Operacyjne wewnątrz-/zewnątrzwymiarowe zadanie zmiany ustawień dla myszy

Podsumowanie

Zaburzenia poznawcze związane z uwagą są podstawową cechą wielu chorób psychicznych. W tym miejscu przedstawiamy opracowanie nowatorskiego automatycznego systemu do skutecznego badania zdolności zmiany ustawień uwagi, funkcji wykonawczych i innych zdolności poznawczych u myszy o wysokiej trafności translacyjnej do badań na ludziach.

Streszczenie

Zmiany w kontroli wykonawczej i elastyczności poznawczej, takie jak zdolność do zmiany nastawienia uwagi, są podstawowymi cechami kilku chorób neuropsychiatrycznych. Najczęściej stosowanymi testami neuropsychologicznymi do oceny zmiany ustawień uwagi u ludzi są Wisconsin Card Sorting Test (WCST) oraz CANTAB Intra-/Extra-dimensional set shift task (ID / ED). Zadania te dowiodły znaczenia klinicznego i zostały zmodyfikowane i z powodzeniem zaadaptowane do badań na modelach zwierzęcych. Jednak obecnie dostępne zadania dla gryzoni mają kilka ograniczeń, głównie ze względu na ich ręczne procedury testowe, które hamują postęp translacyjny w medycynie psychiatrycznej. Aby przezwyciężyć te ograniczenia i lepiej naśladować oryginalną wersję u naczelnych, przedstawiamy opracowanie nowatorskiego, opartego na instrumentach dwukomorowego zadania "Operon" ID/ED dla gryzoni. Wykazaliśmy skuteczność tego nowatorskiego zadania w mierzeniu różnych aspektów elastyczności poznawczej u myszy, w tym tworzenia i zmiany zestawu uwagi oraz uczenia się odwróconego. Co więcej, pokazujemy wysoką elastyczność tego zadania, w którym można manipulować trzema różnymi wymiarami percepcyjnymi za pomocą dużej liczby bodźców dla każdego wymiaru. To nowatorskie zadanie ID/ED Operon może być skutecznym narzędziem przedklinicznym do testowania leków i/lub dużych genetycznych badań przesiewowych istotnych dla badania dysfunkcji wykonawczych i objawów poznawczych występujących w zaburzeniach psychicznych.

Wprowadzenie

Zmiana nastawienia uwagi jest miarą elastyczności poznawczej i funkcji wykonawczych¹. Odnosi się do zdolności do przełączania się między arbitralnymi regułami wewnętrznymi ("zestawy poznawczo-uważne"). Najpowszechniej stosowanymi zadaniami neuropsychologicznymi do pomiaru zmiany ustawień uwagi i elastyczności poznawczej u ludzi są Test Sortowania Kart Wisconsin (WCST)² oraz nowsza i bardziej wyrafinowana wersja: wewnątrz- i pozawymiarowa zmiana zestawu uwagi (ID/ED) w Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB)^3,4. Zadania te zostały wykorzystane do zidentyfikowania określonych nieprawidłowości poznawczych w szerokim zakresie zaburzeń psychicznych, w tym autyzmu⁵, schizofrenii⁶, choroby Parkinsona⁷, zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych⁸ i zaburzeń z deficytem uwagi/nadpobudliwości⁹. Znaczenie kliniczne i solidne podejście metodologiczne WCST i testów ID/ED wzbudziły zainteresowanie wdrożeniem podobnych testów w badaniach przedklinicznych^10,11. Zadania te pozwalają na selektywny pomiar w obrębie tego samego przedmiotu różnych zdolności poznawczych, takich jak uczenie się dyskryminacyjne, uczenie się odwrócone, tworzenie zestawu uwagi, przesunięcie uwagi w tym samym wymiarze (tj. przesunięcie wewnątrzwymiarowe: IDS) i między różnymi wymiarami percepcyjnymi (tj. przesunięcie pozawymiarowe: EDS). Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ odrębne obwody mózgowe, a także neuropatologia mogą zmieniać te różne funkcje poznawcze na różne sposoby. Na przykład, wykazano efekt podwójnej dysocjacji lub specjalizacji funkcjonalnej między bocznymi (u małp i ludzi) / przyśrodkowym (u gryzoni) a orbitalnym regionem PFC w zadaniach zmiany nastawienia uwagi. Podczas gdy kora oczodołowo-czołowa jest bardziej zaangażowana w fazy odwrócenia tych zadań, boczny/przyśrodkowy obszar PFC rządzi etapami przesunięcia pozawymiarowego^12-14.

