Artykuł metodologiczny

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

DOI:

10.3791/53474

⸱

2 lutego 2016

1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie programów genetycznych leżących u podstaw rozwoju neuronów jest ważnym celem biologii rozwoju i komórek macierzystych. W blastuli komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne. Komórki te można izolować i programować do generowania różnych tkanek poprzez manipulowanie ekspresją genów lub indukcję przez morfogeny. W manuskrypcie opisano protokoły stosowania eksplantatów dachowych Xenopus laevis blastocoel jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego. Protokoły te umożliwiają badanie nabywania losu, zachowań migracyjnych komórek oraz właściwości autonomicznych i nieautonomicznych komórek. Eksplantaty dachu blastocoelu mogą być hodowane w pożywce wolnej od surowicy i szczepione do zarodków gospodarza. To przeszczepienie do zarodka pozwala na zbadanie długoterminowego zaangażowania w linię rodową, właściwości indukcyjnych i zachowania przeszczepionych komórek in vivo. Testy te można wykorzystać do zbadania mechanizmów molekularnych, procesów komórkowych i sieci regulacyjnych genów leżących u podstaw rozwoju neuronów. W kontekście medycyny regeneracyjnej testy te zapewniają środki do generowania typów komórek pochodzenia neuronalnego in vitro, które można wykorzystać w badaniach przesiewowych leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ nerwowy kręgowców wyłania się z płytki nerwowej jako jednorodna warstwa komórek neuroepitelialnych. Zrozumienie, w jaki sposób programy rozwojowe są indukowane, kodowane i ustanawiane podczas regionalizacji płytki neuronalnej, jest obecnie głównym celem biologii rozwojowej. W porównaniu z innymi systemami, eksperymentalnie podatny zarodek Xenopus jest modelem z wyboru do analizy wczesnych etapów rozwoju neuronalnego1,2. Łatwo jest uzyskać dużą liczbę zarodków, a rozwój zewnętrzny daje dostęp do pierwszych etapów neurulacji3. Dostępnych jest wiele narzędzi do eksperymentalnego manipulowania rozwojem embrionalnym Xenopuslaevis (X. laevis). Mikroiniekcja mRNA lub morfoliny (MO), w tym indukowalnych MO, wraz z narzędziami biochemicznymi i farmakologicznymi, umożliwia kontrolowane wzmocnienie funkcji (GOF) i utratę funkcji (LOF) oraz specyficzną zmianę szlaków sygnałowych4,5. Ektoderma dachowa blastocoel, znajdująca się wokół zwierzęcego bieguna blastuli lub bardzo wczesnego zarodka gastruli, określana jako "Animal Cap" (AC), jest źródłem komórek pluripotencjalnych, które można zaprogramować poprzez manipulację ekspresją genów przed przygotowaniem eksplantatów. W tym manuskrypcie znajdują się szczegółowe protokoły stosowania eksplantatów X. laevis AC do testowania mechanizmów molekularnych in vitro i in vivo oraz procesów komórkowych leżących u podstaw rozwoju neuronalnego.

Przedstawiono technikę, pozwalającą na dokładną obserwację wzorców ekspresji genów w cewie neuronowej kijanki Xenopus, co jest wstępnym krokiem w identyfikacji wskazówek dotyczących determinacji losu. Podczas gdy obserwacja płasko zamontowanych tkanek jest powszechnie stosowana w badaniach nad zarodkami piskląt6, nie została ona właściwie opisana w projekcie Xenopus. Manipulowanie ekspresją genów poprzez wstrzykiwanie syntetycznego mRNA lub MO do blastomerów zarodków w stadium 2 lub 4 komórek umożliwia programowanie eksplantatów AC4. Na przykład hamowanie szlaku białka morfogenetycznego kości (BMP) przez ekspresję czynnika anty-BMP Noggin, nadaje tożsamość neuronalną komórkom AC3. Protokół jest szczegółowo opisany w przypadku przeprowadzania lokalnej i kontrolowanej czasowo ekspozycji eksplantatów prądu przemiennego na sygnały zewnętrzne poprzez bezpośredni kontakt ze kulką żywicy anionowymiennej. Na koniec opisano technikę testowania cech rozwojowych neuronalnych komórek progenitorowych in vivo poprzez przeszczepienie mieszanych eksplantatów przygotowanych z odrębnych zaprogramowanych komórek, zdysocjowanych i ponownie powiązanych.

