Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Podsumowanie

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Protokół ten opisuje procedury przeprowadzania imunoprecipitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP) w celu identyfikacji białek i RNA związanych z określonym regionem genomu.

Streszczenie

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Aby umożliwić bezstronną identyfikację cząsteczek oddziałujących z określonym regionem genomu będącym przedmiotem zainteresowania, opracowaliśmy niedawno technikę immunoprecypitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP). W tym miejscu opisujemy, jak używać enChIP do izolowania określonych regionów genomu i identyfikowania powiązanych białek i RNA. Po pierwsze, interesujący region genomowy jest oznaczany białkiem podobnym do aktywatora transkrypcji (TAL) lub zgrupowanym regularnie rozmieszczonym kompleksem krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) składającym się z katalitycznie nieaktywnej formy Cas9 i przewodnika RNA. Następnie chromatyna jest sieciowana i fragmentowana przez sonikację. Oznaczone locus jest następnie immunoprecypitowane, a sieciowanie jest odwracane. Wreszcie, białka lub RNA, które są związane z izolowaną chromatyną, są poddawane odpowiednio analizom spektrometrii mas lub sekwencjonowania RNA. Takie podejście pozwala na udaną identyfikację białek i RNA związanych z interesującym regionem genomu.

Wprowadzenie

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów regulacji funkcji genomowych, takich jak transkrypcja i regulacja epigenetyczna. Chociaż opracowano kilka technik analizy biochemicznej określonych regionów genomu^1-7, nie są one powszechnie stosowane na tym etapie ze względu na ich wewnętrzne problemy, takie jak ograniczone zastosowanie (np. tylko w przypadku loci o dużej liczbie kopii lub loci z powtórzeniami) oraz zbyt wiele czasu i wysiłku.

Aby łatwo przeprowadzić analizę biochemiczną określonych regionów genomu, opracowaliśmy dwie technologie immunoprecypitacji chromatyny specyficznej dla locus (ChIP), a mianowicie ChIP insercyjne (iChIP)^8-13 i ChIP za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP)^14-17. W iChIP interesujące locus jest oznaczane przez wstawienie sekwencji rozpoznających egzogennego białka wiążącego DNA, takiego jak LexA. Locus jest następnie izolowany przez oczyszczanie powinowactwa przy użyciu znakowanego białka wiążącego DNA. W enChIP zmodyfikowane cząsteczki wiążące DNA, takie jak białka palca cynkowego, białka podobne do aktywatora transkrypcji (TAL) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), są używane do oznaczania miejsca zainteresowania (Figura 1). Następnie region genomu jest izolowany przez oczyszczanie powinowactwa znakowanych cząsteczek wiążących DNA.

Jedną z zalet enChIP w stosunku do iChIP jest to, że nie jest konieczne wprowadzanie sekwencji rozpoznawania egzogennego białka wiążącego DNA. Celowanie w loci za pomocą kompleksów CRISPR składających się z katalitycznie nieaktywnej formy Cas9 (dCas9) i przewodnika RNA (gRNA) jest znacznie łatwiejsze niż celowanie w te regiony za pomocą iChIP lub enChIP przy użyciu TAL i białek palca cynkowego. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół enChIP w połączeniu ze spektrometrią mas i sekwencjonowaniem RNA (RNA-Seq) w celu identyfikacji odpowiednio białek i RNA związanych z locus.