Gryzonie te testy koncentracji uwagi dla naczelnych zostały pomyślnie wygenerowane^13-16. Jednak niektóre aspekty tych wersji gryzoni ograniczają ich zastosowanie i zastosowanie. Na przykład zadania te są uruchamiane ręcznie, a zatem są bardzo pracochłonne i trudne do standaryzacji. Co więcej, obecność wzmacniaczy pokarmowych wewnątrz bodźców może skutkować niejednoznaczną interpretacją reakcji zwierząt i potencjalną stronniczością w podejmowaniu wyborów¹⁰. Cechy te ograniczyły przepustowość testów i, co ważniejsze, ich zastosowanie w badaniach genetycznych i/lub przesiewowych leków na dużą skalę.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia i zwiększyć potencjalne zastosowania paradygmatów zmiany ID/ED u gryzoni, prezentujemy tutaj nowatorskie dwukomorowe zadanie oparte na instrumentach, aby przetestować elastyczność poznawczą u myszy. To nowatorskie zadanie ściśle naśladuje zadanie ID/ED stosowane u naczelnych u ludzi i innych niż ludzie i omija problemy związane z wcześniejszymi wersjami gryzoni.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia oraz lokalny Komitet ds. Wykorzystania Zwierząt i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych zawartymi w dyrektywach Rady Wspólnoty Europejskiej.

Uwaga: Rysunek 6 przedstawia harmonogram całej procedury protokołu testowania zadania ID/ED.

1. Aparatura

Rycina 1. Dwuizbowy aparat „ Operon ”. (A) Widok z góry całego aparatu oraz (B) widok z przodu pojedynczej izby, odwzorowujący perspektywę myszy podczas testu. 1: bodźce wizualne (diody LED); 2: dozownik pokarmu; 3: otwór do wkładania nosa; 4: bodziec dotykowy (tekstura); 5: bodziec węchowy; 6: automatyczne drzwi przesuwne; 7: światło w izbie; 8: podczerwona wiązka fotonowa do sterowania drzwiami. Izby (16 x 16 x 16 cm³) są oddzielone przez przezroczyste plastikowe drzwi (6). Podczerwone wiązki fotonowe (8) śledziły ruchy zwierzęcia i sterowały otwieraniem/zamykaniem automatycznych drzwi, umożliwiając myszy zmianę izby. Każda izba posiada dwa otwory do wkładania nosa (3) z podczerwonymi wiązkami fotonowymi, a pomiędzy nimi dozownik pokarmu (2) z wiązkami fotonowymi, do którego dozownik peletu dostarczał wzmocnienie pokarmowe. Światło w izbie (7) znajduje się nad każdym z dwóch dozowników pokarmu. Każdy otwór do wkładania nosa jest wyposażony w szereg wymiennych bodźców, które mogły różnić się w trzech różnych wymiarach percepcyjnych (zapach, widok, dotyk). Pierwotnie opublikowano w „The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice”¹⁹. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Uwaga: Aparatura Operon (Rysunek 1) składa się z dwóch identycznych komór z pleksiglasowymi ściankami i aluminiową podłogą (16 x 16 x 16 cm³ dla każdej komory). Komory są oddzielone przezroczystymi drzwiami dzielącymi z pleksiglasu, które mogą być sterowane automatycznie, aby umożliwić myszy dostęp do dowolnej z komór. Każda komora posiada dwa otwory do wkładania nosa z podczerwieniami, a pomiędzy nimi znajduje się dozownik pokarmu z fotokomórkami, w którym dozownik peletu dostarcza wzmocnienie pokarmowe. Nad każdym z dwóch dozowników pokarmu umieszczono wentylator i lampę oświetlającą.