Zarodek żaby to potężny model do badania wczesnego rozwoju neuronalnego kręgowców. Połączenie manipulacji ekspresją genów z eksplantatami in vitro dostarcza ważnych informacji w badaniu regionalizacji, proliferacji i morfogenezy nabłonka nerwowego7-12. Programowanie eksplantatów prądu przemiennego pozwoliło na opracowanie funkcjonalnego serca ex vivo13,14. Zastosowanie szczepienia eksplantatów15 doprowadziło do zidentyfikowania minimalnego przełącznika transkrypcyjnego indukującego program różnicowania grzebienia nerwowego16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) jest centrum sygnalizacyjnym, które wydziela sonicznego jeża (Shh) w celu kontrolowania wzrostu i regionalizacji ogonowego przodomózgowia. Przy ciągłym narażeniu na Shh, komórki neuronabłonkowe koeksprymujące trzy geny czynnika transkrypcyjnego - homeobox-2 podobny do barH (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) i iroquois-3 (irx3) - uzyskują dwie cechy przedziału ZLI: zdolność do ekspresji shh i zdolność do segregacji od komórek przedniej płytki nerwowej. Jako układ modelowy przedstawiona zostanie indukcja losu ZLI do komórek neuroepitelialnych8.

Te protokoły mają na celu dostarczenie prostych, tanich i efektywnych narzędzi dla biologów rozwojowych i innych badaczy do zbadania podstawowych mechanizmów kluczowych zachowań komórek nerwowych. Protokoły te są bardzo wszechstronne i umożliwiają badanie szerokiego zakresu zewnętrznych i wewnętrznych wskazówek dotyczących determinacji neuronalnej. Pozwala to na długoterminową analizę in vivo zaangażowania linii neuronalnej, interakcji indukcyjnych i zachowań komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty są zgodne z krajowymi i europejskimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych oraz z międzynarodowymi zasadami zastępowania, zmniejszania i udoskonalania.

