Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Summary

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Abstract

Hydrożele mogą być wzorowane w mikroskali za pomocą technologii mikroprzepływowych lub mikrowzorcowych, aby zapewnić trójwymiarową (3D) geometrię tkanek podobną do in vivo. Powstałe w ten sposób konstrukty komórkowe 3D na bazie hydrożelu zostały wprowadzone jako alternatywa dla eksperymentów na zwierzętach w zaawansowanych badaniach biologicznych, testach farmakologicznych i zastosowaniach związanych z przeszczepami narządów. Chociaż cząsteczki i włókna na bazie hydrożelu można łatwo wytworzyć, trudno jest manipulować nimi w celu rekonstrukcji tkanek. W tym filmie opisujemy metodę wytwarzania mikrowzorzystych arkuszy hydrożelu alginianowego wraz z ich montażem w celu utworzenia systemu hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym. Za pomocą mgły środka żelującego wapń można łatwo uzyskać cienkie arkusze hydrożelu o grubości w zakresie 100 - 200 μm i precyzyjnych mikrowzorach. Komórki mogą być następnie hodowane z geometrycznym prowadzeniem arkuszy hydrożelu w warunkach wolnostojących. Co więcej, arkusze hydrożelu można łatwo manipulować za pomocą mikropipety z końcówką z końcówką i można je łączyć w wielowarstwowe struktury, układając je w stosy za pomocą wzorzystej ramy z polidimetylosiloksanu (PDMS). Te modułowe arkusze hydrożelowe, które można wytwarzać w łatwym procesie, mają potencjalne zastosowania w testach leków in vitro i badaniach biologicznych, w tym badaniach funkcjonalnych mikro- i makrostruktury oraz rekonstrukcji tkanek.

Introduction

Hydrożele są szczególnie obiecującymi biomateriałami i oczekuje się, że będą ważne w podstawowej biologii, testach farmakologicznych i medycynie. ¹ Sugeruje się, że biofabrykacja konstruktów komórkowych na bazie hydrożelu ma na celu ograniczenie stosowania eksperymentów na zwierzętach,2,3 zastąpienie tkanek nadających się do przeszczepu,4 i ulepszenie testów komórkowych. ^5,6 Materiały wiskoelastyczne (hydro)elastyczne (żele) zawierające wodę pozwalają na zamknięcie dużej liczby komórek i utrzymanie ich w strukturze rusztowania w celu kontrolowania mikrośrodowiska komórkowego 3D. W połączeniu ze wskazówkami technologii mikroprzepływowych lub mikromodelowania, geometria konstrukcji hydrożelowych może być precyzyjnie kontrolowana w skali komórkowej. Do tej pory różne kształty hydrożeli, w tym cząstki,7-9 ^{włókna,10-12} i arkusze,13-15 były używane jako jednostki konstrukcyjne w oddolnych podejściach do wytwarzania architektur wielokomórkowych w skali makro.

Zarówno cząsteczki na bazie hydrożelu, jak i włókna zostały łatwo i szybko wyprodukowane do zastosowań jako środowiska komórkowe w mikroskali, z kontrolą płynności za pomocą urządzeń mikroprzepływowych. Jednakże, jako podstawowe jednostki tkanek inżynieryjnych, skomplikowane byłoby ich przegrupowanie i powiększenie ich objętości jako konstruktów w skali makro. ¹⁶ Trudniej jest uzyskać konstrukcje w skali makro niż wyprodukować moduły podstawowe o rozmiarach mikronów. Arkuszowe jednostki konstrukcji na bazie hydrożelu mogą być używane do zwiększania objętości rusztowań za pomocą prostego procesu montażu. W związku z tym ułożone w stos warstwy arkuszy hydrożelowych zapewniają nie tylko zwiększenie objętości, ale także geometryczne rozszerzenie w przestrzeni 3D.