Protokół

1. Projektowanie zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA, rozpoznających locus celu

1. W przypadku enChIP wykorzystujących kompleksy CRISPR należy użyć narzędzia internetowego CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) w celu zidentyfikowania kandydujących sekwencji docelowych gRNA w regionie genomu będącym przedmiotem zainteresowania opisanym wcześniej^{jako 18}. To narzędzie internetowe zwraca 23 miejsca genomowe pz w postaci 5'-N₂₀NGG-3' w regionie docelowym.
2. Zsyntetyzować gBlock, w tym sekwencję promotora U6 i sekwencję 5'-N₂₀ w 5'-N₂₀NGG-3', korzystając z usług komercyjnych (patrz rysunek 2)^19,20. Do celów subklonowania należy dołączyć odpowiednie miejsca enzymów restrykcyjnych poza gBlockiem.
3. Wstaw gBlock do odpowiedniego wektora, jak opisano wcześniej¹⁶. Dostępnych jest kilka wektorów retrowirusowych dla gBlocks (patrz Materiały).
4. W przypadku enChIP wykorzystujących białka TAL należy zaprojektować białka TAL rozpoznające loci docelowe. Generowanie plazmidów kodujących białka TAL za pomocą usług komercyjnych. Wygeneruj wektory ekspresyjne zawierające białka TAL połączone z jednym lub więcej znacznikami, takimi jak 3×FLAG, jak opisano wcześniej¹⁵.

2. Tworzenie komórek do analizy enChIP

1. Ekspresja 3×FLAG-dCas9 i gRNA (procedura oparta na CRISPR) lub 3×FLAG-TAL (procedura oparta na białku TAL) w komórkach, które mają być analizowane, jak opisano wcześniej^14-17.
   1. Użyj transfekcji przejściowej, jeśli wydajność transfekcji jest wysoka. Dostępny jest wektor ekspresyjny zawierający 3×FLAG-dCas9 i promotor CMV (patrz Materiały).
   2. Rozważ ustalenie stabilnych transformantów przy użyciu konwencjonalnych metod, jeśli wydajność transfekcji w stanach przejściowych jest niska. Oprócz wyżej wymienionych wektorów retrowirusowych dla gBlock, dostępne są wektory retrowirusowe 3×FLAG-dCas9 (patrz Materiały).
2. Potwierdzić ekspresję białka 3xFLAG-dCas9 lub 3xFLAG-TAL w transfekowanych komórkach za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciała anty-FLAG (Ab), jak opisano wcześniej^14-17,
   Uwaga: Ekspresję tych znakowanych białek można również potwierdzić przez barwienie wewnątrzkomórkowe za pomocą anty-FLAG-FITC i późniejszą analizę FACS. Protokół barwienia wewnątrzkomórkowego można pobrać z naszej strony internetowej (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Potwierdź ekspresję gRNA za pomocą standardowej techniki RT-PCR.
4. W celu ilościowej identyfikacji białek oddziałujących z regionem genomu będącym przedmiotem zainteresowania, należy rozważyć zastosowanie znakowania stabilnych izotopów za pomocą analizy aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC) w połączeniu z enChIP (enChIP-SILAC).
   Uwaga: Nośniki do analizy SILAC można zakupić u dostawców komercyjnych. SILAC jest skuteczny w wykrywaniu określonych interakcji.
   1. Hodowla komórek w ciężkim podłożu SILAC. Przygotować komórki hodowane w pożywce świetlnej SILAC jako kontrolę ujemną. Użyj co najmniej 5 × 10⁷ komórek na każde podłoże SILAC (ciężkie lub lekkie). Aby uzyskać wydajne etykietowanie, dodaj zarówno L-Lizynę-2HCl, ¹³C₆, jak i L-Argininę-HCl ¹³C₆, ¹⁵N₄ w pożywce SILAC Heavy. Uwaga: Do znakowania białek konieczne jest co najmniej pięć podziałów komórkowych.
      1. Na przykład, hodowla ludzkich komórek włókniakomięsaka HT1080 stabilnie eksprymujących 3xFLAG-dCas9 i gRNA w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w pożywce DMEM dla SILAC i dializowanej płodowej surowicy bydlęcej z lizyną-2HCl plus L-argininą-HCl (lekkie podłoże) lub ¹³C₆ L-lizyna-2HCl plus ¹³C₆¹⁵N₄ L-arginina-HCl (ciężkie podłoże) (patrz Materiały)¹⁶. Dodać 50 mg lekkiej lub ciężkiej L-lizyny-2HCl i L-argininy-HCl w 500 ml pożywki.
      2. Trypsynizuj i ponownie płytkuj komórki, zanim zaczną się zlewać, aby komórki utrzymywały wykładniczy wzrost.

