Artykuł metodologiczny

Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53478

⸱

20 stycznia 2016

 , 
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

W tym artykule

Podsumowanie

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Protokół ten opisuje procedury przeprowadzania imunoprecipitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP) w celu identyfikacji białek i RNA związanych z określonym regionem genomu.

Streszczenie

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Aby umożliwić bezstronną identyfikację cząsteczek oddziałujących z określonym regionem genomu będącym przedmiotem zainteresowania, opracowaliśmy niedawno technikę immunoprecypitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP). W tym miejscu opisujemy, jak używać enChIP do izolowania określonych regionów genomu i identyfikowania powiązanych białek i RNA. Po pierwsze, interesujący region genomowy jest oznaczany białkiem podobnym do aktywatora transkrypcji (TAL) lub zgrupowanym regularnie rozmieszczonym kompleksem krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) składającym się z katalitycznie nieaktywnej formy Cas9 i przewodnika RNA. Następnie chromatyna jest sieciowana i fragmentowana przez sonikację. Oznaczone locus jest następnie immunoprecypitowane, a sieciowanie jest odwracane. Wreszcie, białka lub RNA, które są związane z izolowaną chromatyną, są poddawane odpowiednio analizom spektrometrii mas lub sekwencjonowania RNA. Takie podejście pozwala na udaną identyfikację białek i RNA związanych z interesującym regionem genomu.

Wprowadzenie

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów regulacji funkcji genomowych, takich jak transkrypcja i regulacja epigenetyczna. Chociaż opracowano kilka technik analizy biochemicznej określonych regionów genomu1-7, nie są one powszechnie stosowane na tym etapie ze względu na ich wewnętrzne problemy, takie jak ograniczone zastosowanie (np. tylko w przypadku loci o dużej liczbie kopii lub loci z powtórzeniami) oraz zbyt wiele czasu i wysiłku.

Aby łatwo przeprowadzić analizę biochemiczną określonych regionów genomu, opracowaliśmy dwie technologie immunoprecypitacji chromatyny specyficznej dla locus (ChIP), a mianowicie ChIP insercyjne (iChIP)8-13 i ChIP za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP)14-17. W iChIP interesujące locus jest oznaczane przez wstawienie sekwencji rozpoznających egzogennego białka wiążącego DNA, takiego jak LexA. Locus jest następnie izolowany przez oczyszczanie powinowactwa przy użyciu znakowanego białka wiążącego DNA. W enChIP zmodyfikowane cząsteczki wiążące DNA, takie jak białka palca cynkowego, białka podobne do aktywatora transkrypcji (TAL) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), są używane do oznaczania miejsca zainteresowania (Figura 1). Następnie region genomu jest izolowany przez oczyszczanie powinowactwa znakowanych cząsteczek wiążących DNA.

Jedną z zalet enChIP w stosunku do iChIP jest to, że nie jest konieczne wprowadzanie sekwencji rozpoznawania egzogennego białka wiążącego DNA. Celowanie w loci za pomocą kompleksów CRISPR składających się z katalitycznie nieaktywnej formy Cas9 (dCas9) i przewodnika RNA (gRNA) jest znacznie łatwiejsze niż celowanie w te regiony za pomocą iChIP lub enChIP przy użyciu TAL i białek palca cynkowego. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół enChIP w połączeniu ze spektrometrią mas i sekwencjonowaniem RNA (RNA-Seq) w celu identyfikacji odpowiednio białek i RNA związanych z locus.

Protokół

1. Projektowanie zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA, rozpoznających locus celu

  1. W przypadku enChIP wykorzystujących kompleksy CRISPR należy użyć narzędzia internetowego CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) w celu zidentyfikowania kandydujących sekwencji docelowych gRNA w regionie genomu będącym przedmiotem zainteresowania opisanym wcześniejjako 18. To narzędzie internetowe zwraca 23 miejsca genomowe pz w postaci 5'-N20NGG-3' w regionie docelowym.
  2. Zsyntetyzować gBlock, w tym sekwencję promotora U6 i sekwencję 5'-N20 w 5'-N20NGG-3', korzystając z usług komercyjnych (patrz rysunek 2)19,20. Do celów subklonowania należy dołączyć odpowiednie miejsca enzymów restrykcyjnych poza gBlockiem.
  3. Wstaw gBlock do odpowiedniego wektora, jak opisano wcześniej16. Dostępnych jest kilka wektorów retrowirusowych dla gBlocks (patrz Materiały).
  4. W przypadku enChIP wykorzystujących białka TAL należy zaprojektować białka TAL rozpoznające loci docelowe. Generowanie plazmidów kodujących białka TAL za pomocą usług komercyjnych. Wygeneruj wektory ekspresyjne zawierające białka TAL połączone z jednym lub więcej znacznikami, takimi jak 3×FLAG, jak opisano wcześniej15.

