Kwantyfikacja zachowań ryb podczas pływania w odpowiedzi na ostre narażenie na wodną zawartość miedzi przy użyciu wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu

Podsumowanie

Mierzenie wpływu zanieczyszczeń środowiska na zachowanie ryb jest często subiektywne i trudne, szczególnie gdy mamy do czynienia z subletalnymi punktami końcowymi. Opisujemy metody, w tym technologię wideo, do ilościowego określania zachowania pływackiego jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium życia podczas i po 96-godzinnej ostrej ekspozycji na różne stężenia miedzi.

Streszczenie

Reakcje behawioralne organizmów wodnych na zanieczyszczenia środowiska mogą być prekursorami innych efektów, takich jak przetrwanie, wzrost lub rozmnażanie. Jednak odpowiedzi te mogą być subtelne, a pomiar może być trudny. Wykorzystując młodocianego jesiotra białego (Acipenser transmontanus) z ekspozycją na miedź, w artykule zilustrowano techniki stosowane do ilościowego określania reakcji behawioralnych za pomocą wspomaganego komputerowo wideo i cyfrowej analizy obrazu. W poprzednich badaniach zaobserwowano poważne upośledzenie zachowań związanych z pływaniem u jesiotra białego we wczesnym stadium życia, podczas ostrego i przewlekłego narażenia na miedź. Zachowanie jesiotra zostało szybko osłabione i do tego stopnia, że przetrwanie na polu byłoby zagrożone, ponieważ ryby zostałyby zmiecione w dół rzeki lub łatwo schwytane przez drapieżniki. Celem tego badania było zilustrowanie protokołów ilościowego określania aktywności pływackiej podczas serii ostrych ekspozycji na miedź, określenie czasu do efektu we wczesnym stadium rozwoju oraz zrozumienie znaczenia tych reakcji w odniesieniu do przeżywalności tych wrażliwych ryb we wczesnym stadium życia. Biorąc pod uwagę, że śmiertelność znajduje się w kontinuum czasowym, określenie, kiedy miedź po raz pierwszy wpływa na zdolność pływania, pomaga nam zrozumieć implikacje dla wpływu na poziomie populacji. Zastosowane techniki można łatwo dostosować do projektów eksperymentalnych z innymi organizmami i stresorami.

Wprowadzenie

Zrozumienie, jak narażenie na zanieczyszczenia może wpływać na zachowanie, jest czasami bardzo trudne i subiektywne. Zachowanie jest zwykle definiowane jako seria jawnych, obserwowalnych działań całego ciała, które działają przez ośrodkowy układ nerwowy i umożliwiają organizmowi przetrwanie, wzrost i rozmnażanie. Zmiany w zachowaniu spowodowane narażeniem na działanie substancji toksycznych są jednymi z najbardziej czułych wskaźników stresu środowiskowego, często od 10 do 100 razy bardziej wrażliwymi w porównaniu z^przeżyciem1. Większość z tych badań dotyczyła aktywności pływackiej, wentylacji i zachowań żywieniowych ryb^2,3,4. Aktywność pływacka jest najczęściej stosowanym subletalnym punktem końcowym w określaniu zmiany zachowania w odpowiedzi na zanieczyszczenie w testach toksyczności⁵. Zmienne pływania obejmują częstotliwość i czas trwania ruchu, prędkość i przebyty dystans, częstotliwość i kąt skrętów, pozycję w słupie wody oraz wzorzec pływania. Aktywność pływacka jest skuteczną miarą zachowania podczas pływania przy ocenie wrażliwości na substancję toksyczną w oparciu o kryteria zaproponowane w rozdziale 9 przez Randa 6 w książce Fundamentals of Aquatic Toxicology.

Ten artykuł przedstawia badanie toksykologiczne jako przykład tego, jak oceniono toksyczność miedzi dla jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium rozwoju w różnych stadiach wczesnego rozwoju w ekspozycjach tylko na wodę w stosunku do zachowania jesiotra podczas pływania i ilustruje metody ilościowego określania zachowania podczas pływania.

W poprzednich badaniach, niekorzystne reakcje behawioralne były widoczne już od kilku pierwszych dni ostrej i przewlekłej ekspozycji na miedź i stawały się stopniowo coraz bardziej dotkliwe wraz z czasem ekspozycji i stężeniem^7,8,9. Skala i czas wystąpienia tych reakcji behawioralnych są prawdopodobnie wystarczające, aby ograniczyć długoterminowe przeżycie, a zatem budzą niepokój, biorąc pod uwagę implikacje dla niepowodzenia rekrutacji¹⁰. W celu dokładnej interpretacji znaczenia tej wrażliwości na narażenie na metale opracowano metody i procedury ilościowego określania czasu, przebiegu i zakresu zaburzeń zachowania w odniesieniu do stężeń miedzi.

Protokoły testowe dla funkcji behawioralnych i rozwoju zostały ustalone poprzez analizę próbek wideo jesiotra w komorach ekspozycyjnych. Próbki wideo dostarczyły jakościowej oceny rozwoju i funkcji wśród zabiegów miedziowych w całym okresie ekspozycji. Zachowanie i aktywność w poszukiwaniu schronienia oceniano podczas ekspozycji na wodne stężenia miedzi w celu określenia czasu do efektu i scharakteryzowania czasowej sekwencji upośledzenia, które wpływa na poszukiwanie schronienia, letarg, koordynację pływania, równowagę i oddychanie. Ponadto wykonano nagrania wideo jesiotra, w których pobrano podpróbki z każdej repliki w celu ilościowego udokumentowania spontanicznej aktywności pływackiej. Te punkty końcowe obejmowały pomiary czasu trwania lub czasu spędzonego na poruszaniu się, prędkości pływania i przebytej odległości^5,11 przy użyciu dostępnego na rynku pakietu oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu. To oprogramowanie definiuje kontur każdego obrazu w polu widzenia i na tej podstawie definiuje środek ciężkości dla każdego obrazu. Oprogramowanie może następnie śledzić położenie każdego środka ciężkości w sekwencji klatka po klatce, aby określić ścieżki ruchu.

