Method Article

Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy dwie uzupełniające się metody wykorzystujące wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) oraz analizę obrazu lub cytometrię przepływową do identyfikacji i izolacji komórek w wewnętrznych obszarach zatrzymanych G1 i zewnętrznych proliferujących sferoidach 3D.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) sferoidy guza są wykorzystywane w badaniach nad rakiem jako dokładniejszy model mikrośrodowiska guza in vivo, w porównaniu do tradycyjnej dwuwymiarowej (2D) hodowli komórek. Model sferoidalny jest w stanie naśladować skutki interakcji komórka-komórka, niedotlenienie i deprywacja składników odżywczych oraz przenikanie leków. Jedną z cech charakterystycznych tego modelu jest rozwój nekrotycznego rdzenia, otoczonego pierścieniem zatrzymanych komórek G1, z proliferującymi komórkami na zewnętrznych warstwach sferoidy. Interesujące w dziedzinie nowotworów jest to, w jaki sposób różne regiony sferoidy reagują na terapie lekowe, a także manipulacje genetyczne lub środowiskowe. Opisujemy tutaj zastosowanie systemu wskaźnika cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) wraz z cytometrią i analizą obrazu przy użyciu komercyjnego oprogramowania do scharakteryzowania stanu cyklu komórkowego komórek w odniesieniu do ich położenia wewnątrz sferoid czerniaka. Metody te mogą być stosowane do śledzenia zmian w statusie cyklu komórkowego, ekspresji genów/białek lub żywotności komórek w różnych podregionach sferoid nowotworowych w czasie i w różnych warunkach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielokomórkowe sferoidy 3D są znane jako modele nowotworów od dziesięcioleci, jednak dopiero niedawno stały się bardziej powszechne jako model in vitro dla wielu nowotworów litych. Są one coraz częściej stosowane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych odkrywania leków jako rozwiązanie pośrednie między złożonymi, drogimi i czasochłonnymi modelami in vivo a prostym, tanim monowarstwowym modelem 2D 1-6. Badania nad kulturą 2D często nie są możliwe do powtórzenia in vivo. Modele sferoidalne wielu typów nowotworów są w stanie naśladować charakterystykę wzrostu, wrażliwość na leki, penetrację leków, interakcje komórka-komórka, ograniczoną dostępność tlenu i składników odżywczych oraz rozwój martwicy, która jest obserwowana in vivo w guzach litych 6-11. Sferoidy rozwijają nekrotyczne jądro, spoczynkowy lub zatrzymany G1 obszar otaczający jądro i proliferujące komórki na obrzeżach sferoidy 7. Rozwój tych regionów może się różnić w zależności od gęstości komórek, tempa proliferacji i wielkości sferoidy 12. Postawiono hipotezę, że heterogeniczność komórkowa obserwowana w tych różnych podregionach może przyczyniać się do oporności na terapię nowotworową 13,14. Dlatego możliwość oddzielnej analizy komórek w tych regionach ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia odpowiedzi na leki nowotworowe.

System wskaźnika cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) opiera się na czerwonym (Kusabira Orange - KO) i zielonym (Azami Green - AG) fluorescencyjnym znakowaniu Cdt1 i gemininy, które są degradowane w różnych fazach cyklu komórkowego 15. W ten sposób jądra komórkowe są czerwone w G1, żółte we wczesnej fazie S i zielone w fazie S/G2/M. Opisujemy tutaj dwie uzupełniające się metody, zarówno wykorzystujące FUCCI do identyfikacji cyklu komórkowego, jak i użycie oprogramowania do obrazowania lub testu cytometrii przepływowej dyfuzji barwnika w celu określenia, czy komórki znajdują się w centrum zatrzymanym G1, czy w zewnętrznym pierścieniu proliferacyjnym, oraz odległości poszczególnych komórek od krawędzi sferoidy. Metody te zostały opracowane w naszej poprzedniej publikacji, w której wykazaliśmy, że komórki czerniaka w niedotlenionych regionach w środku sferoidy i/lub w obecności terapii celowanych są w stanie pozostać w zatrzymaniu G1 przez dłuższy czas i mogą ponownie wejść w cykl komórkowy, gdy pojawią się bardziej sprzyjające warunki 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transdukcja FUCCI i hodowla komórkowa