2. Tworzenie komórek do analizy enChIP

  1. Ekspresja 3×FLAG-dCas9 i gRNA (procedura oparta na CRISPR) lub 3×FLAG-TAL (procedura oparta na białku TAL) w komórkach, które mają być analizowane, jak opisano wcześniej14-17.
    1. Użyj transfekcji przejściowej, jeśli wydajność transfekcji jest wysoka. Dostępny jest wektor ekspresyjny zawierający 3×FLAG-dCas9 i promotor CMV (patrz Materiały).
    2. Rozważ ustalenie stabilnych transformantów przy użyciu konwencjonalnych metod, jeśli wydajność transfekcji w stanach przejściowych jest niska. Oprócz wyżej wymienionych wektorów retrowirusowych dla gBlock, dostępne są wektory retrowirusowe 3×FLAG-dCas9 (patrz Materiały).
  2. Potwierdzić ekspresję białka 3xFLAG-dCas9 lub 3xFLAG-TAL w transfekowanych komórkach za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciała anty-FLAG (Ab), jak opisano wcześniej14-17,
    Uwaga: Ekspresję tych znakowanych białek można również potwierdzić przez barwienie wewnątrzkomórkowe za pomocą anty-FLAG-FITC i późniejszą analizę FACS. Protokół barwienia wewnątrzkomórkowego można pobrać z naszej strony internetowej (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
  3. Potwierdź ekspresję gRNA za pomocą standardowej techniki RT-PCR.
  4. W celu ilościowej identyfikacji białek oddziałujących z regionem genomu będącym przedmiotem zainteresowania, należy rozważyć zastosowanie znakowania stabilnych izotopów za pomocą analizy aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC) w połączeniu z enChIP (enChIP-SILAC).
    Uwaga: Nośniki do analizy SILAC można zakupić u dostawców komercyjnych. SILAC jest skuteczny w wykrywaniu określonych interakcji.
    1. Hodowla komórek w ciężkim podłożu SILAC. Przygotować komórki hodowane w pożywce świetlnej SILAC jako kontrolę ujemną. Użyj co najmniej 5 × 107 komórek na każde podłoże SILAC (ciężkie lub lekkie). Aby uzyskać wydajne etykietowanie, dodaj zarówno L-Lizynę-2HCl, 13C6, jak i L-Argininę-HCl 13C6, 15N4 w pożywce SILAC Heavy. Uwaga: Do znakowania białek konieczne jest co najmniej pięć podziałów komórkowych.
      1. Na przykład, hodowla ludzkich komórek włókniakomięsaka HT1080 stabilnie eksprymujących 3xFLAG-dCas9 i gRNA w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce DMEM dla SILAC i dializowanej płodowej surowicy bydlęcej z lizyną-2HCl plus L-argininą-HCl (lekkie podłoże) lub 13C6 L-lizyna-2HCl plus 13C615N4 L-arginina-HCl (ciężkie podłoże) (patrz Materiały)16. Dodać 50 mg lekkiej lub ciężkiej L-lizyny-2HCl i L-argininy-HCl w 500 ml pożywki.
      2. Trypsynizuj i ponownie płytkuj komórki, zanim zaczną się zlewać, aby komórki utrzymywały wykładniczy wzrost.