3. Sieciowanie komórek za pomocą formaldehydu

1. W przypadku komórek w hodowli zawiesinowej przenieść 2 × 10⁷ komórek wykazujących ekspresję białek 3xFLAG-TAL lub 3xFLAG-dCas9 plus gRNA i zawiesić w 30 ml zwykłej pożywki hodowlanej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Gdy używanych jest więcej komórek, proporcjonalnie zwiększaj objętości i ilości odczynników. W przypadku eksperymentów SILAC należy wymieszać komórki hodowane w ciężkim lub lekkim podłożu (5 x 10⁷ komórek każda) i podzielić łącznie 1 x 10⁸ komórek na 5 probówek zawierających 2 x 10⁷ komórek.
2. Dodać 810 μl 37% formaldehydu do 30 ml zawiesiny komórkowej (stężenie końcowe 1%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. W przypadku komórek przylegających należy bezpośrednio przymocować komórki w szalkach hodowlanych, dodając 810 μl 37% formaldehydu do 30 ml pożywki hodowlanej.
3. Przerwać sieciowanie poprzez dodanie 3,1 ml 1,25 M roztworu glicyny (końcowe stężenie 127 mM) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Zebrać komórki przez odwirowanie (300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad, w tym formaldehyd, i przechowywać go w odpowiedniej butelce na odpady.
   1. W przypadku komórek przylegających należy odłączyć komórki za pomocą skrobaka do komórek i zebrać w probówce o pojemności 50 ml, a następnie zebrać komórki zgodnie z opisem w tym kroku.
   2. W przypadku eksperymentów SILAC należy wymieszać oderwane komórki hodowane w ciężkim lub lekkim podłożu (5 x 10⁷ komórek każda), podzielić całość komórek 1 x 10⁸ na 5 probówek zawierających 2 x 10⁷ komórek i zebrać komórki zgodnie z opisem w tym kroku.
5. Przemyć osad komórkowy 30 ml PBS dwa razy na probówkę. Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad, w tym formaldehyd, i przechowywać go w odpowiedniej butelce na odpady. Z odpadami formaldehydu należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego. Utrwalone komórki można zamrażać i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Przygotowanie chromatyny (na 2 x 10⁷ komórek)

1. Zawiesić utrwalone komórki w 10 ml buforu do lizy komórek (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 i 1× inhibitory proteazy) i inkubować na lodzie przez 10 minut.
2. Odwirować próbkę (830 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut) i ostrożnie odrzucić supernatant.
3. Zawiesić osad w 10 ml buforu do lizy jądrowej (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,5% lauroilosarkozyny i 1x inhibitory proteazy). Inkubować na lodzie przez 10 minut i wirować co 2-3 minuty.
4. Odwirować próbkę (830 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut) i ostrożnie odrzucić supernatant.
5. Umyj granulkę w 10 ml PBS. Osad (frakcja chromatyny) może być przechowywany w temperaturze -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie.

5. Sonikacja chromatyny (na 2 x 10⁷ komórek)

1. Zawiesić frakcję chromatyny w 800 μl zmodyfikowanego buforu do lizy 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS i 1x inhibitory proteazy) i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
2. Sonikować chromatynę za pomocą sonikatora (patrz Materiały) i w następujących warunkach: wyjście: 3; obowiązek: 100% (ciągły); i czas: wolny. Wykonaj 10-18 cykli sonikacji przez 10 sekund i chłodzenie na lodzie przez 20 sekund. Aby uniknąć nadmiernego ogrzewania, próbki należy inkubować na lodzie przez 2 minuty co 5-6 cykli. Aby uniknąć pienienia, utrzymuj pozycję końcówki sondy sonizacyjnej 0,5 cm nad dnem rurki.
3. Odwirować próbkę w temperaturze (16 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut) i przenieść supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml. Chromatyna poddana sonikacji może być przechowywana w temperaturze -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie.