  1. Przekładnia FUCCI
    1. Stwórz linie komórkowe stabilnie eksprymujące konstrukty FUCCI mKO2-hCdt1 (30-120) i mAG-hGem (1-100) 15 za pomocą kotransdukcji lentiwirusa, jak opisano wcześniej 7.
      Uwaga: System FUCCI jest już dostępny w sprzedaży.
    2. Generuj podklony z jasną fluorescencją przez sortowanie pojedynczych komórek. Sortuj pojedyncze komórki dodatnie zarówno dla AG, jak i KO (żółty) przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją na 96-dołkowej płytce, jak opisano wcześniej 7,16.
  2. Posiewy komórkowe czerniaka
    1. Hodowla ludzkich komórek czerniaka C8161, jak opisano wcześniej, 7,17.

2. 3D Formacja sferoidalna (jak wcześniej opisano 3,9)

  1. Przygotowanie płytki agarozowej
    1. Rozpuść 1,5% agarozy (lub szlachetnego agaru) w 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), gotując w kuchence mikrofalowej przez 3-5 minut z wirowaniem. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona.
    2. Natychmiast dozować 100 μl roztworu agarozy na studzienkę do płaskodennej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej za pomocą pipety wielokanałowej.
      Uwaga: Agaroza może zastygnąć w końcówkach po krótkim czasie, aby przezwyciężyć ten problem, końcówki należy wymieniać między płytkami, jeśli robisz więcej niż jedną płytkę agarozową.
    3. Pozostaw 96-dołkową płytkę na płaskiej powierzchni do stwardnienia agarozy przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Przygotowanie komórek i nakładanie na agarozę
    1. Hoduj komórki do około 80% zbiegu w kolbie T75. Umyć 10 ml HBSS.
    2. Odłączyć komórki za pomocą 1,5 ml 0,05% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i ponownie zawiesić w 10 ml normalnej pożywki.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru 18 lub innej automatycznej metody liczenia.
    4. Zawiesić komórki do końcowego stężenia 25 000 komórek/ml w normalnym podłożu.
    5. Załóż studzienki agarozowe na 200 μl zawiesiny komórek, aby uzyskać ostateczną liczbę 5 000 komórek na studzienkę.
    6. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych (5% CO2 i 37 °C) w celu utworzenia sferoid przez około 3 dni.
      Uwaga: Czas potrzebny do uformowania sferoidy różni się w zależności od różnych linii komórkowych. Niektóre linie komórkowe w ogóle nie tworzą sferoid przy użyciu tej metody.
    7. Obraz morfologii sferoidalnej za pomocą mikroskopu odwróconego przy użyciu obiektywu 4X i filtra kontrastu fazowego. Linia komórkowa, która z powodzeniem tworzy sferoidy, wytwarza zwarte, z grubsza kuliste agregaty komórek, a na studzienkę powinna przypadać tylko jedna sferoida.
      Uwaga: Opcjonalnie: Po uformowaniu się sferoid można je przesadzić do kolagenu lub innej matrycy w celu dalszej analizy wzrostu i inwazji 3,7,17. Aby usunąć sferoidy z kolagenu, należy potraktować 500 μl kolagenazy 2 mg/ml w temperaturze 37 °C, aż kolagen rozpuści się na tyle, aby sferoidy mogły uwolnić się do podłoża (około 30 min). Delikatnie usuń sferoidy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    8. Do cięcia/obrazowania utrwal sferoidy (wyizolowane z kolagenu lub hodowane przez 3-5 dni na agarozie) w 10% neutralnej buforowanej formalinie (UWAGA: formalinę należy stosować w dygestorium) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C. Sferoidy mogą być przechowywane w HBSS w temperaturze 4 °C przez kilka dni.