3. Sieciowanie komórek za pomocą formaldehydu

  1. W przypadku komórek w hodowli zawiesinowej przenieść 2 × 107 komórek wykazujących ekspresję białek 3xFLAG-TAL lub 3xFLAG-dCas9 plus gRNA i zawiesić w 30 ml zwykłej pożywki hodowlanej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Gdy używanych jest więcej komórek, proporcjonalnie zwiększaj objętości i ilości odczynników. W przypadku eksperymentów SILAC należy wymieszać komórki hodowane w ciężkim lub lekkim podłożu (5 x 107 komórek każda) i podzielić łącznie 1 x 108 komórek na 5 probówek zawierających 2 x 107 komórek.
  2. Dodać 810 μl 37% formaldehydu do 30 ml zawiesiny komórkowej (stężenie końcowe 1%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. W przypadku komórek przylegających należy bezpośrednio przymocować komórki w szalkach hodowlanych, dodając 810 μl 37% formaldehydu do 30 ml pożywki hodowlanej.
  3. Przerwać sieciowanie poprzez dodanie 3,1 ml 1,25 M roztworu glicyny (końcowe stężenie 127 mM) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie (300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad, w tym formaldehyd, i przechowywać go w odpowiedniej butelce na odpady.
    1. W przypadku komórek przylegających należy odłączyć komórki za pomocą skrobaka do komórek i zebrać w probówce o pojemności 50 ml, a następnie zebrać komórki zgodnie z opisem w tym kroku.
    2. W przypadku eksperymentów SILAC należy wymieszać oderwane komórki hodowane w ciężkim lub lekkim podłożu (5 x 107 komórek każda), podzielić całość komórek 1 x 108 na 5 probówek zawierających 2 x 107 komórek i zebrać komórki zgodnie z opisem w tym kroku.
  5. Przemyć osad komórkowy 30 ml PBS dwa razy na probówkę. Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad, w tym formaldehyd, i przechowywać go w odpowiedniej butelce na odpady. Z odpadami formaldehydu należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego. Utrwalone komórki można zamrażać i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Przygotowanie chromatyny (na 2 x 107 komórek)

  1. Zawiesić utrwalone komórki w 10 ml buforu do lizy komórek (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 i 1× inhibitory proteazy) i inkubować na lodzie przez 10 minut.
  2. Odwirować próbkę (830 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut) i ostrożnie odrzucić supernatant.
  3. Zawiesić osad w 10 ml buforu do lizy jądrowej (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,5% lauroilosarkozyny i 1x inhibitory proteazy). Inkubować na lodzie przez 10 minut i wirować co 2-3 minuty.
  4. Odwirować próbkę (830 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut) i ostrożnie odrzucić supernatant.
  5. Umyj granulkę w 10 ml PBS. Osad (frakcja chromatyny) może być przechowywany w temperaturze -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie.

5. Sonikacja chromatyny (na 2 x 107 komórek)

  1. Zawiesić frakcję chromatyny w 800 μl zmodyfikowanego buforu do lizy 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS i 1x inhibitory proteazy) i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Sonikować chromatynę za pomocą sonikatora (patrz Materiały) i w następujących warunkach: wyjście: 3; obowiązek: 100% (ciągły); i czas: wolny. Wykonaj 10-18 cykli sonikacji przez 10 sekund i chłodzenie na lodzie przez 20 sekund. Aby uniknąć nadmiernego ogrzewania, próbki należy inkubować na lodzie przez 2 minuty co 5-6 cykli. Aby uniknąć pienienia, utrzymuj pozycję końcówki sondy sonizacyjnej 0,5 cm nad dnem rurki.
  3. Odwirować próbkę w temperaturze (16 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut) i przenieść supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml. Chromatyna poddana sonikacji może być przechowywana w temperaturze -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie.

6. Ocena fragmentacji chromatyny

  1. Zmieszać 10 μl rozdrobnionej chromatyny z 85 μl wody destylowanej.
  2. Dodać 4 μl 5 M NaCl i inkubować w temperaturze 65 °C O/N.
  3. Dodać 1 μl 10 mg/ml RNazy A i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
  4. Dodać 2 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 μl 1 M Tris (pH 6,8) i 1 μl 20 mg/ml proteinazy K, a następnie inkubować w temperaturze 45 °C przez 1,5 godziny.
  5. Oddzielić 10 μl próbki przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym, który nie zawiera barwników barwiących, takich jak SYBR Green.
  6. Wybarwić żel, aby ocenić rozkład długości rozdrobnionej chromatyny. Zalecane są warunki, które generują średnią długość 0,5-2 kbp (zakres 0,2-4 kbp).
  7. Oczyścić DNA z pozostałych próbek przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową lub przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA (patrz Materiały). Oczyszczony DNA może być wykorzystany jako wejściowy DNA do oszacowania wydajności analiz enChIP (patrz 8.11).