To badanie było zgodne ze wszystkimi obowiązującymi sekcjami przepisów Ustawy o Dobrostanie Zwierząt (9 CFR) oraz ze wszystkimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi humanitarnego traktowania organizmów testowych podczas hodowli i eksperymentów. Po zakończeniu badania wszystkie ryby zostały poddane eutanazji zgodnie z odpowiednimi wytycznymi, zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt dla U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

Protokół

1. Konfiguracja Rozcieńczalnika dla larw jesiotra narażonego na wodne stężenia miedzi

1. Ustaw ekspozycje za pomocą systemu przepływowego, takiego jak zmodyfikowany system rozcieńczalnika Mount and Brungs¹², zgodnie z wytycznymi ASTM International^13,14,15.
2. Wybierz 25 μg/L jako wysokie stężenie miedzi na podstawie poprzednich wyników testów, w których zaobserwowano efekty około 4-6 μg/L. Użyj odczynnika pentahydrat siarczanu miedzi II (czystość >98%) i wymieszaj testowy roztwór podstawowy.
   UWAGA>: Przykładowe serie stężeń dla ekspozycji to 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625 i 0 μg/L. Stosując 50% seryjne rozcieńczenia, zaczynając od 25 μg/l, ponieważ wysokie stężenie będzie ukierunkowane na zakres stężeń, które obserwuje się jako powodujące upośledzenie zachowania.
3. Przygotować badany roztwór podstawowy w kolbie pomiarowej na 48 godzin przed rozpoczęciem ekspozycji i ustawić tak, aby dostarczył do nasycenia komory mieszania rozcieńczalnika za pomocą automatycznego dozownika strzykawkowego.
4. Użyj szablonu arkusza kalkulacyjnego, aby określić masę substancji chemicznej, którą należy dodać do 1 litra wody dejonizowanej, co spowoduje stężenie miedzi 25 μg/l, gdy rozcieńczalnik komory mieszania zostanie wzbogacony o 1 ml testowego roztworu podstawowego.
   UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przykładowy szablon arkusza kalkulacyjnego do przygotowania materiału chemicznego do badań toksyczności rozcieńczalnika.
5. Odważyć 195 mg odczynnika pentahydratu siarczanu miedzi II za pomocą wagi analitycznej i przelać do kolby miarowej o pojemności 1 l i wymieszać z 1 litrem wody dejonizowanej do uzyskania stężenia podstawowego 48,65 mg/l.
6. Umieścić rurkę wlotową z automatycznego dozownika strzykawkowego w roztworze podstawowym do badania i ustawić objętość kolca na 1 ml, a następnie włączyć rozcieńczalnik, przestawiając wyłącznik zasilania i odczekać cykl przez 48 godzin, aż zrównoważy się z odpowiednim stężeniem miedzi przed zarybianiem jesiotra.
7. Podłącz 4-kierunkowy rozdzielacz przepływu¹⁶ w linii do każdego przewodu tłocznego, aby oddzielić przepływ wody do każdej z czterech powtórzonych komór ekspozycyjnych w rozcieńczającej łaźni wodnej. Grawitacja zasila wodę. Przepuszczaj wodę przez rozcieńczalnik cyklicznie, gdy włączy się zasilanie rozcieńczalnika i zostanie otwarty zawór elektromagnetyczny, umożliwiając przepływ wody do zbiorników rozcieńczania. Ustaw agregat chłodniczy na 15 °C i włącz pompę wodną, aby cyrkulować wodę w rozcieńczalnikowej łaźni wodnej.
   UWAGA: Proces ten jest regulowany przez użycie automatycznego timera.
8. Ustaw rozcieńczalnik tak, aby zmieniał się co 30 minut za pomocą automatycznego timera i dostarczał 250 ml wody testowej w każdym cyklu, co daje 12 dodatkowych objętości dziennie do każdej powtórzonej komory testowej.
9. Wybrać komory do badań ekspozycji w zależności od wielkości jesiotra, aby utrzymać akceptowalną szybkość załadunku, która wynosi <10 g mokrej masy ryby/l w dowolnej komorze w dowolnym momencie w danym momencie. Na przykład, aby przeprowadzić ekspozycję z 30 białymi jesiotrami (dph) (średnia waga w gramach 0,17 g), użyj^szklanych słoików 12 x 21,5 cm 2 z 4 cm otworem z boku. Przykryj tę stronę sitkiem ze stali nierdzewnej o oczkach 30 mikronów, aby umożliwić przepływ wody testowej. Objętość wody testowej w słoikach ekspozycyjnych wynosi 1 l.
10. Za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 50 ml należy pobrać dwie powtórzone próbki wody o pojemności 50 ml w każdym stężeniu, co daje łącznie 12 próbek, a następnie rozlać wodę testową do szklanych zlewek o pojemności 100 ml i zmierzyć rozpuszczony tlen (DO), temperaturę, przewodność, pH, zasadowość, twardość, całkowity amoniak, główne kationy, główne aniony i rozpuszczony węgiel organiczny przy użyciu standardowego sprzętu handlowego i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: próbki należy pobierać na początku i na końcu narażenia.
11. Aby pobrać podpróbki do analizy chemicznej, należy użyć plastikowej strzykawki o pojemności 25 ml, pobrać około 24 ml wody testowej z komór ekspozycyjnych za pomocą słomki do popijania dołączonej do strzykawki zamiast igły.
12. Wyjmij słomkę do strzykawki ze strzykawki i umieść polipropylenowy wkład filtracyjny z membraną polieterosulfonową o wielkości porów 0,45 μm na plastikowej strzykawce.
13. Przepchnąć 4 ml wody testowej przez filtr i wyrzucić.
14. Pozostałe 20 ml badanej wody przepuścić przez filtr do oczyszczonej kwasem butelki polietylenowej i zakwasić do 1% objętości 16 M kwasem azotowym o wysokiej czystości do przechowywania do 3 miesięcy.
    UWAGA: Próbki do analizy chemicznej należy pobrać na początku, w środku i na końcu narażenia, aby potwierdzić stężenia miedzi.
15. Przeprowadzić analizę chemiczną przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie zgodnie z metodą 6020a¹⁷ Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych
16. Po pobraniu wszystkich próbek wody i przełączeniu rozcieńczalnika na cykle, w każdej powtórzonej komorze testowej należy umieścić 10 (losowo, przypadkowo) jesiotrów. Zebrać jesiotra ze zbiornika hodowlanego, w którym są trzymane, za pomocą nieściernej siatki o małych oczkach. Umieść jesiotra w małym wiadrze z wodą hodowlaną. Do rozpoczęcia ekspozycji potrzeba łącznie 240 ryb.
17. Nie karm ryb podczas ekspozycji.
    UWAGA: Proszę zapoznać się z rysunkiem 1, aby zapoznać się z wizualną konfiguracją układu rozcieńczalnika.
18. Czytaj test codziennie przez cały czas ekspozycji i rejestruj śmiertelność ryb oraz monitoruj zachowanie podczas pływania.
    UWAGA: Inne punkty końcowe, na które należy zwrócić uwagę, to letarg, utrata równowagi, zmiany w oddychaniu, zmiany pigmentacji, pozycja ryb w słupie wody, ukrywanie aktywności i wszelkie inne nieprawidłowości, które można zidentyfikować wizualnie.
    UWAGA: Czytaj test o tej samej porze każdego dnia, aby uzyskać spójność.
19. Mierz i określaj ilościowo aktywność pływacką (czas spędzony na poruszaniu się ryb, prędkość i przebytą odległość) za pomocą dostępnego na rynku cyfrowego oprogramowania do śledzenia.