1. Płaski montaż kijanek Xenopus laevis przedniej cewy nerwowej po całkowitej hybrydyzacji in situ

  1. Pozyskać zarodki X. laevis zgodnie ze standardowymi procedurami4 i postarzyć je do momentu osiągnięcia stadium neuruli 26 i starszych (zgodnie z tabelą rozwojową Nieuwkoopa i Fabera17.
  2. Napraw kijanki X. laevis, inkubując je w roztworze 4% paraformaldehydu (PFA). Rozdrabniaj i obracaj zarodki w szklanej fiolce o pojemności 2 ml, 1 do 1,5 godziny w RT dla zarodków w stadium od 26 do 38, 2 godziny w RT dla zarodków w późniejszych stadiach.
    UWAGA: PFA jest toksyczny przez kontakt i podejrzewa się działanie rakotwórcze. Powinien być manipulowany pod maską.
    UWAGA: Jeden czerw X. laevis jest zwykle umieszczany w szklanej fiolce o pojemności 2 ml, ale można użyć większej szklanej fiolki.
  3. Umyj zarodki w tej samej fiolce za pomocą 1x PBS z 0,1% Tween (PBT), 3 min w RT, dwa razy.
    UWAGA: O ile nie określono inaczej, stosowany PBS jest z wapniem i magnezem lub bez nich.
  4. Odwodnić zarodki w 100% metanolu (MeOH) przez co najmniej 12 godzin w temperaturze pokojowej w tej samej fiolce. Wymień MeOH 100% co najmniej dwa razy pod maską za pomocą plastikowej mikropipety.
    UWAGA: MeOH zmienia kolor na lekko żółty, gdy rozpuszczą się w nim lipidy. Uwaga: MeOH jest toksyczny przez drogi oddechowe i należy nim manipulować pod maską.
  5. Ponownie nawodnić zarodki za pomocą tej samej fiolki przez stopniowaną serię kąpieli MeOH: MeOH 75% w PBS, MeOH 50% w PBS, MeOH 25% w PBS, PBS dwukrotnie, każda kąpiel 5-10 minut w RT. Roztwory MeOH są zmieniane pod pokrywą za pomocą plastikowej mikropipety.
  6. Za pomocą plastikowej pipety przenieś zarodek do wypreparowania na 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną do góry PBT. Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków ostrożnie usuń oczy, wkładając jeden cienki kleszcz między oczy a cewę nerwową, na poziomie łodygi wzrokowej. Odłącz oczy od cewy nerwowej. Ostrożnie wprowadź kleszcze poniżej ektodermy pokrywającej cewę nerwową. Ostrożnie oderwij ektodermę, zaczynając od tyłu głowy i wyrzuć ją.
  7. Wykonać podwójne lub pojedyncze ISH za pomocą sond znakowanych digoksygeniną lub fluoresceiną, jak opisano wcześniej18,19.
  8. Po transferze ISH zarodki umieszczono na nowej szalce Petriego o średnicy 60 mm, wypełnionej do góry PBT za pomocą plastikowej pipety.
  9. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie odłącz cewę nerwową od reszty zarodka. Na tym etapie przednia cewa nerwowa oddziela się od tylnej cewy nerwowej. Ostrożnie odłącz pozostałe części ektodermy leżące nad cewą nerwową, strunę grzbietową, która jest luźno przymocowana poniżej cewy nerwowej, pęcherzyki uszne i pozostałe części mezodermy. Upewnij się, że na tym etapie cewa nerwowa jest pozbawiona jakichkolwiek wyrostków robaczkowych.
    UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia cewy nerwowej, wszystkie transfery cewy nerwowej/zarodka należy wykonać za pomocą plastikowej pipety transferowej lub, jeśli to konieczne, mikropipety z naciętą końcówką na jej końcu. Średnica końcówki jest dostosowana do wielkości cewy nerwowej.
  10. Przenieść wypreparowaną rurkę nerwową (patrz uwaga krok 1.9) do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 50% glicerolem rozcieńczonym w PBS. Poczekaj, aż cewy nerwowe opadną na dno roztworu glicerolu, zwykle O/N w temperaturze 4 °C.
  11. Usunąć roztwór 50% glicerolu/PBS za pomocą mikropipety P1000 i dodać do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml roztwór 90% glicerolu/PBS za pomocą mikropipety P1000. Poczekaj, aż cewy nerwowe opadną na dno 90% roztworu glicerolu/PBS, zwykle O/N w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: do długotrwałego przechowywania należy stosować 90% glicerol/PBS oraz antybiotyki, aby zapobiec rozwojowi bakterii.
  12. Przenieś rurki nerwowe na szklaną płytkę lub szkiełko mikroskopowe za pomocą plastikowej pipety transferowej.
  13. Wypreparuj cewy nerwowe wzdłuż grzbietowej i brzusznej linii środkowej za pomocą igieł wolframowych. Podczas tego etapu cewy nerwowe są utrzymywane w 90% glicerolu/PBS.
  14. Zamontuj dwie strony cewy nerwowej w 90% glicerolu/PBS za pomocą pierścieni wzmacniających pokrytych szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
  15. Szkiełka nakrywkowe utrwalić lakierem i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Indukcja eksplantatów czapek zwierzęcych za pomocą kulek żywicy anionowymiennej