6. Ocena fragmentacji chromatyny

1. Zmieszać 10 μl rozdrobnionej chromatyny z 85 μl wody destylowanej.
2. Dodać 4 μl 5 M NaCl i inkubować w temperaturze 65 °C O/N.
3. Dodać 1 μl 10 mg/ml RNazy A i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
4. Dodać 2 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 μl 1 M Tris (pH 6,8) i 1 μl 20 mg/ml proteinazy K, a następnie inkubować w temperaturze 45 °C przez 1,5 godziny.
5. Oddzielić 10 μl próbki przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym, który nie zawiera barwników barwiących, takich jak SYBR Green.
6. Wybarwić żel, aby ocenić rozkład długości rozdrobnionej chromatyny. Zalecane są warunki, które generują średnią długość 0,5-2 kbp (zakres 0,2-4 kbp).
7. Oczyścić DNA z pozostałych próbek przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową lub przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA (patrz Materiały). Oczyszczony DNA może być wykorzystany jako wejściowy DNA do oszacowania wydajności analiz enChIP (patrz 8.11).

7. Przygotowanie Dynabeads sprzężonych z przeciwciałami (na 2 x 10⁷ komórek)

1. Przygotować dwie probówki o pojemności 1,5 ml, jedną do wstępnego oczyszczania przy użyciu zwykłej mysiej IgG, a drugą do inkubacji z anty-FLAG Ab. Dodać 150 μl kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G (patrz Materiały) do każdej probówki.
2. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty. Wyrzuć supernatant przez pipetowanie.
3. Zawiesić kulki w 1 ml PBS zawierającym 0,01% Tween-20 (PBS-T). Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty. Odrzucić supernatant przez pipetowanie, a następnie powtórzyć czynność.
4. Zawiesić kulki w 1 ml PBS-T zawierającego 0,1% BSA.
5. Dodać 15 μg normalnej mysiej IgG lub anty-FLAG Ab i obrócić w temperaturze 4 °C O/N.
6. Odkręć na chwilę, a następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty. Wyrzuć supernatant przez pipetowanie.
7. Zawiesić kulki w 1 ml PBS-T. Odwróć próbkę kilka razy i krótko odwiruj. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym i odczekać 3 minuty, a następnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie. Powtórz pranie jeszcze dwa razy za pomocą PBS-T (w sumie trzy etapy prania).

8. Immunoprecypitacja chromatyny (na 2 x 10⁷ komórek)

1. Zmieszać rozdrobnioną chromatynę przygotowaną w 5.3) (około 800 μl) z jedną piątą objętości (około 200 μl) zmodyfikowanego buforu do lizy 3 zawierającego 5% Triton X-100 (końcowe stężenie 1% Triton X-100
).
2. Dodaj roztwór chromatyny do probówki, w której przygotowano kulki magnetyczne sprzężone z białkiem G sprzężone z normalną mysią IgG. Obracać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
3. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty.
4. Przenieść supernatant do probówki, w której przygotowano kulki magnetyczne sprzężone z białkiem G sprzężone z anty-FLAG Ab. Obracać w temperaturze 4 °C O/N.
5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty. Wyrzuć supernatant przez pipetowanie.
6. Zawiesić kulki w 1 ml buforu o niskiej zawartości soli (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS i 1x inhibitory proteazy) i obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Umieścić probówkę na stojaku magnetycznym i odczekać 3 minuty. Odrzucić supernatant przez pipetowanie i powtórzyć etap płukania.
7. Umyj kulki dwukrotnie buforem o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS i 1x inhibitorami proteazy).
8. Umyj kulki buforem LiCl (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% deoksycholanem sodu i 1x inhibitorami proteazy) dwukrotnie.
9. Umyj kulki jednokrotnie TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 i 1x inhibitory proteazy).
10. Zawiesić kulki w 200 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x inhibitory proteazy i 500 μg/ml peptydu 3×FLAG) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Umieścić probówkę na stojaku magnetycznym i odczekać 3 min. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i powtórzyć etap elucji.
11. Oczyścić DNA z małej porcji (np. 5%) eluatu przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową lub przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA (patrz Materiały). Oczyszczone DNA można wykorzystać do PCR ze specyficznymi zestawami starterów w celu oszacowania wydajności analiz enChIP poprzez porównanie z wejściowym DNA przygotowanym w kroku 6.7, jak opisano wcześniej^14,16.

