Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie urządzeń analitycznych do bawełny

DOI:

10.3791/53480

⸱

30 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Department of Ophthalmology, Taichung Veterans General Hospital, 3Department of Engineering and System Science, National Tsing Hua University, 4Institute of Biomedical Engineering, National Tsing Hua University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać proste metody produkcji dla wielu potrzeb testowych, stworzyliśmy system kanałów absorbujących płyny wykonany z materiału bawełnianego. Urządzenie to zostało wykorzystane do stworzenia platformy wielokrotnego wykrywania i rozwiązania problemów związanych z zanieczyszczeniem, które często dotykają urządzenia biomedyczne oparte na przepływie bocznym, do klinicznej analizy moczu azotynów, białka całkowitego i urobilinogenu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solidne, tanie urządzenie analityczne powinno być przyjazne dla użytkownika, szybkie i niedrogie. Takie urządzenia powinny być również w stanie pracować z rzadkimi próbkami i dostarczać informacji na potrzeby dalszego leczenia. W tym miejscu demonstrujemy rozwój urządzenia analitycznego do analizy moczu na bazie bawełny (tj. testów azotynów, białka całkowitego i urobilinogenu), które wykorzystuje format oparty na przepływie bocznym i jest niedrogie, łatwe w produkcji, szybkie i może być używane do przeprowadzania wielu testów bez obaw o zanieczyszczenie krzyżowe. Bawełna składa się z włókien celulozowych o naturalnych właściwościach absorpcyjnych, które można wykorzystać do analizy opartej na przepływie. W tym badaniu opisano prosty, ale elegancki proces wytwarzania naszego urządzenia analitycznego na bazie bawełny. Układ struktury bawełny i podkładki testowej wykorzystuje hydrofobowość i siłę absorpcji każdego materiału. Ze względu na te cechy fizyczne, wyniki kolorymetryczne mogą trwale przylegać do podkładki testowej. Urządzenie to umożliwia lekarzom otrzymywanie informacji klinicznych w odpowiednim czasie i wykazuje ogromny potencjał jako narzędzie wczesnej interwencji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój urządzeń diagnostycznych do diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem (POC), które są przystępne cenowo, solidne i łatwe w użyciu, jest niezbędny dla poprawy globalnego zdrowia1,2. W szczególności urządzenia składające się z substratów celulozowych (np. papieru, nici i bawełny) stanowią obiecujące platformy analityczne do tanich analiz ze względu na ich wszechobecność, przystępność cenową, łatwość obsługi, solidność i zdolność do dostarczania szybkich wyników3-7.

Tutaj prezentujemy rozwój urządzenia analitycznego na bazie bawełny, które wykorzystuje format analizy moczu oparty na przepływie bocznym. To urządzenie analityczne na bazie bawełny zapewnia alternatywne podejście do wykrywania z kilkoma kluczowymi zaletami: i) wytwarzanie przy minimalnym wysiłku człowieka; ii) niski koszt; (iii) zdolność do przeprowadzania wielu różnych testów bez obaw związanych z zanieczyszczeniem krzyżowym; iv) niezależność urządzenia, tj. możliwość pracy bez dodatkowego sprzętu i/lub energii elektrycznej; oraz, v) szybkość (testy kolorymetryczne można wykonać w ciągu 10 minut).

Strukturę tego urządzenia analitycznego na bazie bawełny można podzielić na cztery części: i) bawełna, która jest naturalnie hydrofobowa na swojej zewnętrznej warstwie hydrofobowej; ii) bawełna, która jest wewnętrznie hydrofilowa i służy jako kanał transportowy do odprowadzania wilgoci przez ciecze; (iii) folia do laminowania, która wiąże i kompresuje używaną bawełnę, ale zawiera wywiercone otwory do umieszczenia podkładek reakcyjnych/testowych; oraz iv) podkładki testowe z bibuły chromatograficznej, które są powlekane/zatapiane odczynnikami reaktywnymi, umieszczane na zewnętrznej powierzchni bawełny (w szczególności w przestrzeni wywierconej z folii laminującej) jako obszary reakcji do testów kolorymetrycznych (tj. azotynów, białka całkowitego, pH i testów urobilinogenu) i wyświetlania wyników.