7. Przygotowanie Dynabeads sprzężonych z przeciwciałami (na 2 x 107 komórek)

  1. Przygotować dwie probówki o pojemności 1,5 ml, jedną do wstępnego oczyszczania przy użyciu zwykłej mysiej IgG, a drugą do inkubacji z anty-FLAG Ab. Dodać 150 μl kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G (patrz Materiały) do każdej probówki.
  2. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty. Wyrzuć supernatant przez pipetowanie.
  3. Zawiesić kulki w 1 ml PBS zawierającym 0,01% Tween-20 (PBS-T). Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty. Odrzucić supernatant przez pipetowanie, a następnie powtórzyć czynność.
  4. Zawiesić kulki w 1 ml PBS-T zawierającego 0,1% BSA.
  5. Dodać 15 μg normalnej mysiej IgG lub anty-FLAG Ab i obrócić w temperaturze 4 °C O/N.
  6. Odkręć na chwilę, a następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty. Wyrzuć supernatant przez pipetowanie.
  7. Zawiesić kulki w 1 ml PBS-T. Odwróć próbkę kilka razy i krótko odwiruj. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym i odczekać 3 minuty, a następnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie. Powtórz pranie jeszcze dwa razy za pomocą PBS-T (w sumie trzy etapy prania).

8. Immunoprecypitacja chromatyny (na 2 x 107 komórek)

  1. Zmieszać rozdrobnioną chromatynę przygotowaną w 5.3) (około 800 μl) z jedną piątą objętości (około 200 μl) zmodyfikowanego buforu do lizy 3 zawierającego 5% Triton X-100 (końcowe stężenie 1% Triton X-100
    2. ).
  2. Dodaj roztwór chromatyny do probówki, w której przygotowano kulki magnetyczne sprzężone z białkiem G sprzężone z normalną mysią IgG. Obracać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  3. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty.
  4. Przenieść supernatant do probówki, w której przygotowano kulki magnetyczne sprzężone z białkiem G sprzężone z anty-FLAG Ab. Obracać w temperaturze 4 °C O/N.
  5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 3 minuty. Wyrzuć supernatant przez pipetowanie.
  6. Zawiesić kulki w 1 ml buforu o niskiej zawartości soli (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS i 1x inhibitory proteazy) i obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Umieścić probówkę na stojaku magnetycznym i odczekać 3 minuty. Odrzucić supernatant przez pipetowanie i powtórzyć etap płukania.
  7. Umyj kulki dwukrotnie buforem o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS i 1x inhibitorami proteazy).
  8. Umyj kulki buforem LiCl (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% deoksycholanem sodu i 1x inhibitorami proteazy) dwukrotnie.
  9. Umyj kulki jednokrotnie TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 i 1x inhibitory proteazy).
  10. Zawiesić kulki w 200 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x inhibitory proteazy i 500 μg/ml peptydu 3×FLAG) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Umieścić probówkę na stojaku magnetycznym i odczekać 3 min. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i powtórzyć etap elucji.
  11. Oczyścić DNA z małej porcji (np. 5%) eluatu przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową lub przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA (patrz Materiały). Oczyszczone DNA można wykorzystać do PCR ze specyficznymi zestawami starterów w celu oszacowania wydajności analiz enChIP poprzez porównanie z wejściowym DNA przygotowanym w kroku 6.7, jak opisano wcześniej14,16.

9. SDS-PAGE, barwienie i analiza spektrometryczna mas

  1. Zmieszać eluat (400 μl) z 1 ml 2-propanolu, 50 μl 3M octanu sodu (pH 5,2) i 5 μl 20 mg/ml glikogenu. Wytrącić chromatynę w temperaturze -20 °C O/N.
  2. Odwirować próbkę (16 000 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut) i odrzucić supernatant. Przepłukać osad 1 ml 70% etanolu i ponownie odwirować (16 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut). Całkowicie odrzucić supernatant przez pipetowanie.
  3. Zawiesić osad w 40 μl 2x buforu do próbek (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-merkaptoetanolu, 4% SDS, 10% sacharozy i 0,004% błękitu bromofenolowego). Wirować przez 5 minut, aby całkowicie rozpuścić osad, a następnie inkubować w temperaturze 100 °C przez 30 minut, aby zdenaturować białka i odwrócić sieciowanie.
  4. W przypadku SDS-PAGE należy nałożyć 40 μl próbki na żel, aż barwnik osiągnie 1 cm poniżej dołka. Uwaga: Zwykle używamy żeli gradientowych 4-20%, ale można użyć innych żeli %.
  5. Zabarwić żel bejcą Coomassie Brilliant Blue lub srebrną.
  6. Pokrój żel na pięć części (wysokość 2 mm).
  7. Przeprowadzić w mineralizacji żelowej i analizie spektrometrii mas, jak opisano wcześniej13-16.
  8. W przypadku eksperymentów SILAC z 5 x 107 komórek każda (łącznie 1 x 108 komórek), zawiesić osad z początkowych pięciu probówek w 40 μl 2x buforu próbki (nie jest konieczne zwiększanie skali).