9. SDS-PAGE, barwienie i analiza spektrometryczna mas

1. Zmieszać eluat (400 μl) z 1 ml 2-propanolu, 50 μl 3M octanu sodu (pH 5,2) i 5 μl 20 mg/ml glikogenu. Wytrącić chromatynę w temperaturze -20 °C O/N.
2. Odwirować próbkę (16 000 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut) i odrzucić supernatant. Przepłukać osad 1 ml 70% etanolu i ponownie odwirować (16 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut). Całkowicie odrzucić supernatant przez pipetowanie.
3. Zawiesić osad w 40 μl 2x buforu do próbek (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-merkaptoetanolu, 4% SDS, 10% sacharozy i 0,004% błękitu bromofenolowego). Wirować przez 5 minut, aby całkowicie rozpuścić osad, a następnie inkubować w temperaturze 100 °C przez 30 minut, aby zdenaturować białka i odwrócić sieciowanie.
4. W przypadku SDS-PAGE należy nałożyć 40 μl próbki na żel, aż barwnik osiągnie 1 cm poniżej dołka. Uwaga: Zwykle używamy żeli gradientowych 4-20%, ale można użyć innych żeli %.
5. Zabarwić żel bejcą Coomassie Brilliant Blue lub srebrną.
6. Pokrój żel na pięć części (wysokość 2 mm).
7. Przeprowadzić w mineralizacji żelowej i analizie spektrometrii mas, jak opisano wcześniej^13-16.
8. W przypadku eksperymentów SILAC z 5 x 10⁷ komórek każda (łącznie 1 x 10⁸ komórek), zawiesić osad z początkowych pięciu probówek w 40 μl 2x buforu próbki (nie jest konieczne zwiększanie skali).

10. Oczyszczanie RNA i analiza sekwencyjna RNA-RNA

1. Aby oczyścić RNA po enChIP, dodać 5 j./ml inhibitora RNazy (patrz Materiały) do wszystkich roztworów buforowych, z wyjątkiem zmodyfikowanego buforu do lizy 3 i buforu elucyjnego, do których dodać 40 j./ml inhibitora RNazy.
2. Zmieszać eluat (400 μl) z 16 μl 5 M NaCl i inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
3. Dodać 1 ml odczynnika na bazie kwasu guanidyny i fenolu (patrz Materiały) do próbki. Wirować przez 15 sekund, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-15 minut. Odwirować próbkę przez 15 minut przy sile 12 000 × g i temperaturze pokojowej.
4. Przenieść sklarowany osad do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 5 μl p-bromoanizolu. Wirować przez 15 sekund, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut. Odwirować próbkę przez 10 minut przy 12 000 × g i temperaturze pokojowej.
5. Przenieść supernatant (około 1 ml) do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodać 1 ml 2-propanolu. Odwrócić probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Załaduj mieszaninę do kolumny w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały). Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 12 000 × g i RT.
6. Przepłukać kolumnę 400 μl buforu do przemywania RNA w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały).
7. Dodać 80 μl koktajlu DNazy I (mieszanina 5 μl DNazy I (1 U/μl), 8 μl 10× buforu reakcyjnego DNazy I, 3 μl wody wolnej od DNazy/RNaz i 64 μl buforu płuczącego RNA w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały)) do kolumny. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie wirować przez 30 sekund w temperaturze 12 000 × g i w temperaturze pokojowej.
8. Przepłukać kolumnę 400 μl buforu RNA PreWash w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały) dwukrotnie.
9. Eluować RNA za pomocą 50 μl wody wolnej od DNazy/RNaz. Eluowany RNA może być używany do sekwencjonowania RNA.