  1. Przenieść 100 μl kulek żywicy anionowymiennej do probówki o pojemności 2 ml za pomocą mikropipety P1000. Umyj koraliki co najmniej pięć razy z rzędu sterylną wodą destylowaną. Pozwól, aby kulki osiadły na dnie probówki i zastąp sterylną wodę destylowaną za pomocą mikropipety P1000. Nie dotykaj koralików.
  2. Pozwól kulkom namoczyć O/N w probówce o pojemności 2 ml wypełnionej sterylną wodą destylowaną z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (10 mg / ml) w temperaturze 4 °C.
  3. Dwie godziny przed pobraniem AC umieść połowę kulek w nowej probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety P1000. Zastąp sterylną wodę destylowaną 500 μl pożywki zawierającej cząsteczkę, która ma być badana pod kątem jej potencjału indukcyjnego lub o której wiadomo, że wywołuje określony los. Zachowaj drugą połowę koralików, ponieważ będą one używane jako kontrola negatywna.
  4. Inkubować kulki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
  5. Wykonaj wszystkie kolejne kroki pod mikroskopem stereoskopowym i wykonaj cały transfer prądu przemiennego za pomocą mikropipety.
  6. Przenieść blastulę lub bardzo wczesne zarodki gastruli do PBS z wapniem i magnezem uzupełnionymi 0,2% BSA za pomocą plastikowej pipety transferowej.
    UWAGA: Zarodki rozwijające się w temperaturze 12 °C osiągają stadium blastuli i gastruli w ciągu 20 do 24 godzin.
  7. Usuń błonę witelinową zarodka za pomocą kleszczy, jak opisano wcześniej20. Napraw zarodek jednym kleszczem. Ściśnij błonę witelinową bokiem innych kleszczy. Trzymając błonę, powoli oderwij ją od zarodka. Wykonaj tę procedurę po brzusznej (roślinnej) stronie zarodka. Nie uszkadzaj zwierzęcej strony zarodka.
  8. Odizoluj małe AC zgodnie z wcześniejszym opisem21. Biegun zwierzęcy to pigmentowana część zarodka. Za pomocą cienkich kleszczy wytnij mały kwadrat tkanki z kija zwierzęcego. Tkanka AC zawiera tylko komórki ektodermalne. Upewnij się, że tkanka ma jednolitą grubość. Jeśli nie, usuń AC z analizy.
  9. Umieść każdy AC w płytkach wielodołkowych Terasaki w 0,5x zmodyfikowanej soli Barth's Saline (MBS)4. Umieść klimatyzator w studzience pigmentowaną zwierzęcą stroną do dołu, stykając się z okrągłym dnem studzienki.
    UWAGA: powlekanie pipet 0,1% roztworem BSA zapobiega przywieraniu małych kawałków tkanki adhezyjnej do tworzywa sztucznego.
  10. Umieść jeden koralik na każdej nasadce za pomocą mikropipety P20. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby ostrożnie umieścić koralik na środku nasadki.
    UWAGA: Po namoczeniu w kondycjonowanym podłożu koraliki są zabarwione na różowo. Wybierz najbardziej kolorowe koraliki.
  11. Inkubować w temperaturze pokojowej (18–22 °C) przez 6 godzin bez przesuwania płytki wielodołkowej Terasaki. Koralik przykleja się do klimatyzacji w mniej niż 2 godziny.
  12. Umieść płytkę wielodołkową Terasaki na papierach nasączonych wodą. Przykryj talerz plastikowym pojemnikiem.
    UWAGA: Ta "komora wilgotnościowa" zapobiega przedwczesnemu parowaniu studzienek.
  13. Hodować AC w 0,5x MBS lub 3/4 NAM (patrz krok 4.1) w komorze wilgotnościowej w temperaturze 15-20 °C, aż zarodki rodzeństwa osiągną właściwy etap, aby przetestować działanie twojego czynnika.
  14. Napraw klimatyzatory na 1 godzinę w świeżo przygotowanym 4% PFA. Odwodnić AC w 100% MeOH, jak opisano wcześniej (krok 1.4).