3. Sekcja wibratomu sferoidalnego

  1. Rozpuścić 5 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml HBSS w szklanej butelce o pojemności 500 ml w kuchence mikrofalowej. Użyj średniego ustawienia ognia z wirowaniem. UWAGA: Podczas gotowania roztworu należy trzymać pokrywkę luźną, aby można było zwolnić ciśnienie. Używaj rękawic ochronnych żaroodpornych, aby chronić dłonie przed oparzeniami podczas obchodzenia się z gorącą szklaną butelką.
  2. Poczekaj, aż agaroza lekko ostygnie – tak, aby można było dotknąć butelki bez poparzenia rąk.
  3. Wlej około 2 ml agarozy na dno kubka z ladą Coulter lub podobnej plastikowej formy. Natychmiast odessać utrwaloną sferoidę (patrz sekcja 2.2.8) za pomocą pipety o pojemności 1 ml w możliwie najmniejszej objętości płynu. Dodaj sferoidę do agarozy. Na filiżankę można dodać kilka sferoid (do 10).
  4. Przykryj sferoidy 2 ml więcej agarozy. Zrób to szybko, aby uniknąć stwardnienia agarozy przed dodaniem drugiej warstwy.
  5. Pozwól agarozie stwardnieć w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej 3 godziny. Na tym etapie kubki mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 °C z nałożonymi 2-3 ml HBSS, aby zapobiec odwodnieniu.
  6. Usuń agarozę z filiżanki. Przytnij agarozę zawierającą sferoidy tak, aby pasowała do metalowego bloku wibratomu, a sferoidy znajdowały się blisko górnej części agarozy. Sferoidy mogą być widziane jako małe białe obiekty wewnątrz agarozy. Super przyklej agarozę do bloku.  
  7. Napełnij wibratomat wodą destylowaną i zamontuj blok w wibratomie. Ustaw wibratom tak, aby cięł odcinki 100 μm przy użyciu niskiej prędkości (ustawienie 2) i wysokich wibracji (ustawienie 8). Ustaw kąt ostrza tnącego na 16°. Włącz wibratom, włącz światło wibratomu i tnij sekcje od góry agarozy, aż zostaną wycięte sekcje sferoidalne 100 μm. Umieść pocięte skrawki sferoidów w HBSS na 24-dołkowej płytce.
  8. Wybierz środkowe sekcje do analizy obrazu. Zamontuj sekcje na szkiełkach, przenosząc sekcję płasko na szkiełko za pomocą pęsety. Napełnij 10 ml cylindra strzykawki smarem próżniowym; Dodaj cienką linię smaru próżniowego wokół krawędzi sekcji, aby zapobiec spływaniu mediów montażowych z krawędzi szkiełka i pomóc uszczelnić sekcję pod szkiełkiem nakrywkowym. Przykryj sekcję medium montażowym i szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Preparaty należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem.

4. Akwizycja obrazu konfokalnego

  1. Zrób zdjęcie z przekrojem środkowego przekroju sferoidalnego FUCCI za pomocą obiektywu 10X lub 20X, jak opisano wcześniej 7. Upewnij się, że nie ma nakładania się ani przesłuchów między Kusabira Orange2 i Azami Green. Porównując analizę obrazu między wieloma sekcjami sferoidowymi, utrzymuj moc lasera i inne ustawienia takie same między próbkami.