2. Obserwacje i liczba zgonów podczas ekspozycji

1. Sprawdź wzrokowo każdą komorę testową i odnotuj śmiertelność i obserwacje nieprawidłowego zachowania, korzystając z behawioralnej listy kontrolnej (Tabela 1) na arkuszach danych mniej więcej o tej samej porze dziennie podczas 96-godzinnej ekspozycji, najlepiej rano.
   UWAGA: Zachowania, które są uderzająco, nietypowo, subiektywnie, jakościowo różne od grupy kontrolnej, są uważane za nienormalne. Optymalnie, obserwator nie jest świadomy zabiegów.
   UWAGA: Utratę równowagi definiuje się jako niezdolność ryb do utrzymania pionowej pozycji w słupie wody, a bezruch definiuje się jako niezdolność ryb do poruszania się lub pływania, chyba że są szturchane. Inne nieprawidłowości, takie jak letarg, nadpobudliwość, zwiększenie lub zmniejszenie oddychania, zmiany koloru, drżenie, skurcze, wzdęcia brzucha, pozycja w słupie wody i wszelkie inne nietypowe wzorce pływania powinny być również odnotowane w karcie katalogowej.
   UWAGA: Zapoznaj się z filmem 1, aby zapoznać się z przykładami nietypowego zachowania.
2. Codziennie rejestruj i usuwaj martwe jesiotry.
3. Za pomocą ręcznego miernika tlenu rozpuszczonego (DO) z sondą zmierz rozpuszczony tlen in situ i zapisz temperaturę wody w dwóch powtórzeniach każdego stężenia narażenia i zapisz w karcie katalogowej.

3. Filmowanie aktywności pływackiej

1. Przechwytywanie próbek danych wideo za pomocą ręcznej kamery wideo zamontowanej na statywie umieszczonym bezpośrednio nad komorą testową w celu udokumentowania nieprawidłowości behawioralnych.
2. Aby określić ilościowo aktywność pływacką, wytnij kawałek rury PVC o średnicy 13 cm i wysokości 13 cm, aby użyć go jako areny testowej (Rysunek 1). Umieść rurę PVC w rozcieńczalniku w każdym odpowiednim zbiorniku ekspozycji na stężenie miedzi. Wykorzystaj obszar w rurze PVC jako arenę testową, ponieważ jest ona wystarczająco duża, aby jesiotr mógł swobodnie pływać.
3. Pod koniec 96-godzinnej ekspozycji losowo pobrać podpróbki 5 ocalałych jesiotrów z każdego stężenia miedzi w celu zmierzenia aktywności pływackiej i umieścić je na arenie testowej za pomocą siatki o małych oczkach.
   UWAGA: W wyższych stężeniach testowych, w których śmiertelność jesiotra była powszechna, wszelkie pozostałe jesiotry, które przeżyły, powinny być wykorzystane do pomiaru aktywności pływackiej, a w niektórych przypadkach mogą być mniejsze niż 5.
4. Po umieszczeniu ryb na arenie testowej należy pozwolić rybom zaaklimatyzować się przez okres 30 minut.
   UWAGA: Udana, bezbłędna analiza wideo wymaga obrazu ryby o wysokim kontraście na tle z minimalną strukturą, która może zasłaniać lub ukrywać obraz ryby. Obraz ryby musi być dobrze ostry i musi być wolny od odblasków powierzchniowych lub zniekształceń spowodowanych poruszającą się wodą, dlatego system rozcieńczalnika musi być wyłączony.
5. Po 30 minutach włącz kamerę wideo i ustaw ją na REC, aby rejestrować aktywność pływacką przez okres 2 minut.
6. Poddaj rybę eutanazji po zrobieniu nagrań wideo, aby określić zachowanie.
7. Umieścić jesiotra w stężonym roztworze metanosulfonianu trikainy (MS222) w wodzie na co najmniej 10 minut, aby umożliwić zatrzymanie ruchu wiecznego.
   UWAGA: Zalecane jest stężenie co najmniej 250 mg/l, które w przypadku niektórych gatunków może być znacznie wyższe.
8. Umieść eutanazyjnego jesiotra w plastikowej torbie z zamkiem błyskawicznym i umieść w zamrażarce do wyrzucenia w późniejszym czasie. Wyłącz kamerę wideo i przenieś wszystkie pliki wideo do komputera w celu przetworzenia końcowego za pomocą cyfrowego oprogramowania śledzącego.