3. Dysocjacja i reagregacja komórek czapeczki zwierzęcej przed szczepieniem w Xenopuslaevis neurula

  1. Pokryj szalki Petriego (60 mm) lub 12-dołkowe płytki 3% agarozy w sterylnej wodzie lub w PBS bez wapnia i magnezu. Dodaj tyle agarozy, aby przykryć dno szalki Petriego lub studzienki. Podgrzej talerze w temperaturze pokojowej (18-22 °C). Opcjonalnie przechowuj płytki przez kilka dni w temperaturze 4 °C, aby zapobiec odwodnieniu.
  2. Przygotować sól fizjologiczną Holtfretera bez wapnia (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) i sól fizjologiczną Holtfretera (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6)5. UWAGA: roztworu CaCl2 nie można sterylizować w autoklawie.
  3. Napełnij dobrze pokrytą agarozą do góry solą fizjologiczną Holtfretera bez wapnia.
  4. Przygotuj zarodki blastuli lub bardzo wczesnej gastruli w celu wyizolowania ich AC, jak opisano wcześniej (kroki od 2.5 do 2.7).
  5. Odizoluj co najmniej 15 lub do 30, małe AC21. Za pomocą cienkich kleszczy wytnij mały kwadrat tkanki z kija zwierzęcego. Tkanka AC zawiera tylko komórki ektodermalne i dlatego ma jednolitą grubość. Jeśli nie, usuń AC z analizy.
    UWAGA: Biegun zwierzęcy to pigmentowana część zarodka.
  6. Przenieś klimatyzatory do pokrytej agarozą studzienki wypełnionej do góry solą fizjologiczną Holtfretera bez wapnia. Umieść klimatyzatory pigmentowaną stroną skierowaną do góry.
    UWAGA: Proces dysocjacji rozpoczyna się szybko w bezwapniowym roztworze soli fizjologicznej Holtfretera.
  7. Poczekaj kilka minut, aż komórki zaczną się dysocjować. Obserwuj to poprzez dezagregację tkanek. Za pomocą cienkich kleszczyków oddziel pigmentowaną warstwę od reszty AC i wyrzuć je za pomocą mikropipety P20. Całkowity proces dysocjacji komórek wskazuje na oddzielenie komórek od siebie.
    UWAGA: W ponownie zagregowanym eksplantacie można pozostawić jedną lub dwie warstwy pigmentu, aby ułatwić wizualizację podczas szczepienia.
  8. Wyśrodkuj komórki za pomocą okrężnych ruchów płytki. Za pomocą mikropipety P1000 ostrożnie usuń jak najwięcej podłoża. Uważaj, aby nie dotknąć komórek.
  9. Dodać 1 ml soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem do studzienki. Przenieść zdysocjowane ACs do probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Nie można używać probówek o pojemności 2 ml ze względu na ich okrągłe dno.
  10. Granulować komórki przez odwirowanie, 5 minut przy maksymalnej prędkości 2 000 obr./min dla wirówki stołowej (500 x g). Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety P1000.
  11. Do zdysocjowanych komórek dodać 20 μl soli fizjologicznej Holtfretera z wapniem (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)5.
  12. Utrzymuj zdysocjowane klimatyzatory przez 3 do 6 godzin w temperaturze MT (18-22 °C).
    UWAGA: Jest to niezbędny czas na ponowną agregację komórek. Ponowna agregacja jest widoczna, gdy komórki tworzą małą kulkę na dnie probówki.
  13. Ostrożnie odłączyć eksplant od dna probówki, dodając 1 ml 0,5 MBS lub 1 ml 3/4 NAM (patrz krok 4.1). Przenieś eksplant na niepowlekaną płytkę za pomocą plastikowej pipety transferowej.
  14. Ułóż eksplantaty za pomocą ich kontrolnego rodzeństwa. Do długotrwałej hodowli należy stosować antybiotyki: kanamycynę (50 μg/ml), ampicylinę (50 μg/ml) i gentamycynę (50 μg/ml).