10. Oczyszczanie RNA i analiza sekwencyjna RNA-RNA

  1. Aby oczyścić RNA po enChIP, dodać 5 j./ml inhibitora RNazy (patrz Materiały) do wszystkich roztworów buforowych, z wyjątkiem zmodyfikowanego buforu do lizy 3 i buforu elucyjnego, do których dodać 40 j./ml inhibitora RNazy.
  2. Zmieszać eluat (400 μl) z 16 μl 5 M NaCl i inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
  3. Dodać 1 ml odczynnika na bazie kwasu guanidyny i fenolu (patrz Materiały) do próbki. Wirować przez 15 sekund, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-15 minut. Odwirować próbkę przez 15 minut przy sile 12 000 × g i temperaturze pokojowej.
  4. Przenieść sklarowany osad do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 5 μl p-bromoanizolu. Wirować przez 15 sekund, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut. Odwirować próbkę przez 10 minut przy 12 000 × g i temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść supernatant (około 1 ml) do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodać 1 ml 2-propanolu. Odwrócić probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Załaduj mieszaninę do kolumny w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały). Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 12 000 × g i RT.
  6. Przepłukać kolumnę 400 μl buforu do przemywania RNA w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały).
  7. Dodać 80 μl koktajlu DNazy I (mieszanina 5 μl DNazy I (1 U/μl), 8 μl 10× buforu reakcyjnego DNazy I, 3 μl wody wolnej od DNazy/RNaz i 64 μl buforu płuczącego RNA w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały)) do kolumny. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie wirować przez 30 sekund w temperaturze 12 000 × g i w temperaturze pokojowej.
  8. Przepłukać kolumnę 400 μl buforu RNA PreWash w zestawie do oczyszczania RNA (patrz Materiały) dwukrotnie.
  9. Eluować RNA za pomocą 50 μl wody wolnej od DNazy/RNaz. Eluowany RNA może być używany do sekwencjonowania RNA.

Wyniki

Ogólnie rzecz biorąc, za pomocą enChIP można oczyścić od 1-30% docelowych regionów genomowych. Rycina 3 zawiera reprezentatywne dane pokazujące wydajność analiz enChIP celowanych w telomery oraz promotor genu czynnika regulacyjnego interferonu (IFN)-1 (IRF-1). Jako przykłady typowych wyników, w Tabeli 1 wymieniono białka powiązane z promotorem IRF-1 w sposób specyficzny dla IFNγ, zidentyfikowane za pomocą enChIP-SILAC, w Tabeli 2 wymieniono białka wiążące telomery zidentyfikowane za pomocą enChIP w połączeniu ze spektrometrią mas (enChIP-MS), a w Tabeli 3 wymieniono RNA powiązane z telomerami, zidentyfikowane za pomocą enChIP-RNA-Seq.