Wcześniej opisaliśmy metodę wytwarzania mikrowzorzystych arkuszy hydrożelowych,13-15 wraz z ich składaniem w wielowarstwowe architektury komórkowe. Technika ta umożliwia złożone mikrowzorce i modułowe projektowanie konstruktów komórkowych poprzez proces układania struktur wielowarstwowych. Poprzez wytwarzanie ułożonych w stos modułowych arkuszy hydrożelowych, które są mikrowzorzyste, można zrealizować system hodowli komórkowych 3D z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym w skali makro. Ten protokół wideo opisuje prostą, ale potężną metodę wytwarzania, którą można wykorzystać do budowy modułowych arkuszy hydrożelowych, opartych na linii komórkowej ludzkiego raka wątroby (HepG2). Pokazujemy tutaj prostą manipulację tymi wzorzystymi modułowymi arkuszami hydrożelowymi i ich montaż w wielowarstwową strukturę.

Protocol

1. Przygotowanie form i hydrożeli z mikrowzorami

1. Wytwarzanie pożądanych wzorów w skali mikro za pomocą fotorezystu SU-8 na powierzchni płytki krzemowej za pomocą standardowej dwuetapowej techniki fotolitografii^15,17 do odlewania form PDMS. W pokazanym przykładzie użyto wzoru siatki przypominającego zrazik wątroby (ryc. 1).
2. Odważyć PDMS i roztwór utwardzacza w stosunku 1:5 (tj. 12,5 g PDMS i 2,5 g utwardzacza).
3. Dokładnie wymieszać 15 g roztworu, odgazować pęcherzyki w komorze próżniowej, a następnie równomiernie rozprowadzić zmieszany roztwór na mikrowzorzystej powierzchni płytki krzemowej w naczyniu do odlewania folii.
4. Umieść wafel krzemowy na płycie podgrzewanej w temperaturze 65 °C na 90 minut na płaskiej powierzchni, aby utwardzić PDMS.
5. Usuń utwardzony PDMS z naczynia odlewniczego i płytki silikonowej.
6. Wytnij krawędzie PDMS i umieść go na szalce Petriego o średnicy 100 mm stroną z mikrowzorem do góry.
7. Umyj mikrowzorzyste utwardzone PDMS na szalce Petriego, używając 70% etanolu i wody destylowanej do wstępnej sterylizacji. Następnie suszyć je całkowicie przez 10 minut w piekarniku w temperaturze 65 °C.
8. Rozpuścić i wymieszać O/N 3 g sproszkowanego niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 100 ml wody destylowanej, tworząc 3% (w/v) roztwór powlekający.
9. Umieść mikrowzorzyste formy PDMS w myjce plazmowej i czyść je przez 1 minutę (85 W, 0,73 mbar), aby uzyskać hydrofilową powierzchnię, ułatwiającą dodawanie cieczy wodnych. Następnie pokryj powierzchnię PDMS 100 ml roztworem środka powierzchniowo czynnego przez co najmniej 3 godziny (orO/N) za pomocą laboratoryjnego kołyska.
10. Umyj roztwór środka powierzchniowo czynnego z form PDMS i wysusz je całkowicie w piecu w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Następnie wysterylizuj każdą formę z mikrowzorem przez wystawienie na działanie promieniowania ultrafioletowego (UV) przez 30 minut.

2. Przygotuj zawiesinę komórkową w prekursorze hydrożelu

1. Aby przygotować prekursor hydrożelu, należy rozpuścić 0,1 g proszku alginianu sodu w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), tworząc 1% (w/v) prekursor alginianu. Aby całkowicie rozpuścić proszek, inkubować i mieszać je O/N.
2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm podłączony do strzykawki o pojemności 1 ml.
3. Hodowla komórek HepG2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną na konwencjonalnej szalce do hodowli tkankowej do zbiegu 70% - 80% w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
4. Umyć komórki raz za pomocą PBS, a następnie trypsynizować je, dodając 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 4 minuty w inkubatorze z wilgotnością 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Odwirować komórki zebrane z szalki hodowlanej przy 250 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić przy użyciu 1 ml PBS po usunięciu supernatantu.
5. Policz liczbę pojedynczych rozproszonych komórek w PBS przy użyciu automatycznego licznika komórek.
6. Po odwirowaniu przy 250 x g przez 3 minuty i usunięciu PBS, dodać 1 ml 1% (m/v) roztworu alginianu sodu do pozostałych osadów komórkowych i delikatnie wymieszać za pomocą pipetowania. Ostateczna gęstość wysiewu komórek powinna wynosić 5 x 10⁶ - 10⁷ komórek/ml. Zawiesinę komórkowo-hydrożelową inkubować w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.