4. Pomiary aktywności pływackiej z odtwarzania wideo

1. Znajdź arkusz danych i pliki danych wideo dla eksperymentu, który chcesz przeanalizować. Konwertuj pliki wideo do kompatybilnego formatu, który może obsłużyć oprogramowanie do analizy cyfrowej.
2. Prześlij wszystkie pliki do przetworzenia do oprogramowania. Otwórz oprogramowanie śledzące, klikając ikonę. Kliknij "Nowy eksperyment domyślny" w opcji "Utwórz nowy eksperyment" na ekranie głównym.
3. Wprowadź nazwę eksperymentu w oknie dialogowym "Nowy eksperyment", które pojawi się na ekranie. Wybierz lokalizację pliku eksperymentu, który ma zostać zapisany. Kliknij "OK". Wybierz opcję "Ustawienia eksperymentu" w sekcji "Konfiguracja". Wybierz "Z pliku wideo" w sekcji "Źródło wideo".
4. Wybierz "1" dla "Liczba aren". Wybierz "3" dla "Liczba tematów na arenę". Wybierz "Wykrywanie punktu centralnego" w sekcji "Śledzone funkcje". Wybierz żądane jednostki.
5. Wybierz opcję "Lista próbna" w sekcji "Konfiguracja". Kliknij "Dodaj filmy" u góry ekranu. Wybierz "Porządek alfabetyczny" w opcji "Porządek sortowania" w oknie dialogowym "Dodaj filmy", które pojawi się na ekranie. Kliknij "Przeglądaj". Przejdź do folderu, w którym znajdują się pliki wideo.
6. Podświetl wszystkie pliki wideo. Kliknij "Otwórz". Kliknij "Dodaj zmienną" u góry ekranu. Wpisz "Stężenie" w polu "Etykieta". Wpisz "Stężenie miedzi w mikrogramach/l" w polu "Opis".
7. Wybierz "Numeryczny" z listy rozwijanej dla "Typ". Kliknij pole "Wstępnie zdefiniowane wartości". Wybierz opcję "Zdefiniuj indywidualne wartości" w wyświetlonym oknie dialogowym "Wstępnie zdefiniuj wartości liczbowe".
8. Wprowadź "0", "3", "6", "13", "25" i "50" w polu "Wartość predefiniowana". Kliknij "Dodaj >>" między każdym dodawaniem numerów. Odznacz opcję "Zezwalaj na inne wartości". Kliknij "OK".
9. Wybierz "Wersja próbna" z menu rozwijanego w polu "Zakres". Wprowadź odpowiednie stężenie dla każdej próby w odpowiednich polach. Kliknij "Dodaj zmienną" u góry ekranu. Wpisz "Replikuj" w polu "Etykieta". Wprowadź "Powtórz numer" w polu "Opis". Wybierz "Numeryczny" z listy rozwijanej dla "Typ".
10. Kliknij pole "Wstępnie zdefiniowane wartości". Wybierz opcję "Definiuj indywidualne wartości" w oknie dialogowym "Wstępnie zdefiniuj wartości liczbowe". Wprowadź "1", "2", "3" i "4" w polu "Wartość predefiniowana". Kliknij "Dodaj >>" między każdym dodawaniem numerów. Odznacz opcję "Zezwalaj na inne wartości". Kliknij "OK".
11. Wybierz "Wersja próbna" z menu rozwijanego w polu "Zakres". W odpowiednich polach należy wprowadzić odpowiedni numer repliki dla każdej próby. Wybierz "Ustawienia areny" w zakładce "Konfiguracja" u góry ekranu. Najpierw nazwij ustawienie "Próba 1". Kliknij opcję "Chwyć obraz tła" w oknie dialogowym "Ustawienia areny (wersja próbna 1)".
12. Kliknij "Przeglądaj" w oknie dialogowym "Chwyć obraz tła". Znajdź plik wideo dla wersji próbnej 1 i kliknij "Otwórz". Kliknij opcję "Chwyć" w oknie dialogowym "Chwyć obraz tła" po wyświetleniu wideo. Kliknij ikonę białego kółka u góry ekranu w sekcji "Ustawienia areny".
13. Manipuluj wyświetlonym okręgiem tak, aby cały obszar pływania był zamknięty w okręgu. Kreskowanie pojawia się w miejscu, w którym zdefiniowany jest obszar areny. Kliknij ikonę "Skala kalibracji" w górnej części ekranu w sekcji "Ustawienia areny". Kliknij lewym przyciskiem myszy na jednym z brzegów areny. Przytrzymaj i przeciągnij myszką na przeciwległy koniec areny. Zwolnij lewy przycisk myszy.
14. Wpisz "10.5" w polu "Odległość w świecie rzeczywistym" w wyświetlonym oknie dialogowym "Odległość kalibracji". Kliknij "OK". W razie potrzeby wyreguluj linię kalibracyjną tak, aby obejmowała całą średnicę okrągłej areny.
15. Kliknij opcję "Zatwierdź ustawienia areny" w oknie dialogowym "Ustawienia areny (wersja próbna 1)". Rozwiąż wszelkie problemy, jeśli ustawienia nie są weryfikowane. Kliknij prawym przyciskiem myszy "Ustawienia areny" w opcji "Konfiguracja" na pasku narzędzi "Eksplorator eksperymentów" po lewej stronie ekranu i wybierz "Nowy" z menu.
16. Powtarzaj kroki 4.11-4.15, aż ustawienia areny zostaną utworzone dla każdej próby. Pamiętaj, aby wybrać odpowiedni plik wideo dla każdej próby. Wybierz "Ustawienia wykrywania" w opcji "Konfiguracja" z paska narzędzi "Eksplorator eksperymentów" po lewej stronie ekranu.