Schematy oddziaływań genomicznych CRISPR i TAL obrazujące wiązanie białko-DNA oraz metody analizy.
Rysunek 1. Przegląd metody enChIP. Przedstawiono metodę enChIP z wykorzystaniem CRISPR (A, B) oraz TAL (C, D, E). Obszar zainteresowania jest znakowany zmodyfikowanymi cząsteczkami wiążącymi DNA, takimi jak białko TAL lub system CRISPR składający się z katalitycznie nieaktywnej formy Cas9 (dCas) i przewodzącego RNA (gRNA). Oddziaływania molekularne są utrwalane formaldehydem lub innymi czynnikami sieciującymi, jeśli jest to konieczne. Następnie utrwalona chromatyna jest fragmentowana poprzez sonikację lub trawienie enzymatyczne. Znakowane regiony genomiczne są oczyszczane metodą oczyszczania powinowactwa. Na koniec sieciowanie jest odwracane, a oddziałujące cząsteczki (regiony genomiczne, RNA i białka) są identyfikowane za pomocą sekwencjonowania następnej generacji oraz spektrometrii mas. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Sekwencja DNA, edycja genów; nukleotydy oznaczone kolorami; projekt wektora dla eksperymentu CRISPR.
Rysunek 2. Sekwencja gBlock. Przedstawiono promotor U6 (na czarno), nukleotyd G przed sekwencją naprowadzającą (na niebiesko), sekwencję naprowadzającą (spacer gRNA) (na czerwono), sekwencję rusztowania (na zielono) oraz sekwencję terminatora (na pomarańczowo).

Wykres testu ChIP, porównanie %Input, IRF-1, Sox2, telomer, γ-satelita, analiza ekspresji genów.
Rycina 3. Wyniki reprezentatywnych analiz enChIP. (A) Procentowe wartości wejściowe (%input) dla docelowego locus IRF-1 oraz niedocelowego locus Sox2. (B) Procentowe wartości wejściowe dla docelowych telomerów i niedocelowych γ-satelit. Ryciny zostały opracowane i zmodyfikowane na podstawie wcześniejszych publikacji15,16.

KategorieBiałka
TranskrypcjaDDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homolog, PURβ,
aktywowany aktywator transkrypcyjny polimerazy RNA II p15,
BTF3, białko wiążące Myb 1A
Deacetylacja histonów,
komponenty korepresora		RBBP4, PA2G4, TBL3
AcetylotransferazaBiałkowa arginina N-metylotransferaza 1
Topoizomeraza DNATopoizomeraza DNA 2α
HistonyHiston H2A.Z, histon H3.2

Tabela 1: Przykłady białek związanych z regionem promotora ludzkiego genu IRF-1 w sposób specyficzny dla IFNγ, zidentyfikowane za pomocą metody enChIP-SILAC. Tabela została zaadaptowana z wcześniejszej publikacji16.

KategorieBiałka
Ssacze białka wiążące telomeryPML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
Białka wiążące telomery u drożdży
lub innych organizmów		IMP4
Białka oddziałujące z białkami wiążącymi
telomery [powiązane białko wiążące telomery]		DNA polimeraza α (POLA1) [Cdc13p],
ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1],
eksportyna-5 [TERT], GNL3L [TRF1],
eksportyna-1 [TERT], 14-3-3 [TERT]
Białka lokalizujące się w heterochromatynieBEND3
Białka regulujące znaki epigenetyczneKDM5C
Białka, których mutacje wpływają na funkcję telomerówDNA polimeraza α (POLA1), HAT1, Nup133,
CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY,
ligaza glutaminianowo-cysteinowa, glutaredoksyna, SMRC1

Tabela 2: Przykłady białek związanych z telomerami myszy zidentyfikowanych metodą enChIP-MS. Tabela została opracowana na podstawie wcześniejszej publikacji15.

Kategoriecząsteczki RNA
Komponenty telomerazyTerc, Rmrp
RNA telomeroweTERRAs
scaRNAScarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
snoRNA typu H/ACASnora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
snoRNA typu C/DSnord17, Snord15a, Snord118
lncRNANeat1