5. Test dyfuzji barwnika Hoechst do sortowania przepływowego

  1. Przenieść żywe sferoidy (3-5 dni po wysiewie agarozy) do probówki o pojemności 15 ml. Niech sferoidy grawitacyjnie osiądą na dnie rury. W jednej probówce można zabarwić kilka sferoid. Około 20 sferoid jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej liczby komórek do cytometrii przepływowej.
  2. Usunąć nadmiar pożywki i dodać 1 ml 10 μM Hoechst rozcieńczonego w normalnym podłożu. Inkubować sferoidy w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę. Użyj delikatnego przesuwania, aby ponownie zawiesić sferoidy raz lub dwa razy podczas inkubacji.
    Uwaga: Czas inkubacji może być zróżnicowany w celu zmiany stopnia wnikania barwnika Hoechst w sferoidy. Będzie się to różnić w zależności od wielkości sferoidy, gęstości i linii komórkowej. W przypadku niektórych dużych/gęstych sferoid maksymalna penetracja barwnika może być mniejsza niż 100%.
  3. Delikatnie umyć sferoidy 5 ml HBSS za pomocą osadzania grawitacyjnego.
    1. Opcjonalnie: Do obrazowania penetracji barwnika: Utrwalić sferoidy za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny przez co najmniej 2 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C. Przygotować skrawki wibratomiczne, zamontować na szkiełkach i obraz na konfokalnym, jak opisano w krokach 3 i 4 powyżej.
  4. Aby przygotować komórki do cytometrii przepływowej, trypsynizuj sferoidy 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez około 30 minut z trzepaniem co 10 minut w celu rozdzielenia sferoid.
    Uwaga: Sferoidy są trudne do dostania się do zawiesiny pojedynczej komórki, warunki mogą wymagać optymalizacji. Żywotność 4-dniowych sferoid C8161 po tym procesie wynosi około 95%.
  5. Barwić ogniwa żywą/martwą plamą w bliskiej podczerwieni zgodnie z protokołem producenta. Przemyć HBSS, a następnie utrwalić 1 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny przez około 30 minut. Komórki mogą być przechowywane w HBSS w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed analizą przepływu.

6. Analiza cytometrii przepływowej sferoid FUCCI barwionych metodą Hoechst

  1. Upewnij się, że komórki nie są zlepione ze sobą, przepuszczając je przez sitko do komórek. Ponownie zawiesić barwione sferoidy FUCCI Hoechst w lodowatym płuczeniu FACS (PBS z 5% płodową surowicą cielęcą) o stężeniu 1-5 x 106 komórek/ml. Przenieść 200 μl próbki do probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml.
  2. Przygotować następujące jednobarwne próbki kontrolne, jak opisano w ppkt 6.1: niebarwione komórki czerniaka; przylegające komórki czerniaka barwione 10 μM Hoechst przez 1 godzinę; Azami Green wyraża tylko komórki czerniaka; i Kusabira Orange tylko z ekspresją komórek czerniaka.
    Uwaga: Jednokolorowe wzorce mogą być utrwalone w formalinie i przechowywane w praniu FACS z 0,1% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C przez tygodnie, a nawet miesiące.
  3. Przeprowadzić zawiesiny pojedynczych komórek na analizatorze cytometrii przepływowej z odpowiednimi laserami i jednokolorowymi/niebarwionymi kontrolami, jak opisano wcześniej 7,16.
  4. Użyj komercyjnego oprogramowania do cytometrii, takiego jak FlowJo, aby przeanalizować wewnętrzne i zewnętrzne komórki sferoidalne w następujący sposób:
    1. Usuń zanieczyszczenia, bramkując główną populację komórek w trybie światła rozproszonego do przodu (FSC) i światła rozproszonego po stronie (SSC).
    2. Usuń dublety, bramkując na pojedynczych komórkach za pomocą FSC (obszar) i FSC (wysokość)
    3. Brama dla żywych komórek poprzez bramkowanie na żywej/martwej niskiej populacji.
    4. Zdefiniuj wysokie komórki Hoechsta, bramkowane na podstawie pozytywnego sygnału z przylegających komórek barwionych Hoechstem, jako komórki "zewnętrzne".
    5. Zdefiniuj niskie lub ujemne komórki Hoechst, bramkowane na podstawie sygnału z niebarwionej kontroli, jako komórki "wewnętrzne".
    6. Po bramkowaniu dla populacji wewnętrznej i zewnętrznej, komórki mogą być dalej bramkowane dla koloru czerwonego FUCCI (G1), żółtego (wczesne S), zielonego (S / G2 / M) lub ujemnego (wczesny G1).
      Uwaga: Kompensacja przy użyciu jednokolorowych elementów sterujących może być wymagana do prawidłowego zdefiniowania populacji czerwonej, żółtej, zielonej i negatywnej FUCCI.
  5. Po zoptymalizowaniu testu i walidacji penetracji Hoechsta za pomocą mikroskopii konfokalnej, należy uruchomić komórki bez utrwalania na przepływowym sortowniku komórek, jak opisano wcześniej 7,16 w celu dalszej analizy subpopulacji żywych komórek.

