.
2. Podłącz dodatkową pompę bezpośrednio do wlotowego portu peryferyjnego kolumny. Zauważ, że ta druga pompa omija wtryskiwacz.
3. Zwiększ natężenie przepływu pompy systemowej podłączonej do portu centralnego do 0,4 ml ^min-1 (reprezentatywne dla 40% całkowitego natężenia przepływu 1,0 ml ^min-1) przy 100% metanolu (linia B).
4. W tym samym czasie, co w kroku 3.3, zwiększ natężenie przepływu pompy obwodowej do 0,6 ml ^min-1 (reprezentatywne dla 60% całkowitego natężenia przepływu 1,0 ml ^min-1) przy 100% metanolu (linia B).
5. Zrównoważyć kolumnę (4,6 mm średnicy wewnętrznej x 100 mm długości), pozwalając 100 % metanolowi (linia B) przepływać przez kolumnę w temperaturze 1,0 ml ^min-1 przez 10 minut. Czas ten jest skalowany zgodnie z wymiarami innych kolumn, z których użytkownik może skorzystać.
6. Aby uzyskać informacje na temat strojenia wylotu CF, przejdź do kroku 4. 'Strojenie przepływu wylotu CF'
.

4. Strojenie przepływu wylotowego CF

1. Podłącz centralny port wylotowy do detektora UV-Vis za pomocą 15-centymetrowego odcinka rurki o średnicy wewnętrznej 0.13 mm.
2. Podłącz 15-centymetrowy kawałek rurki o średnicy wewnętrznej 0.13 mm do peryferyjnego portu wylotowego kolumny CF.
3. Zważyć masę dwóch pustych naczyń zbiorczych na wadze analitycznej i oznaczyć jedno naczynie centralnie, a drugie jako obrzeżne.
4. Przez 1,0 min zbierać wychodzącą fazę ruchomą z detektora UV-Vis (przepływ centralny) do naczynia zbiorczego do etykiety naczynia zbiorczego, którego masę zmierzono w ppkt 4.2.
5. Ponownie zważyć naczynie zbiorcze zawierające zebrany eluent na wadze analitycznej i określić masę pobranej fazy ruchomej.
6. Powtórz kroki od 4.4 do 4.5 dla eluentu wychodzącego z przewodu z peryferyjnego portu wylotowego.
7. Określ procentowy udział przepływu z każdej linii przepływu zgodnie z następującymi równaniami:
   
8. Dostosuj współczynnik przepływu do 21%:79% (± 2%) (centralny przepływ wylotowy z UV-Vis: peryferyjny wylot wylotowy z linii). Jeśli procentowy przepływ centralny z detektora UV-Vis wynosi powyżej 21%, należy zwiększyć spadek ciśnienia, zmniejszając wewnętrzną średnicę rurki podłączonej do wyjścia detektora UV-Vis lub zwiększając jej długość. Jeśli procentowy przepływ centralny z detektora UV-Vis jest mniejszy niż 21%, należy zwiększyć średnicę wewnętrzną rurki podłączonej do wyjścia detektora UV-Vis lub zmniejszyć długość rurki. Za każdym razem, gdy długość rurki została zmieniona, powtórz kroki od 4.3 do 4.7.
   Uwaga: Kolumna CF w trybie "wirtualnej" średnicy wewnętrznej 2,1 mm jest gotowa do analizy.

Wyniki

Kolumny AFT zostały opracowane przy użyciu specjalistycznej konstrukcji fryty (Rysunek 1) w łącznikach końcówek kolumn wieloportowych, aby przezwyciężyć niejednorodność łoża kolumny i poprawić wydajność separacji. Międzylaboratoryjne badanie wydajności rozdzielania kolumn chromatograficznych CF (rysunek 2) przeprowadzono przy użyciu systemu podwójnej pompy (rysunek 3B), jak opisano w sekcji 3 niniejszego protokołu²³. Trzyskładn...

Dyskusja

Badanie obejmowało międzylaboratoryjną analizę kolumn chromatograficznych CF w celu sprawdzenia wydajności analitycznej pod względem wydajności i czułości. Kolumna CF została wyposażona w podwójny system pompowania, jak opisano w rozdziale "3". Układ podwójnej pompy w celu osiągnięcia stosunku przepływu 40:60 (środek:obrzeże) na wlocie kolumny CF. Stosunek przepływu 40:60 (środek:obrzeże) został osiągnięty poprzez ustawienie natężenia przepływu każdej pompy na wartość, która odpowiada odpowiednio 40% i 60% całkowitego na...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przyrząd
Dodatkowa pompa			Wymagana, jeśli ma być używany system CF z 2 pompami.
Kolumna HPLC Curtain Flow	Thermo Fisher Scientific	Niezdefiniowana	Wkrótce zostanie skomercjalizowany
Metanol	Dowolna marka		Rurki HPLC Grade
PEEK	Dowolna marka		Różne długości i średnica wewnętrzna
Obcinak do rur PEEK	Dowolna marka
Waga analityczna	Dowolna marka
Stoper	Dowolna marka
Naczynia do zbierania eluentów	Dowolna marka		Fiolki na próbki 1-2 ml mogą być używane jako naczynia do zbierania eluentu
Trójnik	Dowolna marka