Tabela 3: Przykłady RNA związanych z telomerami myszy zidentyfikowanych za pomocą enChIP-RNA-Seq. Tabela została opracowana na podstawie wcześniejszej publikacji17.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy oczyszczanie określonych regionów genomu za pomocą zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA, takich jak system CRISPR i białka TAL, oraz identyfikację białek i RNA związanych z tymi regionami genomu. Wiązanie zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA z genomem może wpływać na strukturę chromatyny, w tym pozycjonowanie nukleosomów, i może znosić funkcje genomowe, jak opisano w eksperymentach interferencyjnych CRISPR21. Aby uniknąć tych potencjalnych nieprawidłowych efektów, proponujemy szczegółowe wytyczne dotyczące wyboru docelowych regionów genomu. Po pierwsze, aby uniknąć potencjalnego zahamowania rekrutacji polimeraz RNA i czynników transkrypcyjnych, a także zakłócenia pozycjonowania nukleosomów wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji, regiony docelowe do analiz regionów promotorowych powinny znajdować się kilkaset par zasad przed (5' do) miejsca rozpoczęcia transkrypcji. W przeciwieństwie do tego, podczas analizy regionów genomowych o wyraźnych granicach, takich jak wzmacniacze i tłumiki, regiony genomu, które są bezpośrednio zestawione z tymi regionami, mogą być celowane, ponieważ jest mniej prawdopodobne, że wiązanie zmodyfikowanych cząsteczek wiążących DNA wpłynie na ich funkcje. Ponadto najlepiej jest unikać stosowania regionów docelowych, które są konserwatywne u różnych gatunków, ponieważ ważne cząsteczki wiążące DNA często wiążą się z ewolucyjnie konserwatywnymi regionami, a zahamowanie ich wiązania może zakłócić funkcje docelowych regionów genomu. W związku z tym zawsze konieczne jest sprawdzenie, czy funkcja docelowego regionu genomowego jest zachowana w ustalonych komórkach wykorzystywanych do analiz enChIP. Ponieważ wiele gRNA można łatwo przetestować, a generowanie wielu wersji TAL lub białek palca cynkowego rozpoznających różne docelowe regiony genomu jest żmudne i kosztowne, enChIP przy użyciu CRISPR jest korzystniejsze niż enChIP przy użyciu innych białek.

Wykazano, że dCas9 wiąże się z miejscami poza celem, chociaż powinowactwo do tych miejsc może być słabsze niż do miejsc docelowych22-25. Istnieje kilka sposobów radzenia sobie z zanieczyszczeniem cząsteczek związanych z tymi miejscami poza celem. Po pierwsze, zalecane byłoby użycie kilku, co najmniej dwóch, różnych gRNA. Te cząsteczki powszechnie obserwowane w enChIP przy użyciu odrębnych gRNA byłyby prawdziwie dodatnie. Po drugie, porównanie różnych warunków dla enChIP byłoby skuteczne w eliminowaniu zanieczyszczenia cząsteczkami niespecyficznymi i cząsteczkami związanymi z miejscami niedocelowymi. Przykładami tych zestawów porównawczych mogą być (i) stymulacja (-) i (+) lub (ii) różne typy komórek, takie jak limfocyty T i komórki B. Na koniec należy przeprowadzić analizę ilościową wiązania cząsteczek kandydujących, aby potwierdzić ich specyficzne wiązanie z miejscami docelowymi. Preferowane jest przygotowanie komórek eksprymujących tylko dCas9, ale nie gRNA jako kontrolę negatywną.

Korzystając z analiz enChIP, udało nam się zidentyfikować szereg znanych i nowych cząsteczek oddziałujących z określonymi regionami genomu (tabele 1-3)14-17. Jednak ta technika nie zdołała wykryć niektórych innych znanych białek oddziałujących z tymi regionami. Na przykład, STAT1 podobno wiąże się z promotorem IRF-1 po stymulacji IFNγ8, ale nasza analiza enChIP-SILAC nie wykryła STAT1 jako białka indukowanego do interakcji z tym regionem genomu16. Ponadto w analizie telomerów enChIP-MS nie wykryliśmy białek schronienia składających się z TRF-1 i TRF-215, które, jak wykazano, oddziałują z telomerami26. Istnieje kilka potencjalnych przyczyn tych rozbieżności. Po pierwsze, stechiometria wiązania Stat1 z promotorem IRF-1 może być bardzo niska. Uzasadnione jest, że enChIP-MS, w tym enChIP-SILAC, wykrywa białka, które są bardziej obficie związane z docelowymi regionami genomu; W związku z tym analiza większej liczby komórek może być konieczna do wykrycia tych białek. Zwiększenie czułości instrumentów do leczenia stwardnienia rozsianego przyczyniłoby się również do skutecznego wykrywania białek o niskim stopniu wiązania stechiometrycznego. Po drugie, niektóre białka, w tym Stat1 i shelteryny, mogą być trudnymi celami do analiz w kierunku stwardnienia rozsianego. Po trzecie, w naszej analizie białek wiążących telomery15, białka 3×FLAG-TAL rozpoznające telomery (3×FN-Tel-TAL) mogły blokować wiązanie schronin z telomerami w sposób konkurencyjny.