17. Wybierz "Dynamiczne odejmowanie" z menu rozwijanego w sekcji "Metoda" w wyświetlonym oknie dialogowym "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1". Wybierz różne kolory wypełnienia dla każdego obiektu w sekcji "Identyfikacja obiektu" w oknie dialogowym "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1".
18. Wybierz "Wybierz wideo" i zlokalizuj wideo dla wersji próbnej 1.Kliknij "Otwórz". Wybierz "5.9941" z pola "Częstotliwość próbkowania" w sekcji "Wideo" w oknie dialogowym "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1". Kliknij "Ustawienia" dla opcji "Obraz referencyjny" w sekcji "Wykrywanie" w oknie dialogowym "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1".
19. Kliknij opcję "Rozpocznij naukę (C)" w oknie dialogowym "Obraz referencyjny". Poczekaj, aż program nauczy się obrazu referencyjnego. Gdy obraz w oknie dialogowym "Obraz referencyjny" pojawi się bez zwierząt, kliknij "Użyj dynamicznego obrazu referencyjnego" w sekcji "Ustawienia pozyskiwania" w oknie dialogowym.
20. Kliknij "Zamknij". Wybierz "Ciemniejszy" z menu rozwijanego "Temat jest" w sekcji "Wykrywanie" w oknie dialogowym "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1". Ustaw mniejszą liczbę na "33", a większą liczbę na "153" dla "Ciemny kontrast" w oknie dialogowym "Wykrywanie" "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1".
21. Kliknij "Zapisz zmiany" w prawym dolnym rogu okna dialogowego "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1". Kliknij przycisk odtwarzania w oknie dialogowym "Sterowanie odtwarzaniem" i potwierdź, że oprogramowanie pomyślnie śledzi zwierzęta, a nie cienie lub szczątki. W razie potrzeby dostosuj liczby dla opcji "Ciemny kontrast".
22. Gdy śledzenie jest odpowiednie, kliknij "Zapisz zmiany" w prawym dolnym rogu okna dialogowego "Ustawienia wykrywania: Ustawienia wykrywania 1". Wybierz "Akwizycja" w opcji "Konfiguracja" z paska narzędzi "Eksplorator eksperymentów" po lewej stronie ekranu.
23. Kliknij "Śledź następną planowaną próbę" w oknie dialogowym "Ustawienia pozyskiwania". Upewnij się, że prawidłowe ustawienia próby, filmu i areny są wyświetlane w sekcji "Ustawienia" w oknie dialogowym "Ustawienia pozyskiwania".
24. Zaznacz opcję "Wykrywanie określa prędkość" w oknie dialogowym "Kontrola pozyskiwania". Kliknij przycisk z zielonym kółkiem otoczonym białym kwadratem, aby rozpocząć proces pozyskiwania. Powtarzaj kroki 4.22-4.23, aż wszystkie próby będą śledzone.
25. Kliknij "Profile danych" w opcji "Analiza" na pasku narzędzi "Eksplorator eksperymentów" po lewej stronie ekranu. Wybierz "Czas" w opcji "Zagnieżdżanie" na pasku narzędzi "Komponenty". Dostosuj "Do" do "0:02:00" pod nagłówkiem "Wybierz przedział czasu utworu" w oknie dialogowym "Czas". Kliknij "OK".
26. Przeciągnij pole "Zagnieżdżaj" między polem "Start" a polem "Wynik 1" w obszarze "Profile danych" po prawej stronie ekranu. Kliknij "Profil analizy" w opcji "Analiza" na pasku narzędzi "Eksplorator eksperymentów" po lewej stronie ekranu. Kliknij "Prędkość" pod nagłówkiem "Odległość i czas" na wyświetlonym pasku narzędzi "Zmienne zależne".
27. Kliknij "Dodaj" w oknie dialogowym "Prędkość". Kliknij "Przebyta odległość" pod nagłówkiem "Odległość i czas" na pasku narzędzi "Zmienne zależne". Kliknij "Dodaj" w oknie dialogowym "Przebyta odległość". Kliknij "Ruch" pod nagłówkiem "Indywidualne zachowanie" na pasku narzędzi "Zmienne zależne".
28. Dostosuj "Interwał uśredniania" na "1" pod nagłówkiem "Filtr wartości odstających" w oknie dialogowym "Ruch". Dostosuj "Prędkość początkową" na "2,00" i "Prędkość zatrzymania" na "1,75" pod nagłówkiem "Próg" w oknie dialogowym "Ruch".
29. Zaznacz oba pola "W ruchu" i "Nie porusza się" pod nagłówkiem "Oblicz statystyki dla" w oknie dialogowym "Ruch". Kliknij "Dodaj" u dołu okna dialogowego "Ruch". Kliknij "Wynik analizy" w opcji "Wyniki" na pasku narzędzi "Eksplorator eksperymentów" po lewej stronie ekranu. Kliknij "Oblicz" u góry ekranu.
30. Po obliczeniu zmiennych zależnych kliknij "Eksportuj" u góry ekranu. Wybierz folder docelowy w oknie dialogowym "Eksportuj dane wyjściowe analizy". Wybierz "Excel" z menu rozwijanego "Typ pliku" w oknie dialogowym "Eksportuj dane wyjściowe analizy". Kliknij "OK".
31. Kliknij "Zapisz eksperyment" w zakładce "Plik" u góry ekranu. Zamknij cyfrowe oprogramowanie śledzące. Zaimportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i analizuj je za pomocą komercyjnego pakietu oprogramowania do analizy statystycznej.