7. Analiza obrazu przekrojów sferoidalnych FUCCI

  1. Otwarte oprogramowanie, np. Volocity, wybierz konfigurację Quantitation ONLY.
  2. Utwórz nową bibliotekę. Zaimportuj plik obrazu konfokalnego sferoidalnego FUCCI do oprogramowania, przeciągając plik surowych danych z konfokalnego obrazu do biblioteki. Można też użyć polecenia Plik >Importuj.
  3. Przejdź do zakładki pomiary, aby zbudować protokół analizy obrazu. Protokół jest tworzony przez przeciągnięcie i upuszczenie odpowiednich poleceń w odpowiedniej kolejności, jak w oknie protokołu.
  4. Znajdź obiekty w zielonym kanale: Przeciągnij polecenie znajdź obiekty (znalezione w 'Znajdowanie') do okna protokołu, wybierz właściwy kanał w protokole znajdź obiekty. Dodaj polecenie otwarcia (znajdujące się w 'Przetwarzaniu'), a następnie oddzielne polecenie dotykania obiektów (znajdujące się w 'Przetwarzaniu' - spowoduje to rozdzielenie komórek). Wyklucz obiekty według rozmiaru <50 μm (znajduje się w 'Filtrowaniu' - spowoduje to wykluczenie małych obiektów niekomórkowych).
    Uwaga: Zmienne, takie jak próg znajdowania obiektów, liczba otwartych iteracji, rozmiar obiektów do rozdzielenia i rozmiar obiektów do wykluczenia, muszą być ręcznie zoptymalizowane, aż maski obiektów będą pasować do obrazu.
  5. Znajdź obiekty w czerwonym kanale: Powtórz wyszukiwanie obiektów jak powyżej dla czerwonego kanału. Protokoły zielony i czerwony mogą wymagać osobnej regulacji.
    Uwaga: Ze względu na to, że jądra znajdują się w G2, zielone jądra są często nieco większe.
  6. Upewnij się, że znalezione obiekty są dokładne: Upewnij się, że czerwone i zielone obiekty pasują do czerwonych i zielonych jąder na obrazie, wyłączając i włączając kanały zielony i czerwony (za pomocą polecenia ukryj lub pokaż kanał) podczas wyświetlania czerwonych i zielonych masek znalezionych przez protokół. Opcje sprzężenia zwrotnego (Pomiary >Opcje informacji zwrotnej) mogą być używane do modyfikowania wyglądu masek obiektów.
  7. Znajdź żółte obiekty (wczesne komórki fazy S): Aby znaleźć żółte komórki, dodaj polecenie przecięcia czerwonego z zielonymi komórkami (znajduje się w "Łączeniu"). Wyklucz obiekty według rozmiaru (<50 μm, znalezione w 'Filtrowaniu'), aby wykluczyć wszelkie małe obiekty niekomórkowe.
  8. Znajdź wyłącznie czerwone obiekty (komórki fazy G1): Aby znaleźć wyłącznie czerwone jądra, odejmij żółte krwinki od czerwonych krwinek (znalezione w 'Łączeniu'). Wyklucz obiekty według rozmiaru <50 μm (znajduje się w 'Filtrowaniu'), aby usunąć wszelkie małe obiekty niekomórkowe utworzone
    9. .
  9. Znajdź wyłącznie zielone obiekty (komórki fazowe S/G2/M): Powtórz dla kanału zielonego, aby znaleźć wyłącznie zielony.
    Uwaga: Jeśli nadal pozostają obiekty niekomórkowe, do protokołu Wyłączny zielony lub Wyłączny czerwony (znajdujący się w 'Filtrowaniu') można dodać polecenie filtrowania populacji, aby zachować tylko obiekty o współczynniku kształtu większym niż 0,25. Spowoduje to usunięcie obiektów nieokrągłych.
  10. Znajdź kontur sferoidy: Znajdź kontur sferoidy za pomocą polecenia znajdź obiekty (znajdującego się w 'Znajdowaniu') z zielonym lub czerwonym kanałem (w zależności od tego, który z nich ma więcej komórek wokół krawędzi sferoidy). Do znalezienia konturu sferoidy trzeba będzie użyć znacznie niższego progu (znajdującego się w zmiennych find objects) w porównaniu z pojedynczymi komórkami.