4. Szczepienie eksplantatów czapek zwierzęcych w płytce nerwowej zarodka X. laevis

  1. Przygotować 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 0,2x PBS, 50 μg/ml gentamycyny). Nie przechowywać dłużej niż 1 tydzień w celu rozbioru i przechowywać w temperaturze 4 °C. Starsze NAM mogą być używane do przygotowania naczyń do sekcji pokrytych agarozą (poniżej).
  2. Posmaruj szalki Petriego (60 mm) 3% agarozą w 3/4 NAM, w których wykonano małe otwory za pomocą silikonowej formy lub pokrowca rakiety do tenisa stołowego.
    UWAGA: Agaroza pokrywa dno szalki Petriego. Zostaw trochę miejsca, aby szalka Petriego wypełniła się 3/4 NAM. Alternatywnie wykonaj naczynia preparacyjne z niewysychającej plasteliny. W glinie lekko ściśnij zarodki podczas procedury preparacji. Wykop małe otwory w agarozie za pomocą zaokrąglonych kleszczy To "naczynie preparacyjne" pomaga utrzymać zarodki podczas procedury preparacji.
  3. Zbierz narzędzia do preparacji: plastikowe pipety transferowe, "nóż do brwi" (wykonany z włosków brwi zatopionych w parafinie na końcu szklanej pipety Pasteura)22, dwa cienkie kleszcze preparacyjne, mikropipetę i końcówki P1000, mikroskop stereoskopowy o powiększeniu 8-40X, jasne źródło światła z światłowodami. Utrzymuj wszystkie narzędzia preparacyjne w czystości; Po każdym eksperymencie spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną, raz 100% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Przechowywać z dala od kurzu i, jeśli to konieczne, autoklawować metalowe narzędzia preparacyjne.
  4. Pozwól zdysocjowanym i ponownie zagregowanym AC (protokół 3) i ich rodzeństwu zarodkom X. laevis rozwijać się, aż osiągną stadium 13 (neurula) zgodnie z tabelą rozwojową Nieuwkoopa i Fabera17. Do przeszczepienia w obrębie płytki nerwowej od stadium 13 do stadium 15 wykorzystuje się zarodki.
  5. Wykonaj wszystkie kolejne kroki pod mikroskopem stereoskopowym.
  6. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś zarodki do PBS z wapniem i magnezem uzupełnionymi 0,2% BSA. Usuń błonę witelinową zarodka zgodnie z wcześniejszym opisem20. Napraw zarodek jednym kleszczem. Ściśnij błonę witelinową bokiem innych kleszczy. Trzymając mocno błonę, powoli oderwij ją od zarodka.
    UWAGA: Wykonaj tę procedurę po brzusznej (roślinnej) stronie zarodka. Nie należy uszkadzać płytki nerwowej zarodków. Jeśli zarodki zostały uszkodzone na etapie usuwania błony witelinowej, przenieś zarodki na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 3/4 NAM za pomocą plastikowej pipety transferowej i odczekaj 15 minut, co jest wystarczającym czasem do zajścia procesu gojenia.
  7. Napełnij naczynie rozwarstwiające do góry świeżym 3/4 NAM.
  8. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś zarodki bez błony witelinowej do naczynia sekcyjnego. Umieść zarodki grzbietową stroną do góry w studzienkach. Podczas procesu transferu nie należy dopuścić do tego, aby zarodek wszedł w kontakt z powierzchnią powietrzno-cieczową, ponieważ X. laevis ulega lizie pod wpływem napięcia powierzchniowego.
  9. Przenieś eksplant AC do szczepienia na płytkę separacyjną za pomocą plastikowej pipety transferowej lub mikropipety P1000. Gdy pipeta znajdzie się w płynie, pozwól eksplantatom powoli opadać pod wpływem grawitacji lub bardzo delikatnie popchnij.
  10. Utrzymuj zarodki za pomocą zaokrąglonych kleszczy. Za pomocą noża do brwi wykonaj nacięcie w płytce nerwowej, w której zamierzasz przeszczepić kawałek eksplantu.
    UWAGA: Na etapie 14 przednie zgięcie płytki nerwowej może być wykorzystane jako punkt orientacyjny, oznacza terytorium międzymózgowia (ryc. 4).
  11. Wytnij mały kawałek nabłonka nerwowego za pomocą zaokrąglonych kleszczy i noża do brwi. Wytnij mały kawałek eksplantatu nożem do brwi.
    UWAGA: Kawałek eksplantatu powinien mieć mniej więcej ten sam rozmiar i kształt, co obszar ablacji nabłonka nerwowego.
  12. Umieść kawałek eksplantatu w nacięciu nabłonka nerwowego za pomocą noża do brwi i cienkich kleszczy. Upewnij się, że eksplant szybko przyczepia się do zarodka.
  13. Alternatywnie umieść kawałek szklanego szkiełka nakrywkowego na przeszczepionym zarodku, aby utrzymać przeszczep na miejscu. Aby to zrobić, pokrój cienkie szklane szkiełko nakrywkowe na bardzo małe kawałki za pomocą grubych kleszczy. Upewnij się, że rozmiar wynosi około 1.5 mm2. Zanurz kawałki na szalce Petriego zawierającej 3/4 NAM lub PBS za pomocą kleszczy. Wybierz kawałek szkła większy niż zarodek, aby go nie uszkodzić. Zarodek będzie nieco spłaszczony.
  14. Odczekaj co najmniej 30 minut bez ruchu lub tylko delikatnie przesuwaj płytkę preparacyjną. Pozwól zarodkowi dojść do siebie przez 30 minut do 2 godzin i delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe, jeśli to konieczne. Ostrożnie odpipetować przeszczepione zarodki do czystego naczynia wypełnionego 3/4 NAM, używając plastikowej pipety transferowej.