Wyniki

Ręczne przetwarzanie wizualnych danych obserwacyjnych wykazało, że procentowe nieprawidłowości wzrosły wraz ze wzrostem stężenia miedzi już po 72 godzinach ekspozycji rozpoczętej u jesiotra po 2 dniach po wykluciu (dph) (Rysunek 2). Próbki wideo udokumentowały ekstremalny wpływ ekspozycji na miedź na zachowanie pływania jesiotra (wideo 2) i pomogły w zdefiniowaniu upośledzenia behawioralnego w rezultacie. W innym przykładzie jesiotr w temperaturze 30 dph okazał się wrażliwy na ekspozycję na miedź z medianą stężenia skutku śmiertelnego (LC50) wynoszącą 96 godzin wynoszącą 40,3 μg/l wyłącznie na podstawie śmiertelności. Jednakże, gdy subletalne behawioralne punkty końcowe utraty równowagi i unieruchomienia są uwzględniane wraz ze śmiertelnością, czułość wzrasta przy szacowanym 96-godzinnym średnim stężeniu efektu (EC50) w zakresie od 2,4 do 5,0 μg/l. Dokumentacja wideo uchwyciła te subletalne efekty i dalej potwierdziła ludzkie obserwacje nieprawidłowości behawioralnych zarejestrowanych podczas ekspozycji. Zastosowanie cyfrowego oprogramowania śledzącego znacznie skróciło czas przetwarzania końcowego podczas analizy aktywności pływackiej. Prędkość pływania ryb, czas spędzony w ruchu i przebyta odległość znacznie się zmniejszyły (ryc. 3) wraz ze wzrostem stężenia miedzi. Ścieżki pływackie również zmniejszały się wraz ze wzrostem stężenia miedzi (ryc. 4).

Rysunek 1: Zrzut ekranu komputera przedstawiający szablon arkusza kalkulacyjnego używany do określania stężenia testowego roztworu podstawowego. Przygotowanie materiału chemicznego do badań toksyczności rozcieńczalnika określono przy użyciu szablonu arkusza kalkulacyjnego opartego na stężeniu docelowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja rozcieńczalnika i projekt eksperymentalny. Na styku miedzi narażono jesiotra białego na różne etapy życia. Wielkość rozcieńczalnika użytego do ekspozycji została dobrana na podstawie wielkości ryby. (a) Jesiotry we wczesnym stadium życia były eksponowane przy użyciu małego zestawu rozcieńczalnika, a (b) starsze jesiotry w stadium życia były wystawiane przy użyciu dużego zestawu rozcieńczalnika.

Ryc. 3: Zachowanie podczas pływania wynika z 72-godzinnej ekspozycji jesiotra białego (Acipenser transmontanus) na miedź we wczesnym stadium życia (począwszy od ryby 30 dni po wykluciu [dph]). Punkty końcowe aktywności pływackiej: a) czas przemieszczania się jesiotra białego o sile 30 dph; b) prędkość pływania; oraz (c) przebyta odległość zmniejszyła się wraz ze wzrostem stężenia miedzi wśród jesiotra białego wystawionego na działanie przez 96 godzin. Gwiazdka oznacza znaczną różnicę w stosunku do kontroli, słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.

Rycina 4: Wyniki badania jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium życia w 96 godzinach ekspozycji na miedź (począwszy od ryb po wykluciu [dph]). Przetrwanie jesiotra białego przy 2 dph wykazującym utratę równowagi i unieruchomienie po 72 godzinach 96-godzinnej ekspozycji ze wzrostem stężenia miedzi. Gwiazdka oznacza znaczną różnicę w stosunku do kontroli, słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.