W przeciwieństwie do względnej trudności w wykrywaniu czynników transkrypcyjnych wiążących się z określonymi regionami genomu za pomocą enChIP, udało nam się zidentyfikować regulatory epigenetyczne, takie jak enzymy modyfikujące histony, za pomocą analiz enChIP. Sukces tej techniki może wynikać z faktu, że regulatory epigenetyczne wiążą się z szerokim zakresem regionów genomu; w związku z tym dla stwardnienia rozsianego dostępnych jest więcej białek na region genomu. Ponieważ epigenetyczne regulatory są coraz częściej uznawane za ważne cele dla leków przeciwko nieuleczalnym chorobom, takim jak rak, enChIP byłby użytecznym narzędziem do identyfikacji epigenetycznych celów leków.

Oświadczenia

Autorzy złożyli wniosek patentowy na enChIP (nazwa patentu: "Metoda izolowania określonych regionów genomu przy użyciu cząsteczek wiążących DNA rozpoznających endogenne sekwencje DNA"; Numer patentu: PCT/JP2013/74107). H.F. jest członkiem Rady Doradczej Addgene.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Takeda Science Foundation (T.F.); Asahi Glass Foundation; Uehara Memorial Foundation (H.F.); Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation (T.F. i H.F.); Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców (B) (#25830131), Grant-in-Assistance for Scientific Research (C) (#15K06895) (T.F.); oraz Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Transcription Cycle" (#25118512 & #15H01354), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (#15H04329), Grant-in-Aid for Exploratory Research (#26650059) oraz "Genome Support" (#221S0002) (H.F.) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Usługa syntezy gBlockLife TechnologiesSynteza genów przez GeneArt
Usługa syntezy gBlockIDT (Integrated DNA Technologies)Fragmenty genów
gBlocks pSIR-neoAddgene51128
pSIR-GFPAddgene51134
pSIR-DsRed-Express2 Addgene51135
pSIR-hCD2Addgene51143
Usługa syntezy TALLife TechnologiesGeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1Addgene47948
3&razy; FLAG-dCas9/pMXs-puroAddgene51240
3 razy; FLAG-dCas9/pMXs-IGAddgene51258
3 razy; FLAG-dCas9/pMXs-I2Addgene51259
3 razy; FLAG-dCas9/pMXs-neoAddgene51260
anti-FLAG M2 AbSigma-AldrichF1804
Sprzężony z FITC anty-FLAG M2Sigma-AldrichF4049
Podłoże DMEM dla SILACLife Technologies89985Inne podłoże można kupić w Life Technologies
Dialyzed FBS dla SILACLife Technologies89986
L-lizyna-2HCl dla SILACLife Technologies89987Dla lekkiego medium
L-arginina-HCl dla SILACLife Technologies89989Dla lekkiego
L-lizyna-2HCl, 13C6 dla SILACLife Technologies89988Dla ciężkiego medium
L-arginina-HCl, 13C6, 15N4 dla SILACLife Technologies89990Dla ciężkiego medium
Kompletny, mini, Diagnostyka Roche bez EDTA4693159
zakłócacz ultradźwiękowy UD-201Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & KoncentratorZymo ResearchD5205
Dynabeads-Protein GLife TechnologiesDB10004
RNasin Plus Inhibitor RNazyPromegaN2611
Isogen IINippon Gene311-07361
Zestaw do miniprepu Direct-zol RNAZymo ResearchR2050
LTQ Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificKomponent systemu nanoLC-MS/MS do analizy MS
nanoLCAdvance, Michrom BioresourcesKomponent systemu nanoLC-MS/MS do analizy MS
Automatyczny podajnik próbek HTC-PALCTC AnalyticsKomponent systemu nanoLC-MS/MS do analizy MS
medium

Bibliografia

  1. Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
  2. Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
  3. Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
  4. Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
  5. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
  6. Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
  7. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  8. Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
  9. Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109(2011).
  10. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
  11. Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273(2013).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26(2014).
  13. Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
  14. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
  15. Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171(2013).
  16. Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084(2014).
  17. Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387(2015).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  20. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
  21. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  22. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
  23. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
  24. Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213(2014).
  25. O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
  26. de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika enChIPizolacja regionu genomicznegokompleks CRISPR-dCas9znakowanie białek TALimmunoprecypitacja chromatynyanaliza spektrometrią masanaliza sekwencjonowania RNAsieciowanie formaldehydemfragmentacja sonikacyjnaimmunoprecypitacja przeciwciałem anty-FLAG
Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.