1. Wyposażyć każdy otwór do wkładania nosa w liczbę wymiennych bodźców (Tabela 1) które różnią się w trzech różnych wymiarach percepcyjnych (t. j. zapach, wzrok, dotyk). Uwaga: bodźce sugerowane w Tabela 1 wybrano w celu uniknięcia wszelkich czynników zakłócających i/lub błędów wynikających z unikania lub preferencji. Pięć par egzemplarzy dla każdego wymiaru pozwala na przeprowadzenie testów wewnątrzpodmiotowych wszystkich przesunięć, z wykorzystaniem nowych bodźców przy każdym przesunięciu.
   1. W celu dostarczenia bodźce węchowe do otworów na pchnięcia nosem (nose-poke holes) należy zastosować olfaktometr rozcieńczeniowy, który przygotowuje powietrze doprowadzane do otworów poprzez automatyczne osuszanie, filtrowanie, ponowne nawilżanie oraz kontrolowanie prezentacji par zapachów.
      1. Użyj jednego olfaktometru do sterowania dwoma otworami do wkładania nosa (nose-poke). Reguluj przepływ powietrza za pomocą pompy powietrznej oraz próżni w celu usunięcia zapachu z otworów. Podłącz pompę powietrzną do wlotu olfaktometru, a próżnię do wylotów zamontowanych w urządzeniu do wkładania nosa. Następnie podłącz wylot odpowiedzialny za dostarczanie zapachu do każdego z wlotów otworu do wkładania nosa. Ustaw natężenie przepływu na 1,5 l na minutę.
      2. Rozcieńczyć zapachy w stosunku 1:20 w oleju mineralnym i napełnić nimi butelki olfaktometru.
   2. Dla bodźce wzrokowe, umieścić diody elektroluminescencyjne (LED) nad każdym otworem do wkładania nosa i przymocować je do metalowego panelu komory (szczegóły w Rycina 1 i Tabela 1). Podłącz je do interfejsu wyjściowego.
   3. Dla bodźce dotykowezamontuj wymienne tekstury podłogi przed każdym otworem do poke'owania nosem. Zamocuj różne tekstury na przesuwnym wsporniku i przemieszczaj je za pomocą ram pod podłogą, tak aby znajdowały się na wysokości małego otworu (3 x 3 cm²) na podłodze przed każdym otworem do wkładania nosa.
2. Kontroluj prezentację bodźców za pomocą oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta, aby automatycznie zmieniać bodźce o różnych wymiarach podczas eksperymentu.
3. Umieścić kamerę na górze aparatury w celu rejestracji naprzemiennego ruchu podstawowego oraz aktywności lokomotorycznej przy użyciu oprogramowania do monitorowania behawioralnego (np.., Ethovision, Anymaze), co może pomóc w wyeliminowaniu zwierząt z problemami niezwiązanymi z funkcjami poznawczymi.

ZAPACHY	TEKSTURY	OŚWIETLENIE
brzoskwinia v. szałwia	rzep vs. folia	światło włączone vs światło wyłączone
wanilia vs. lawenda	papier ścierny gruboziarnisty v. papier ścierny drobnoziarnisty	czerwony vs. zielony
truskawka vs. cynamon	gładki karton v. tektura falista	niebieski v. żółty
grejpfruit vs. oregano	gąbka vs. gładki plastik	pomarańczowy v. biały
cytryna v. morela	papier plastrowy a folia aluminiowa	światła stałe vs. światła migające

Tabela 1. Egzemplarze wykorzystane w zadaniu ID/ED Operon. Dyskryminacje złożone opierają się na stałych kombinacjach par egzemplarzy (patrz Rysunek 2 dla przykładu sekwencji dyskryminacji). Pary egzemplarzy z różnych wymiarów są prezentowane w losowych kombinacjach. Bodźcami neutralnymi dla poszczególnych wymiarów są: przepływ powietrza bez zapachu; biały papier; brak bodźców świetlnych. Tabela pierwotnie opublikowana w 'The Ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice'¹⁹.

2. Przygotowanie zwierząt

Uwaga: Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki uzyskano od samców myszy C57BL/6J w wieku od 3 do 7 miesięcy, podczas fazy jasnej.