Rysunek 5: Przykładowa ścieżka pływania wynika z 96-godzinnej ekspozycji na miedź jesiotra białego (Acipenser transmontanus) we wczesnym stadium życia (wpatrywanie się w ryby 30 dni po wykluciu [dph]). Ścieżki pływania jesiotra zdigitalizowane za pomocą cyfrowego oprogramowania śledzącego z (a) kontrpróby kontrolnej (n = 5 ryb) i (b) z repliki poddanej wysokiej jakości (50 μg/l) (n = 3 ryby) po 96-godzinnej ekspozycji. Należy pamiętać, że liczba ścieżek pływackich nie reprezentuje liczby ryb obecnych w komorze, ponieważ niektóre ryby były nieaktywne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Parametr kwantyfikowalny Parametry obserwacyjne prędkość Letarg/nadpobudliwość Przebyta odległość Utrata równowagi Czas przebywania w strefie Skurcze/drżenia/do góry nogami Przejście strefowe - ile razy organizm przemieszcza się między wybranymi strefami Pozycja w słupie wody Kierunek do punktu — oblicza odchylenie ścieżki zwierzęcia w kierunku punktu zainteresowania Oddychanie (szybkie/wolne) Nagłówek oblicza nagłówek wybranego punktu bryły Zabarwienie Różnica kątów skrętu w kursie między dwiema próbkami Ukrywanie Prędkość kątowa - obliczana przez podzielenie kąta skrętu przez przedział próbki Meander - obliczany przez podzielenie kąta skrętu przez przebytą odległość. Służy do porównywania obracania się zwierząt poruszających się z różnymi prędkościami Czas spędzony w ruchu Stan mobilności — oblicza czas, w którym zmienia się cały obszar wykryty jako zwierzę, nawet jeśli punkt środkowy pozostaje taki sam. Obrót - jeden obrót jest zakończony, gdy wybrany punkt bryły ma skumulowany kąt skrętu 360°. Skręty w przeciwnym kierunku o wartość mniejszą niż próg są ignorowane. Mobilność ciągła — oblicza procent mobilności dla całego obszaru wykrytego zwierzęcia, nawet jeśli punkt środkowy pozostaje taki sam. Odległość między obiektami - oblicza odległość między wszystkimi aktorami a wybranymi odbiorcami Bliskość — oblicza czas, przez jaki aktor znajduje się lub nie znajduje się w pobliżu odbiorcy Ruch względny Ruch ważony netto-Ruch aktora do (dodatniego) i od (ujemnego) odbiornika, ważony odległością między nimi Ważony ruch od ruchu aktora od odbiornika, ważony odległością między nimi. Ruch ważony do- ruch aktora do odbiornika, ważony odległością między nimi Stan kontroli próbnej - okres między dwoma zdarzeniami elementów kontroli próbnej lub w obrębie jednego elementu Zdarzenie kontrolki próbnej – moment, w którym występuje zdarzenie w elemencie zdefiniowanym w elemencie kontrolnym próbnym.

Tabela 1: Behawioralne punkty końcowe określone ilościowo za pomocą cyfrowego oprogramowania śledzącego. Te punkty końcowe mogą być stosowane u osób lub grup, a także służyć jako lista do wizualnych kontroli obserwacyjnych upośledzenia zachowania podczas ekspozycji.

Wideo 1: Wizualna definicja nietypowego zachowania zaobserwowanego przez zainfekowanego jesiotra ^białego. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać) Do udokumentowania nieprawidłowości wykorzystano codzienną obserwacyjną listę kontrolną. Utrata równowagi i unieruchomienie były najczęstszymi nieprawidłowościami obserwowanymi podczas ekspozycji. Zmodyfikowano z Calfee i wsp.⁷

Wideo 2: Dokumentacja wizualna przedstawiająca przykład zachowania jesiotra białego podczas pływania. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać) Aktywność pływania jesiotra białego uległa znacznemu zmniejszeniu wraz z ekspozycją na rosnące stężenie miedzi. Jesiotr przedstawiony na tym filmie pochodzi z kontrolnego, średnio niskiego i wysokiego traktowania pod koniec 96-godzinnej ekspozycji na wodną wodę miedzi. Chociaż jesiotr biały wciąż żył, oczywiste jest, że ryby były znacznie osłabione w leczeniu w porównaniu z grupą kontrolną. Zmodyfikowano z Calfee i wsp.⁷

Dyskusja

Zmiany w zachowaniu spowodowane narażeniem na zanieczyszczenie są często wykorzystywane jako punkt końcowy dla toksyczności subletalnej, ale mogą być trudne do zmierzenia. Ogólnie rzecz biorąc, reakcje behawioralne są mierzone za pomocą obserwacji wizualnych i ręcznej analizy danych, która wymaga dużo czasu na przetworzenie. Jednak wraz z postępem technologicznym metody ilościowego określania aktywności pływackiej skupiły się na wykorzystaniu wideografii¹⁸ i analizy ruchu lub cyfrowego oprogramowania śledzącego, które skraca czas przetwarzania i analizy. Podczas analizy danych przechwyconych w formie wideo, ręczne określanie zmiennych pływania byłoby bardzo czasochłonne, dlatego wykorzystanie nagrań danych wideo i oprogramowania do śledzenia ryb zapewniło bardziej skuteczny i wydajny sposób analizy zachowania pływania jesiotra. Chociaż procedura podkreślała zachowanie ryb podczas pływania, dostosowanie do innych organizmów, takich jak i bezkręgowce wodne, wymagałoby prostych modyfikacji. W zależności od tego, jakie behawioralne punkty końcowe są rozwiązywane, można opracować eksperymentalne projekty i systemy kamer do użytku z niemal każdym dostępnym na rynku pakietem oprogramowania śledzącego.