Wyniki

Ogólnie rzecz biorąc, 1-30% docelowych regionów genomu można oczyścić za pomocą enChIP. Rysunek 3 zawiera reprezentatywne dane przedstawiające wyniki analiz enChIP ukierunkowanych na telomery i promotor genu czynnika regulatorowego interferonu (IFN) 1 (IRF-1). Jako przykłady typowych wyników, w tabeli 1 wymieniono białka związane z promotorem IRF-1 w sposób specyficzny dla IFNγ zidentyfikowany przez enChIP-SILAC, w tabeli 2 wymieniono białka wiążące telomery zidentyfikowane przez enChIP w połączeniu ze spektrometrią mas (enChIP-MS), a w tabeli 3 wymieniono RNA związane z telomerami zidentyfikowanymi przez enChIP-RNA-Seq.

Rysunek 1. Omówienie enChIP. Pokazano enChIP przy użyciu CRISPR (A, B) i TAL (C, D, E). Interesujące go miejsce jest oznaczone zmodyfikowanymi cząsteczkami wiążącymi DNA, takimi jak białko TAL lub system CRISPR składający się z katalitycznie nieaktywnej formy Cas9 (dCas) i przewodnika RNA (gRNA). Oddziaływania molekularne są utrwalane za pomocą formaldehydu lub innych środków sieciujących, jeśli to konieczne. Następnie utrwalona chromatyna jest fragmentowana przez sonikację lub trawienie enzymatyczne. Oznaczone regiony genomu są oczyszczane przez oczyszczanie powinowactwa. Wreszcie, sieciowanie jest odwrócone, a oddziałujące cząsteczki (regiony genomu, RNA i białka) są identyfikowane za pomocą sekwencjonowania nowej generacji i spektrometrii mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Sekwencja gBlocka. Pokazano promotor U6 (w kolorze czarnym), nukleotyd G przed sekwencją prowadzącą (w kolorze niebieskim), sekwencję prowadzącą (dystans gRNA) (w kolorze czerwonym), sekwencję rusztowania (w kolorze zielonym) i sekwencję terminatora (w kolorze pomarańczowym).

Rysunek 3. Plony z reprezentatywnych analiz enChIP. (A) Procentowe dane wejściowe dla docelowego locus IRF-1 i niedocelowego locus Sox2. (B) Procentowe dane wejściowe dla docelowych telomerów i niedocelowych satelitów γ. Dane liczbowe zostały zaadaptowane i zmodyfikowane w stosunku do poprzednich publikacji^15,16.

Kategorie białka transkrypcja DDX1, PARP1, CKAP4, homolog Pescadillo, PURβ,
aktywowany aktywator transkrypcji polimerazy RNA II p15,
BTF3, białko wiążące Myb 1A Deacetylacja histonów,
Elementy rdzenia RBBP4, PA2G4, TBL3 Acetylotransferaza Białko N-metylotransferaza argininy 1 Topoizomeraza DNA Topoizomeraza DNA 2α Histony Histon H2A. Z, histon H3.2

Tabela 1: Przykłady białek związanych z ludzkim regionem promotora IRF-1 w sposób specyficzny dla IFNγ zidentyfikowany przez enChIP-SILAC. Tabela została zaadaptowana z poprzedniej publikacji¹⁶.

Kategorie białka Białka wiążące telomery ssaków PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 Białka wiążące telomery w drożdżach
lub innych organizmów Protokół IMP4 Białka oddziałujące z telomerami wiążącymi
Białka [powiązane białko wiążące telomery] Polimeraza DNA α (POLA1) [Cdc13p],
ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1],
exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1],
exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] Białka lokalizujące się w heterochromatynie ZAGIĘCIE3 Białka regulujące znaczniki epigenetyczne KDM5C (Biblioteka KDM5C) Białka, których mutacje wpływają na funkcję telomerów Polimeraza DNA α (POLA1), HAT1, Nup133,
CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY,
ligaza glutaminiano-cysteinowa, glutaredoksyna, SMRC1

Tabela 2: Przykłady białek związanych z telomerami myszy zidentyfikowanymi przez enChIP-MS. Tabela została zaadaptowana z poprzedniej publikacji¹⁵.