    UWAGA: Przeszczepione zarodki mają tendencję do rozwoju zanieczyszczenia bakteryjnego lub grzybiczego. Do długotrwałej hodowli należy stosować antybiotyki: kanamycynę (50 μg/ml), ampicylinę (50 μg/ml) i gentamycynę (50 μg/ml).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W oparciu o rozważania morfologiczne u różnych gatunków, manipulacje embriologiczne oraz wzorce ekspresji genów regulatorowych, przyjmuje się model koncepcyjny, według którego płytka neuralna jest podzielona na segmenty poprzeczne i podłużne, które definiują siatkę rozwojową generującą odrębne pola histogeniczne. W płytce neuralnej primordia przedmózgowia, śródmózgowia, rzbomózgowia i rdzenia kręgowego są już wszystkie ustanowione wzdłuż osi przednio-tylnej (AP) podczas gastrulacji (przeg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój neuronalny jest koordynowany przez złożoną interakcję między programami rozwoju komórkowego a sygnałami z otaczających tkanek (przegląd w3,31,32). W tym miejscu opisujemy zestaw protokołów, które można zastosować w zarodkach X. laevis w celu zbadania zewnętrznych i wewnętrznych czynników zaangażowanych w determinację losu neuronów i morfogenezę neuronów in vitro i in vivo. Protokoły te mogą być stosowane jako takie w przypadku zarodków X. tropicalis , jednak zarodki <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor dziękuje Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef i Anne Hélène Monsoro-Burq za ich pomoc i rady, a także Zakładowi Zwierząt Instytutu Curie. Autor dziękuje Paulowi Johnsonowi za jego pracę redakcyjną nad rękopisem. Prace te były wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) oraz przez granty z "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 i ARC 5115; FRC DOC20120605233 i LABEX Memolife) oraz Fundacji Pierre'a Gilles'a de Gennes (FPGG0039).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ParaformaldehydVWR&nbsp; 20909.290Toksyczne
kulki żywicy anionowymiennejBiorad140- 1231
Albumina surowicy bydlęcej SIGMAA-7888Do hodowli kapu zwierzęcegopH 7,6
Gentamycyna GIBCO15751-045 antybiotyk
Surowica bydlęca AlbuminaSIGMAA7906  do przygotowania koralików

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
  2. Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
  3. Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
  4. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  5. Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
  6. Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
  7. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
  8. Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
  9. Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
  10. Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
  11. Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
  12. Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
  13. Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
  14. Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
  15. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
  16. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  18. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
  22. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
  23. Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
  24. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  25. Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
  26. Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
  27. Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
  28. Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
  29. Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
  30. Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
  31. Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
  32. Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
  33. Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
  34. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
  35. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
  36. Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
  37. Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
  38. Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27(2013).
  39. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
  40. Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Eksplanty dachu blastokoelieksplant czepek zwierz cytest rozwoju neuronalnegoanaliza nabywania los w kom rkowychzachowanie migracyjne kom rekw a ciwo ci autonomiczne kom rkowew a ciwo ci nieautonomicznehodowla in vitroprzeszczepianie in vivo

Powiązane artykuły