1. Zważ myszy, umieść je w pojedynczych klatkach, a następnie poddawaj manipulacjom przez 1 min w trzy naprzemienne dni.
2. Po tygodniu aklimatyzacji do pojedynczego kwaterowania, rejestruj masę ciała oraz spożycie pokarmu w ciągu 24 h przez trzy kolejne dni, aby określić masę wyjściową i bazowe spożycie pokarmu.
3. Przez 1 tydzień przed treningiem do testu zastosuj lekki reżim ograniczenia pokarmowego. Codziennie kontroluj masę zwierząt podczas ograniczania pokarmu w trakcie całego eksperymentu, aby utrzymać około 90% ich wyjściowej masy ciała przy wolnym dostępie do pokarmu. Przez trzy kolejne dni przed fazą treningu habituacji podawaj myszom w ich klatkach domowych również ≈20 peletowych nagród pokarmowych. Są to granulaty pokarmowe, które będą wykorzystywane w późniejszych testach.
   Uwaga: Ograniczenie pokarmowe stosuje się w celu zwiększenia motywacji zwierząt do wykonywania zadania, jednak nie należy dopuścić do utraty masy ciała przekraczającej 10% w żadnej fazie całej procedury, ponieważ może to prowadzić do nieprawidłowych zachowań i nadmiernego stresu u myszy, co może wpłynąć na wyniki.
   1. Alternatywnie, aby uniknąć pojedynczego kwaterowania, pozostaw myszy w grupach (po 2 do 4 osobników w każdej klatce) i zapewnij dostęp do pokarmu ad libitum przez określony czas po testach. Codziennie kontroluj masę zwierząt podczas ograniczania pokarmu w trakcie całego eksperymentu, aby utrzymać około 90% ich wyjściowej masy ciała przy wolnym dostępie do pokarmu.

3. Habituacja

1. Poddaj myszy treningowi w ramach jednej 40-minutowej sesji, aby nauczyć je poruszania się wewnątrz aparatury bez zastosowania drzwi dzielących, gdzie włożenie pyszczka do dowolnego otworu (nose-poke) skutkuje podaniem granulki pokarmu do dozownika. W tej fazie, dla wszystkich różnych wymiarów, stosuj wyłącznie bodźce neutralne (Tabela 1) (Habituacja 1).
2. Następnego dnia trenuj zwierzęta przez 40 min, aby nauczyć je przechodzenia z jednej komory do drugiej na koniec każdej próby (Habituacja 2). Dla wszystkich różnych wymiarów stosuj wyłącznie bodźce neutralne. Również w tej fazie włożenie pyszczka do dowolnego z otworów skutkuje podaniem granulki do dozownika pokarmu. Gdy mysz odbierze nagrodę z dozownika, opuść drzwi dzielące, aby zapewnić myszy dostęp do drugiej komory w kolejnej próbie.
3. Trzeciego dnia (Habituacja 3) wytrenuj zwierzęta w wykonaniu dwóch prostych dyskryminacji (SD1 i SD2; np. rzep vs. folia; sygnał świetlny włączony vs. sygnał świetlny wyłączony; brzoskwinia vs. szałwia) do kryterium 8 poprawnych odpowiedzi z 10 kolejnych prób. Nie używaj tych egzemplarzy ponownie podczas następnych faz testu.
   1. Na początek umieść mysz w jednej komorze z bodźcami neutralnymi, podczas gdy w drugiej komorze sygnały bodźców są włączone; następnie opuść drzwi, aby zapewnić myszy dostęp do komory z aktywnymi sygnałami bodźców. Mysz musi nauczyć się wybierać otwór, w którym prezentowany jest poprawny bodziec. Sesje trwają 40 min.
   2. Nagradzaj włożenie pyszczka do poprawnego otworu podaniem granulki, a gdy mysz wejdzie do dozownika pokarmu, opuść drzwi dzielące, aby zapewnić myszy dostęp do drugiej komory w kolejnej próbie. Nie nagradzaj włożenia pyszczka do niewłaściwego otworu i włącz światło w pomieszczeniu na 5 s. Następnie opuść drzwi, aby zapewnić myszy dostęp do drugiej komory w kolejnej próbie.
   3. Przeprowadź pierwsze dziesięć prób każdego etapu jako próby kształtujące: jeśli mysz wybierze niewłaściwy otwór, zarejestruj błąd, ale nie przerywaj próby, dopóki mysz nie włoży pyszczka również do poprawnego otworu. W kolejnych próbach, jeśli mysz włoży pyszczek do niewłaściwego otworu, zarejestruj błąd i wyłącz wszystkie bodźce wymiarowe, aby zakończyć próbę.
   4. Zakończ każdą sesję po 40 min lub jeśli mysz nie wykona żadnej reakcji przez pięć kolejnych minut, zależnie od tego, co nastąpi pierwsze. Jeśli mysz nie osiągnie kryterium w jednej sesji, kontynuuj test następnego dnia.
   5. Jeśli mysz nie zdoła osiągnąć kryterium w SD1 lub SD2 w ramach Habituacji 3 po 5 sesjach, przerwij testowanie tej myszy i wyeliminuj ją z badania, ponieważ nie jest ona w stanie wiarygodnie wykonywać podstawowych dyskryminacji, co mogłoby w дальнейшем wpłynąć na wyniki zadania ID/ED.