Kategorie Roztwory RNA Składniki telomerazy Terc, Rmrp Telomeryczne RNA Terras scaRNA Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 SnoRNA H/ACA Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a C/D snoRNA Snord17, Snord15a, Snord118 lncRNA (lncRNA) Ładny1

Tabela 3: Przykłady RNA związanych z telomerami myszy zidentyfikowanymi przez enChIP-RNA-Seq. Tabela została zaadaptowana z poprzedniej publikacji¹⁷.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy oczyszczanie określonych regionów genomu za pomocą zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA, takich jak system CRISPR i białka TAL, oraz identyfikację białek i RNA związanych z tymi regionami genomu. Wiązanie zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA z genomem może wpływać na strukturę chromatyny, w tym pozycjonowanie nukleosomów, i może znosić funkcje genomowe, jak opisano w eksperymentach interferencyjnych CRISPR²¹. Aby uniknąć tych potencjalnych nieprawidłowych efektów, proponujemy szczegółowe wytyczne dotyczące wyboru docelowych regionów genomu. Po pierwsze, aby uniknąć potencjalnego zahamowania rekrutacji polimeraz RNA i czynników transkrypcyjnych, a także zakłócenia pozycjonowania nukleosomów wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji, regiony docelowe do analiz regionów promotorowych powinny znajdować się kilkaset par zasad przed (5' do) miejsca rozpoczęcia transkrypcji. W przeciwieństwie do tego, podczas analizy regionów genomowych o wyraźnych granicach, takich jak wzmacniacze i tłumiki, regiony genomu, które są bezpośrednio zestawione z tymi regionami, mogą być celowane, ponieważ jest mniej prawdopodobne, że wiązanie zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA wpłynie na ich funkcje. Ponadto najlepiej jest unikać stosowania regionów docelowych, które są konserwatywne u różnych gatunków, ponieważ ważne cząsteczki wiążące DNA często wiążą się z ewolucyjnie konserwatywnymi regionami, a zahamowanie ich wiązania może zakłócić funkcje docelowych regionów genomu. W związku z tym zawsze konieczne jest sprawdzenie, czy funkcja docelowego regionu genomowego jest zachowana w ustalonych komórkach wykorzystywanych do analiz enChIP. Ponieważ wiele gRNA można łatwo przetestować, a generowanie wielu wersji TAL lub białek palca cynkowego rozpoznających różne docelowe regiony genomu jest żmudne i kosztowne, enChIP przy użyciu CRISPR jest korzystniejsze niż enChIP przy użyciu innych białek.

Wykazano, że dCas9 wiąże się z miejscami poza celem, chociaż powinowactwo do tych miejsc może być słabsze niż do miejsc docelowych^22-25. Istnieje kilka sposobów radzenia sobie z zanieczyszczeniem cząsteczek związanych z tymi miejscami poza celem. Po pierwsze, zalecane byłoby użycie kilku, co najmniej dwóch, różnych gRNA. Te cząsteczki powszechnie obserwowane w enChIP przy użyciu odrębnych gRNA byłyby prawdziwie dodatnie. Po drugie, porównanie różnych warunków dla enChIP byłoby skuteczne w eliminowaniu zanieczyszczenia cząsteczkami niespecyficznymi i cząsteczkami związanymi z miejscami niedocelowymi. Przykładami tych zestawów porównawczych mogą być (i) stymulacja (-) i (+) lub (ii) różne typy komórek, takie jak limfocyty T i komórki B. Na koniec należy przeprowadzić analizę ilościową wiązania cząsteczek kandydujących, aby potwierdzić ich specyficzne wiązanie z miejscami docelowymi. Preferowane jest przygotowanie komórek eksprymujących tylko dCas9, ale nie gRNA jako kontrolę negatywną.