Podstawowy mechanizm testu jest następujący. Urządzenie analityczne na bazie bawełny jest nacinane liniami, które wnikają w połowie głębokości materiału bawełnianego, tworząc kanał przepływowy, który umożliwia płynowi próbki dotarcie do używanych reaktywnych wkładek. Krawędź absorpcyjna urządzenia analitycznego jest zanurzana w próbce docelowej, po czym roztwór jest rozprowadzany wzdłuż kanału płynnego od końca absorpcyjnego do elektrod testowych (rysunek 1). Ponieważ siła absorpcyjna podkładki testowej jest większa niż bawełny, roztwory wchłaniane przez podkładki testowe są mocno zawarte w papierze testowym, dzięki czemu nie dochodzi do ponownego przepływu z powrotem do kanału fluidycznego, a wyniki kolorymetryczne są następnie utrwalane na materiale podkładki testowej. Pod koniec reakcji wyniki kolorymetryczne są rejestrowane za pomocą skanera biurkowego i analizowane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wymagana jest właściwa praktyka higieny laboratoryjnej. Podczas korzystania z tego urządzenia POC wymagane są rękawice i uniwersalne środki ostrożności. Może dojść do zanieczyszczenia wyników lub infekcji, jeśli odpowiednie procedury sterylizacji nie zostaną przeprowadzone prawidłowo.

1. Przygotuj urządzenia z paskami testowymi

  1. Określ hydrofobowość zewnętrznej warstwy bawełny oczyszczającej na podstawie pomiaru kąta zwilżania8 (rysunek 3).
  2. Wykonaj urządzenie analityczne na bazie bawełny, tnąc bawełnę oczyszczającą na kawałki o wymiarach 5,5 cm x 1 cm za pomocą noża do papieru (rysunek 2A).
  3. Wywierć otwory (ø = 0,5 cm) w standardowym arkuszu folii do laminowania w rzędach po trzy; odległość między dwoma kolejnymi otworami wynosi 1 cm.
    UWAGA: Aż 36 pojedynczych pasków testowych z trzema obszarami testowymi każdy może być wykonanych przy użyciu standardowego arkusza folii do laminowania (5,5 cm x 2 cm) (rysunek 2B).
  4. Umieść bawełnę oczyszczającą (charakteryzującą się hydrofobowością zewnętrzną i hydrofilowością wewnętrzną) między dwoma kawałkami folii do laminowania, tj. arkuszem folii do laminowania z wywierconymi otworami po jednej stronie, a nienawierconym arkuszem folii do laminowania (bez otworów) po drugiej stronie. Umieść zespół w laminatorze, aby zapakować urządzenie. Zwiększa to wytrzymałość mechaniczną urządzenia i zapewnia zewnętrzną, nieprzepuszczalną warstwę.
    UWAGA: Średnice otworów po laminowaniu zmniejszą się z 0,5 cm do ~ 0,47 cm. Na obwodzie każdego otworu pozostaną niewielkie szczeliny między bawełną oczyszczającą a folią laminacyjną. Te niewielkie odstępy ułatwiają rozmieszczenie kółek z podkładką testową wykonanych w kolejnym kroku.
  5. Za pomocą nożyczek wyciąć pojedyncze paski testowe o wymiarach 5.5 cm x 1 cm z zespołu, tj. nawiercony arkusz laminacji/wacik/nienawiercony arkusz laminacji "sandwich" (rysunek 2C). Wykonaj łącznie 48 urządzeń, aby utworzyć krzywe standardowe, jak opisano w dalszej części (18 urządzeń do oznaczania azotynów, 15 urządzeń do testu BSA i 15 urządzeń do testu urobilinogenu).
  6. Za pomocą ostrego noża lub brzytwy przeciąć szczelinę (jako mały kanał płynowy) od środka każdego obszaru testowego (niepokrytego folią laminacyjną), w poprzek i przez hydrofobową warstwę obszaru testowego do warstwy hydrofilowej urządzenia podłużnego, uważając, aby przeciąć w połowie głębokości urządzenia warstwowego (rysunek 2D).
  7. Nałożyć papierowe podkładki testowe (ø = 0,5 cm), wsuwając je w szczeliny na obwodzie każdego otworu w laminacji (rysunek 2E).

2. Przygotuj wzorce i roztwory wskaźnikowe do analizy moczu

  1. Przygotować 10,0 mM roztwór podstawowy azotynów, rozpuszczając 69,0 mg azotynu sodu w 100 ml wody dejonizowanej (DI). Rozcieńczyć roztwór podstawowy azotynów w wodzie DI, aby utworzyć serię roztworów wzorcowych o stężeniu azotynów (2,500, 1,250, 625, 312, 156 i 78 μM) (rysunek 4A).
  2. Przygotować 60 μM roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 415 mg BSA w 100 ml roztworu PBS (10 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu; pH 7,0). Rozcieńczyć roztwór podstawowy BSA w wodzie DI, aby utworzyć serię roztworów wzorcowych o stężeniu BSA (30, 15, 7,5, 3,75 i 1,875 μM) (rysunek 4B).
  3. Przygotować roztwór podstawowy urobilinogenu o stężeniu 25 g/l, rozpuszczając 2,5 g urobilinogenu w 100 ml wody dwuskładnikowej. Rozcieńczyć podstawowy roztwór urobilinogenu w wodzie DI, aby utworzyć serię roztworów wzorcowych o stężeniu urobilinogenu (7.8, 15.6, 31.2, 62.5 i 125 mg/l) (ryc. 4C).
  4. Przygotować roztwór wskaźnika azotynowego zawierający 50 mM sulfanilamidu, 330 mM kwasu cytrynowego i 10 mM dichlorowodorku N-(1-naftylo)etylenodiaminy.
  5. Przygotować roztwór wskaźnikowy BSA zawierający 250 mM roztworu buforowego cytrynianu (pH 1,8) i 3,3 mM roztwór błękitu tetrabromofenolowego w 95% etanolu.
  6. Przygotować roztwór wskaźnika urobilinogenu zawierający 0,1 M benzaldehydu 4-dimetyloaminy.