Metodę demonstruje się przy użyciu rozpuszczonej miedzi, ale ma ona zastosowanie do innych zanieczyszczeń wodnych lub właściwości, takich jak temperatura lub zawartość tlenu. Protokoły opracowane i przedstawione w tym artykule wykorzystywały prostą cyfrową kamerę wideo jako urządzenie rejestrujące. Pliki cyfrowe można łatwo przenieść do komputera i przesłać do oprogramowania do analizy ruchu. Metody są stale modyfikowane i udoskonalane w celu usprawnienia procesu kwantyfikacji. Konieczne jest, aby jakość wideo była w wysokiej rozdzielczości, aby oprogramowanie analityczne mogło zidentyfikować każdą pojedynczą rybę do śledzenia. Każde tło, które nie kontrastuje z rybą, spowoduje problemy podczas próby przetworzenia plików danych. Innym częstym problemem związanym z dwuwymiarowym śledzeniem wideo jest identyfikacja osób, gdy ścieżki pływania się przecinają. Można to skorygować ręcznie, identyfikując każdą rybę podczas przekraczania ścieżki i łącząc odcinki ścieżki w oprogramowaniu. Alternatywnie, całkowita aktywność może być wyznaczona z każdej komory kontrprób jako średnia grupowa. W tym samym polu widzenia można sfilmować kilka oddzielnych komór, z których każda zawiera jedną rybę, aby obliczyć ruchy poszczególnych ryb.

Obecnie przeprowadziliśmy modernizację do korzystania z serii kamer monitorujących nad komorami naświetlania, które są połączone z cyfrowym urządzeniem do nagrywania wideo o wysokiej rozdzielczości (HD-DVR). Jednak użycie dowolnego systemu kamer, który może nagrywać filmy w wysokiej rozdzielczości MPEG-4, będzie działać. HD-DVR można ustawić na nagrywanie o określonej godzinie i zaprogramować na maksymalnie 7 dni. To zautomatyzowane podejście pozwala na przechwytywanie kilku filmów w tym samym czasie, aby zachować spójność, jednocześnie minimalizując zakłócenia zewnętrzne, które mogłyby zagrozić zachowaniu ryb. Rejestratory HD-DVR są podłączone do sieci wewnętrznej, dzięki czemu przesyłanie plików jest stosunkowo proste. Chociaż zautomatyzowany system kamer jest znacznie ulepszoną techniką ilościowego określania zachowań związanych z pływaniem, nadal korzystne jest prowadzenie obserwacji wizualnych, które służą jako dodatkowe informacje pomocnicze do dokumentowania upośledzenia behawioralnego podczas testów toksyczności.

Istnieje długa historia literatury dokumentującej zmienione zachowanie ryb wynikające z ekspozycji na metale, sięgająca wczesnych lat 60.^19,20,21. Wykazano, że miedź powoduje zmiany w poziomie aktywności, takie jak hipoaktywność u bluegill²² (Lepomis macrochirus rafinesque) oraz zmiany w aktywności lokomotorycznej i żerowej pstrąga potokowego²³ (Salvelinusfontinalis). Przynajmniej niektóre młode ryby polegają na swoim węchu w wykrywaniu i unikaniu drapieżników, a deprywacja chemosensoryczna wywołana miedzią może wpływać na zachowania związane z wykrywaniem alarmowych substancji chemicznych^24,25,26. Nabłonek węchowy jest uszkodzony z powodu ekspozycji na miedź, wpływając w ten sposób na mechanizmy czuciowe, co może skutkować dezorientacją, unikaniem zachowań, zmniejszonym karmieniem i wszelkimi innymi zachowaniami, które są kierowane przez węch²⁷. Te zmienione zachowania były zgodne z tym, co zaobserwowano podczas ekspozycji.

Pływanie jesiotra białego miało duży wpływ podczas subletalnej ekspozycji na wodne stężenia miedzi. Wyniki te ilustrują, w jaki sposób wpływa na zachowanie przy subletalnych stężeniach miedzi i mogą być wykorzystane jako wskaźnik stresu toksycznego. Analiza oparta na filmach okazała się skuteczna w ilościowym określaniu zachowań podczas pływania, a także posłużyła jako jakościowa dokumentacja wizualna poważnych skutków dla jesiotra narażonego na działanie miedzi. Oprogramowanie analityczne jest również w stanie określić ilościowo inne różne behawioralne punkty końcowe. Listę znajduje się w Tabeli 1 . System narażenia może być modyfikowany w celu uwzględnienia każdego punktu końcowego w trybie czasu rzeczywistego i może być używany do ilościowego określania różnic w zachowaniu związanym z narażeniem na różne niepokojące zanieczyszczenia.

Stosowanie behawioralnych punktów końcowych w wodnych badaniach toksykologicznych jest coraz częściej stosowane i powinno być brane pod uwagę przy ocenie skutków zanieczyszczeń, ponieważ adaptacyjne funkcje behawioralne mają kluczowe znaczenie w określaniu szkód środowiskowych⁹. Wpływ zanieczyszczeń środowiskowych na zachowanie ryb jest często subiektywny i trudny, szczególnie w przypadku subletalnych punktów końcowych przy braku standardowych metod.

Aktywność pływacka, określona ilościowo przy użyciu tych metod, może być rygorystycznie monitorowana, jest nieniszcząca przy minimalnym stresie dla organizmu i może być powtarzana. Zachowanie podczas pływania jest ważnym i spójnym wskaźnikiem toksyczności subletalnej, który powinien zostać włączony do protokołów badań w celu zwiększenia czułości standardowych testów toksyczności⁵.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pentahydrat siarczanu miedzi II	zanieczyszczenie	Sigma-Aldrich
dozownik strzykawkowy	Hamilton MicroLab 600 Series		do kolby chemicznej
2 l kolba			miarowa pojemnik do przechowywania roztworu
podstawowego 24-1,5 l szklane słoiki			jesiotrem 2 dph
	Sony Handycam Cyfrowe oprogramowanie śledzące HDR-CX550V
	Noldus Ethovision
3-17 "monitory
24 kamery monitorujące	Model CL101
3-16-kanałowe cyfrowe urządzenia
Miernik tlenu rozpuszczonego	YSI
pH-metr	Orion 940
sonda ph	Orion
miernik
amoniaku sonda amoniaku	agregat
pompa