Korzystając z analiz enChIP, udało nam się zidentyfikować szereg znanych i nowych cząsteczek oddziałujących z określonymi regionami genomu (tabele 1-3)^14-17. Jednak ta technika nie zdołała wykryć niektórych innych znanych białek oddziałujących z tymi regionami. Na przykład, STAT1 podobno wiąże się z promotorem IRF-1 po stymulacji IFNγ⁸, ale nasza analiza enChIP-SILAC nie wykryła STAT1 jako białka indukowanego do interakcji z tym regionem genomu¹⁶. Ponadto w analizie telomerów enChIP-MS nie wykryliśmy białek schronienia składających się z TRF-1 i TRF-2¹⁵, które, jak wykazano, oddziałują z telomerami²⁶. Istnieje kilka potencjalnych przyczyn tych rozbieżności. Po pierwsze, stechiometria wiązania Stat1 z promotorem IRF-1 może być bardzo niska. Uzasadnione jest, że enChIP-MS, w tym enChIP-SILAC, wykrywa białka, które są bardziej obficie związane z docelowymi regionami genomu; W związku z tym analiza większej liczby komórek może być konieczna do wykrycia tych białek. Zwiększenie czułości instrumentów do leczenia stwardnienia rozsianego przyczyniłoby się również do skutecznego wykrywania białek o niskim stopniu wiązania stechiometrycznego. Po drugie, niektóre białka, w tym Stat1 i shelteryny, mogą być trudnymi celami do analiz w kierunku stwardnienia rozsianego. Po trzecie, w naszej analizie białek wiążących telomery¹⁵, białka 3×FLAG-TAL rozpoznające telomery (3×FN-Tel-TAL) mogły blokować wiązanie schronin z telomerami w sposób konkurencyjny.

W przeciwieństwie do względnej trudności w wykrywaniu czynników transkrypcyjnych wiążących się z określonymi regionami genomu za pomocą enChIP, udało nam się zidentyfikować regulatory epigenetyczne, takie jak enzymy modyfikujące histony, za pomocą analiz enChIP. Sukces tej techniki może wynikać z faktu, że regulatory epigenetyczne wiążą się z szerokim zakresem regionów genomu; w związku z tym dla stwardnienia rozsianego dostępnych jest więcej białek na region genomu. Ponieważ epigenetyczne regulatory są coraz częściej uznawane za ważne cele dla leków przeciwko nieuleczalnym chorobom, takim jak rak, enChIP byłby użytecznym narzędziem do identyfikacji epigenetycznych celów leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Usługa syntezy gBlock	Life Technologies	Synteza genów przez GeneArt
Usługa syntezy gBlock	IDT (Integrated DNA Technologies)	Fragmenty genów
gBlocks pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2 Addgene		51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
Usługa syntezy TAL	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3&razy; FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3 razy; FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3 razy; FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3 razy; FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
Sprzężony z FITC anty-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
Podłoże DMEM dla SILAC	Life Technologies	89985	Inne podłoże można kupić w Life Technologies
Dialyzed FBS dla SILAC	Life Technologies	89986
L-lizyna-2HCl dla SILAC	Life Technologies	89987	Dla lekkiego medium
L-arginina-HCl dla SILAC	Life Technologies	89989	Dla lekkiego
L-lizyna-2HCl, 13C6 dla SILAC	Life Technologies	89988	Dla ciężkiego medium
L-arginina-HCl, 13C6, 15N4 dla SILAC	Life Technologies	89990	Dla ciężkiego medium
Kompletny, mini, Diagnostyka Roche bez EDTA		4693159
zakłócacz ultradźwiękowy UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Koncentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus Inhibitor RNazy	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Zestaw do miniprepu Direct-zol RNA	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		Komponent systemu nanoLC-MS/MS do analizy MS
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		Komponent systemu nanoLC-MS/MS do analizy MS
Automatyczny podajnik próbek HTC-PAL	CTC Analytics		Komponent systemu nanoLC-MS/MS do analizy MS