3. Przygotuj podkładki wskaźnikowe

  1. Wyciąć trzy okrągłe podkładki lub krążki (ø = 0,5 cm) z bibuły chromatograficznej i włożyć każdą z nich (po jednej dla każdego testu na pasku z trzema testami) na każdym urządzeniu z paskami testowymi, aby utworzyć krzywą wzorcową roztworu (sekcja 4).
  2. W każdym z trzech otworów folii do laminowania w zespole należy zwrócić uwagę na niewielką szczelinę między folią do laminowania a bawełnianą podkładką testową na samych krawędziach wyciętego otworu. Uwaga, otwór w folii do laminowania ma nieco mniejszą średnicę niż papierowa podkładka testowa.
    UWAGA: Razem te cechy umożliwiają przyłożenie papierowej podkładki testowej do części urządzenia z bawełnianą podkładką testową, tak aby krawędzie papierowej podkładki testowej wsuwały się we wspomnianą wąską szczelinę, tj. pod krawędziami otworu folii do laminowania. Spowoduje to utrzymanie papierowych podkładek testowych na miejscu.
  3. Przygotować część urządzenia do oznaczania azotynów.
    1. Pokryć podkładkę do oznaczania azotynów 4 μl roztworu wskaźnika azotynów (przygotowanego w kroku 2.4) i pozostawić do całkowitego wyschnięcia w temperaturze otoczenia.
  4. Przygotować część urządzenia do wykrywania przeznaczoną do oznaczania całkowitej zawartości białka.
    1. Pokryć podkładkę do oznaczania białka ogółem w 4 μl roztworu wskaźnikowego BSA (przygotowanego w kroku 2.5) i pozostawić do całkowitego wyschnięcia w temperaturze otoczenia.
  5. Przygotować część urządzenia wykrywającego przeznaczoną do oznaczania uroblinogenu.
    1. Pokryć podkładkę do oznaczania uroblinogenu 4 μl wskaźnika uroblinogenu (przygotowanego w kroku 2.6) i pozostawić do całkowitego wyschnięcia w temperaturze otoczenia.

4. Utwórz krzywe standardowe dla urządzenia analitycznego na bazie bawełny

  1. Dla każdego przygotowanego wzorca zanurzyć chłonny koniec przygotowanego urządzenia (wstępnie załadowanego wskaźnikami do oznaczania (patrz sekcja 3.4)) w roztworze wzorcowym na 10 sekund (objętość absorpcji ~ 200 - 300 μl) (Rysunek 2F).
  2. Umieść urządzenie na bazie bawełny w otoczeniu na 10 minut, aby zakończyć reakcje kolorymetryczne (Rysunek 2F). Powtórz każdy eksperyment w trzech powtórzeniach.
  3. Zeskanuj urządzenie, aby przeanalizować zmianę kolorymetryczną zachodzącą na każdej podkładce testowej (rysunek 2G). Umieść powstałe panele testowe na szybie skanera biurkowego i zeskanuj panele testowe w trybie RGB z rozdzielczością obrazu 600 dpi. Zapisz każdy obraz w formacie jpeg.
  4. Przeanalizuj zeskanowany obraz na komputerze za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, aby określić odpowiednią intensywność kolorów (rysunek 2H).
    1. Pobierz oprogramowanie ImageJ pod adresem http://imagej.nih.gov/ij/. Otwórz zeskanowane pliki obrazów. Wybierz Obraz w poleceniach menu i wybierz "Typ", aby przekonwertować obrazy RGB na 8-bitową skalę szarości.
    2. Użyj narzędzia "Owal" na pasku narzędzi, aby wybrać obszar analityczny panelu testowego. Wybierz "Analizuj" w poleceniach menu i wybierz "Zmierz", aby przeanalizować intensywność kolorów. Rejestruj wyniki średniej intensywności.
  5. Ustal krzywe wzorcowe oznaczania azotynów, białka całkowitego i urobilinogenu (rysunek 2I).
    1. Wskaż różne stężenia roztworów azotynów wzorcowych, białka całkowitego i urobilinogenu oraz skorelowane wyniki średniej intensywności w dwuwymiarowym układzie współrzędnych za pomocą oprogramowania statycznego.
    2. Dopasuj krzywą wzorcową dla testu azotynów za pomocą modelu kwadratowego, a krzywe standardowe dla testów białka całkowitego i urobilinogenu za pomocą modeli regresji liniowej.