    1. Użyj polecenia close, aby połączyć obiekty (znalezionego w 'Processing'), następnie wypełnij w obiektach (znalezionego w 'Processing'), a następnie użyj dokładnego filtra (znajdującego się w 'Filtrowaniu'), aby usunąć szum z obiektów. Na koniec wyklucz obiekty według rozmiaru, aby usunąć mniejsze obiekty <30 000 μm (w zależności od rozmiaru sferoidy).
      Uwaga: Ten protokół będzie musiał zostać zoptymalizowany ręcznie, aż kontur sferoidy będzie dokładny. Można również użyć obrazu w jasnym polu - jednak jest to zwykle mniej dokładne w przypadku przekroju sferoidalnego i konieczne będzie użycie polecenia odwrócenia (znajdującego się w 'Łączeniu').
  11. Zmierz odległości jąder od konturu sferoidy: Zmierz odległości (znalezione w "Relacja") od żółtych, wyłącznie zielonych i wyłącznie czerwonych populacji od środka ciężkości komórki do krawędzi konturu sferoidy. Aby zobrazować minimalne odległości, które powinny znajdować się od komórki do najbliższej krawędzi sferoidy, włącz opcję pokaż odległości na karcie relacji w opcjach informacji zwrotnej (Pomiary >Opcje informacji zwrotnej >Relacje).
  12. Zapisz protokół. Protokół ten można ponownie zastosować do innych obrazów za pomocą polecenia Measurements >Restore protocol.
  13. Utwórz element pomiaru (Pomiary >Utwórz element pomiaru). Dane mogą być analizowane za pomocą funkcji analizy.
    1. Przejdź do zakładki analiza w pozycji pomiary. Przejdź do menu Analiza (Analiza >Analizuj) i przeanalizuj minimalną odległość od środka ciężkości komórki (czerwonej, zielonej lub żółtej) do krawędzi sferoidalnej, podsumowaną według liczby i uporządkowaną według populacji.
    2. Aby policzyć liczbę komórek znajdujących się w określonej odległości od krawędzi, utwórz filtr (Analiza >Filtr). Filtr minimalnej odległości na rysunku 2 opiera się na penetracji Hoechst (np. minimalna odległość jest mniejsza niż 80 daje populację "zewnętrzną"). Możesz też wyeksportować nieprzetworzone dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka metod wytwarzania sferoid nowotworowych, ten protokół wykorzystuje metodę wzrostu nieprzylegającego, gdzie komórki są hodowane na agarze lub agarozie 3,7,9. Rycina 1 przedstawia przykład sferoidy czerniaka C8161 po 3 dniach na agarze. Sferoidy C8161 po 3 dniach tworzą sferoidy o regularnych rozmiarach i średnicy 500 - 600 μm (średnia = 565, SD = 19, n = 3). Inne linie komórkowe czerniaka, które będą tworzyć sferoidy to: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (sferoidy utworzone z ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Półautomatyczna analiza obrazu pozwoliła zidentyfikować sferoidalny wewnętrzny obszar zatrzymany G1 i proliferujące warstwy zewnętrzne. Metoda ta może być stosowana na żywych sferoidach przy użyciu przekroju optycznego lub w stałych przekrojach sferoidalnych, w celu identyfikacji zmian nie tylko w cyklu komórkowym, ale także w ekspresji markerów (poprzez immunofluorescencję), śmierci komórki lub morfologii komórki w tych różnych regionach. Ruchliwość komórek w różnych regionach sferoidalnych można również określić ilości...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PerkinElmer partycypował w kosztach publikacji.