3. Ładowanie i sieciowanie zawiesiny komórkowej/hydrożelowej

1. Rozpuścić 1,47 g odwodnionego chlorku wapnia w 100 ml ddH₂O, aby otrzymać odczynnik sieciujący (tj. 100 mM CaCl₂·2H₂O w ddH₂O).
2. Wypłucz wnętrze nawilżacza za pomocą przetwornika ultradźwiękowego przy użyciu 70% etanolu i napełnij je 200 ml odczynnika sieciującego. Nawilżacz ma 110 mm szerokości, 300 mm długości i 170 mm głębokości (tj. 110 mm x 300 mm x 170 mm (szer. x wys. x gł.)).
3. Umieść mikrowzorzyste formy PDMS w myjce plazmowej i czyść je przez 1 minutę z mocą 85 W, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię.
4. Równomiernie załaduj 7,2 μl dobrze wymieszanej zawiesiny komórek/hydrożelu na krawędzi mikrowzoru w formie. W pokazanym przykładzie użyto wzoru siatki przypominającego zrazik wątroby (ryc. 1). Objętość zawieszenia zależy od wzoru topograficznego.
5. Aby uzyskać żelowanie zawiesiny komórkowej/hydrożelowej, włącz nawilżacz i sprawdź, czy nawilżacz wytwarza mgłę odczynnika sieciującego. Rozpyl odczynnik sieciujący na prekursor hydrożelu przez 5 minut, pokrywając powierzchnię topograficzną form PDMS w zakresie 5 cm.
   Uwaga: Odległości dłuższe i krótsze niż 5 cm mogą powodować odpowiednio niepełne i nierównomierne żelowanie. Upewnij się, że nawilżacz ma szybkość rozpylania 250 ml/h, wytwarzając 20 ml mgły odczynnika sieciującego w ciągu 5 minut.
6. Po procesie sieciowania wyłącz nawilżacz i napełnij formy PDMS PBS.

4. Obsługa pojedynczych modułowych arkuszy hydrożelowych

1. Odłącz każdy utwardzony arkusz hydrożelu od form z mikrowzorami, delikatnie pipetując PBS wokół arkusza hydrożelu za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
2. Podnieś każdy pływający arkusz hydrożelu za pomocą końcówki końcówki pipety o pojemności 1 000 μl. Każdy arkusz hydrożelu z siatki przypominającej zrazik wątroby ma wymiary 8 mm x 8,7 mm i grubość 100 - 200 μm.
3. Przenieść pojedynczą warstwę arkusza hydrożelu do 1 ml DMEM na płytce 12-dołkowej i hodować komórki in vitro w sposób pływający, używając konstruktu hydrożelowego jako składnika jednostkowego na płytce 12-dołkowej przez tydzień w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Pożywkę hodowlaną wymieniać co drugi dzień.