5. Określ nieznane stężenia próbki na podstawie ustalonych standardowych wartości krzywej

  1. Aby określić stężenia azotynów, białka całkowitego i urobilinogenu w nieznanych roztworach, należy użyć urządzenia zgodnie z opisem do pomiaru stężeń roztworu wzorcowego i zastąpić wyniki zmierzonej intensywności dla testów azotynów, białka całkowitego i urobilinogenu w równaniach modeli wbudowanych w kroku 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się zademonstrować rozwój urządzeń analitycznych na bazie bawełny, używając dostępnych na rynku środków do czyszczenia bawełny, charakteryzujących się właściwościami hydrofilowymi (część wewnętrzna) i hydrofobowymi (część zewnętrzna) (Rysunek 1A). Rysunek 3 przedstawia wyniki pomiaru kąta zwilżania. Hydrofobowa powierzchnia styku bawełny wynosiła 127,35° ± 4,73°. Z perspektywy przyjaznej dla użytkownika, zastosowane tutaj testy kolorymetryczne m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki w tym protokole obejmowały określenie odpowiedniej kombinacji materiału bawełnianego (o różnej hydrofobowości/hydrofilowości) i bibuły filtracyjnej (bibuła filtracyjna do chromatografii lub bibuła filtracyjna do badań ilościowych). Dobrze zaplanowana i wykonana konstrukcja urządzenia zapewnia najlepsze atrybuty wydajności dla testów kolorymetrycznych. Na podstawie wyników naszych testów kolorymetrycznych, przedstawione tutaj urządzenie analityczne na bazie bawełny wykazuje ogromny potencjał jako platforma ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. S.C.L., C.M.K., F.G.T. i C.M.C. są wynalazcami patentu (patent nr: US 8691162 B1) posiadanego przez National Tsing Hua University na podstawie pracy opisanej w tym manuskrypcie. S.C.L., C.M.K., F.G.T. i C.M.C. mają patenty zgłoszone na Tajwanie i w Chinach na podstawie prac opisanych w tym manuskrypcie. M.Y.H. deklaruje, że nie występuje w żadnym potencjalnym konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z tajwańskiego Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)) oraz Szpitala Ogólnego Weteranów w Taichung (TCVGH-1056904C (MYH)).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, USNo. 9048468≥ 99%
azotyny Sigma-Aldrich, USNo. 7632000≥ 99%
urobilinogen Santa Cruz Bio,nr USA SC-296690
cytrynianSigma-Aldrich Nr6132043≥ 99%
błękit tetrabromofenolowySigma-Aldrich Nr4430255≥ 99%
sulfanilamidSigma-Aldrich NrUSA 63741≥ 99%
kwas cytrynowy Sigma-Aldrich U.SNo. 77929≥ 99.5%
  Dichlorowodorek N-(1-naftylo)etylenodiaminySigma-Aldrich Nr1465254≥ 98%
4-(dimetyloamino)benzaldehydAlfaAesar, nr USAA11712≥ 98%
sól sodowa czerwieni metylowejsigma,nr114502≥ 95%
Bromothyle bluesigma,114413≥ 95%
Shiseido Oczyszczanie BawełnaShiseido, Japonianr 79014
bibuła chromatograficznaGE Healthcare Whatman, Springfield Mill, Wielka BrytaniaNr 30306132
folia do laminowaniapodłoża z tworzywa sztucznegoA4216 mm x 303 mm
skanermicrotek scanmaker  Gilotyna do papieru i2400
Życiowa gilotyna do papierunr 306
laminatorAURORA 
folia do laminowaniaUNI LAMI 4A
USA USA USA USA nr , MAS LM4231H

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
  2. Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
  3. Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
  4. Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105(2011).
  5. Lin, S., et al. Cotton-based Diagnostic Devices. Scientific reports. 4, 6976-6976 (2013).
  6. Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
  7. Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
  8. Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
  9. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
  10. Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
  11. Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R. Understanding Urinalysis. medscape. 7 (3), 269-279 (2012).
  12. Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
  13. Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
  14. Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
  15. Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cotton Analytical DeviceLateral Flow AssayContact Angle MeasurementLamination Film PackagingChromatography Paper DiscsColorimetric Reaction AnalysisImageJ SoftwareLimit Of DetectionUrinalysis Strip FabricationHydrophobic Interface Testing

Powiązane artykuły