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Pani Danae Sharp i Pani Sheenie Daignault za pomoc techniczną. Dziękujemy dr Atsushi Miyawaki, RIKEN, miasto Wako, Japonia, za dostarczenie konstruktów FUCCI, dr Meenhardowi Herlynowi i Pani Patricii Brafford z Instytutu Wistar, Filadelfia, za dostarczenie linii komórkowych, Zakładowi Obrazowania i Cytometrii Przepływowej w Instytucie Stulecia za wyjątkowe wsparcie techniczne. Dziękujemy Panu Chrisowi Johnsonowi i dr Andrew Barlowowi za wsparcie techniczne oprogramowania Volocity. N.K.H. jest stypendystką Cameron w Instytucie Badań nad Czerniakiem i Rakiem Skóry w Australii. K.A.B. jest członkiem Instytutu Raka w Nowej Południowej Walii (13/ECF/1-39). W.W. jest członkiem Instytutu Raka w Nowej Południowej Walii (11/CDF/3-39). Prace te były wspierane przez granty projektowe RG 09-08 i RG 13-06 (Rada ds. Raka Nowej Południowej Walii), 570778 i 1051996 (Priority-driven Collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales) oraz APP1003637 i APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
agaroza o niskiej temperaturze topnieniaLife Technologies16520-050Do krojenia
agaru szlachetnego SigmaA5431Do wytwarzania sferoid
agaroza do sferoidFisher ScientificBP1356-100Do wytwarzania sferoid
0,05% trypsyna/EDTALife Technologies25300-054
HBSSLife Technologies14175-103
10% formalinaSigmaHT5014-1CSUWAGA: Szkodliwe,. Używaj środków ochrony osobistej, nie   nie wdychać oparów (otwarte w dygestorium).
żywy/martwy w pobliżu IRLife TechnologiesL10119
wibratomProdukty techniczne International, Inc
kubek coultureThermo-Fisher ScientificSIE936Forma do cięcia sferoid
hemocytometrSigmaZ359629
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowejInvitroFAL353072
kolagenazaSigmaC5138 
mikroskop konfokalnyLeicaTCS SP5
Analizator cytometru przepływowegoBecton DickinsonLSRFortessa
volocityPerkinElmerOprogramowanie do obrazowania
flowjoTree StarOprogramowanie do cytometrii przepływowej
Smar próżniowySigmaZ273554
Media montażoweWektor LaboratoriaH1000
FUCCI (konstrukcje komercyjne)Life TechnologiesP36238Tylko transfekcja przejściowa
Sitko do komórek 70 μ mIn VitroFAL352350
Probówki 5 ml z okrągłym dnem (sterylne)In VitroFAL352003
Probówki z okrągłym dnem 5 ml (niesterylne)Probówki 5 ml in vitro (sterylne)In VitroFAL352008

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
  4. Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
  5. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
  8. Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
  9. Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
  10. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  11. Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
  12. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  13. Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
  14. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
  15. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  17. Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
  18. Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
  19. Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
  20. Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22(2011).
  21. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
  22. Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
  23. Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73(2013).
  24. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
  25. Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
  26. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  27. Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

Related Articles