5. Montaż wielowarstwowych arkuszy hydrożelowych

1. Powtórz kroki od 1.1 do 1.5, aby uzyskać ramę PDMS o wymiarach 18 mm x 18 mm x 4 mm (szer. x wys. x gł.), która zawiera struktury słupków o wysokości 170 μm na dolnej powierzchni. Użyj 42 g mieszaniny PDMS i utwardzacza, w takich samych proporcjach jak w kroku 1.2. Umieść specjalistyczną formę poliwęglanową na płytce silikonowej do ramy PDMS, aby stworzyć ramę wewnętrzną o wymiarach 8 mm x 9 mm x 2 mm (szer. x wys. x gł.).
2. Wysterylizuj ramkę PDMS i nylonowe bibuły filtracyjne o porach 180 μm zanurzone w wodzie destylowanej i pęsetę w autoklawie na 15 minut w temperaturze 121 °C.
3. Umieść wysterylizowaną ramkę PDMS na ćwiartce kawałka nylonowej bibuły filtracyjnej (o średnicy 5 cm) na szalce Petriego o średnicy 60 mm.
4. Przenieś modułowy arkusz hydrożelu do wnętrza ramy PDMS za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Arkusze hydrożelowe używane do montażu powinny być hodowane przez co najmniej jeden dzień po ich wyprodukowaniu.
5. Dopasuj krawędź każdego modułowego arkusza hydrożelu do ramy PDMS za pomocą pustej końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
6. Powtórz kroki 5.4 i 5.5, używając modułowych arkuszy hydrożelowych, aby utworzyć stos 4-6 warstw.
7. Usuń pożywkę hodowlaną, przepuszczając ją przez struktury filarów w dolnej części ramy PDMS. Następnie dodać 2 μl roztworu alginianu (2% w/v) w rogu wielowarstwowej konstrukcji.
8. Rozpyl mgiełkę odczynnika sieciującego przez 30 sekund na konstrukcję wielowarstwową, aby połączyć krawędzie każdej warstwy z krawędziami innej. Użyć 2 ml mgły odczynnika sieciującego (przy szybkości rozpylania 250 ml/h).
9. Delikatnie opłucz wielowarstwową konstrukcję za pomocą 400 μl DMEM i zdejmij ramkę PDMS za pomocą pęsety.
10. Oderwać wielowarstwowy konstrukt od bibuły filtracyjnej, delikatnie przecierając ją podnośnikiem do komórek po dodaniu 4 ml DMEM.
11. Przenieść wielowarstwowy konstrukt na 6-dołkową płytkę zawierającą 3 ml DMEM za pomocą bibuły filtracyjnej i hodować komórki in vitro w sposób pływający, z konstruktem hydrożelowym jako wieloskalowym rusztowaniem komórkowym na płytce 6-dołkowej przez tydzień w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Pożywkę hodowlaną wymieniać co drugi dzień.

Results

Opisaliśmy wytwarzanie i manipulowanie wolnostojącymi komórkowymi arkuszami hydrożelowymi. Jak pokazano na rysunku 1, wyprodukowaliśmy mikrowzorzyste formy PDMS, a hydrożel zawierający komórki został załadowany na hydrofilową powierzchnię tych form i usieciowany za pomocą nawilżacza w celu wytworzenia aerozolowej mgły środka żelującego. Po uwolnieniu z form komórki HepG2 hodowano w wolnostojących arkuszach hydrożelu o różnych wzorach (ryc. 2). W ten sposó...

Discussion

Protokół ten zapewnia prostą metodę wytwarzania modułowych arkuszy hydrożelowych i składania ich w celu utworzenia rusztowań komórkowych 3D.

Aby w krótkim czasie skonstruować wyraźnie wzorzyste struktury alginianowe, powinniśmy zidentyfikować proces sieciowania, który może stworzyć wystarczająco sztywne struktury, aby utrzymać złożone mikrowzory z formy, a także utrzymać żywotność komórek i metabolizm. Opracowaliśmy proces sieciowania, w tym przejście zol-żel, w celu rozpylenia odczynnika siec...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Sproszkowany niejonowy środek powierzchniowo czynny
Sól sodowa kwasu alginowego, niska lepkość	Alfa Aesar	B25266
Dwuwodny chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C7902
Nawilżacz ultradźwiękowy	MediHeim	MH-2800	Zmodyfikowany sprzęt, Maksymalna szybkość rozpylania: 250 ml / godz
Filtr z siatki nylonowej hydrofilowy, 180 μ m	EMD Millipore	NY8H04700
Forma			Dostosowana forma do produkcji wzoru ramy PDMS