Rysunek 2. Przykład zadania ID/ED. Przedstawiono przykład paradygmatów ID/ED „stuck-in-set” oraz „two-dimension”. Zaadaptowano z 'The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice'¹⁹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Procedura paradygmatu ID/ED „stuck-in-set”

Uwaga: W przypadku tej procedury, stosowanej wcześniej zarówno u naczelnych, jak i gryzoni^7,15,16, konieczne jest manipulowanie trzema różnymi wymiarami percepcyjnymi dla każdej badanej myszy. Podobnie jak w fazach habituacji, wszystkie codzienne sesje testowe rozpoczynają się od umieszczenia myszy w jednej z dwóch komór, w której wszystkie bodźce są neutralne. Przed rozpoczęciem próby w przeciwległej komorze włączane są sygnały bodźcowe. Następnie opuszczane są drzwi dzielące, aby umożliwić myszy dostęp do drugiej komory, w której aktywne są sygnały bodźcowe.

1. Aby wytrenować zwierzę w celu wykształcenia zestawu, lub tendencji (bias), w kierunku konkretnego wymiaru percepcyjnego (np. zapachu, światła lub tekstury podłoża), poddaj myszy następującym dyskryminacjom prezentowanym w podanej kolejności (patrz również przykład na Rysunku 2):
   1. W przypadku dyskryminacji prostej (SD), wprowadź myszy w wymiar (zapach, światło lub tekstura, patrz Rysunek 2), który jest istotny we wszystkich zadaniach aż do etapu EDS. Oznacza to, że wymiarem istotnym jest ten, który wskazuje, gdzie znajduje się poprawna odpowiedź. Postępując zgodnie z przykładem na Rysunku 2, zaprezentuj dwa zapachy, np. wanilię (O1) i lawendę (O2), i wybierz O1 jako poprawną odpowiedź.
   2. W przypadku dyskryminacji złożonej (CD), wprowadź drugi wymiar, na przykład światło, który jest nieistotny (tj. nie wskazuje, gdzie znajduje się poprawna odpowiedź). Zaprezentuj dwa światła (L1 i L2) wraz z zapachami (O1 i O2), aby uzyskać dwie możliwe dyskryminacje (patrz przykład na Rysunku 2). Egzemplarze poprawne i błędne są takie same jak w SD.
   3. W przypadku odwrócenia dyskryminacji złożonej (CDRe), pozostaw egzemplarze i wymiar istotny bez zmian, ale naucz zwierzęta, że poprzednio poprawny bodziec jest teraz błędny. Na przykład wybierz lawendę jako poprawną odpowiedź, podczas gdy wanilia jest teraz wyborem błędnym. Te same warunki będą obowiązywać dla pozostałych faz odwrócenia (tj. IDSRe, IDS2Re i EDSRe).
   4. Następnie wybierz przesunięcie wewnątrzwymiarowe (IDS), w którym nowe egzemplarze są stosowane dla obu wymiarów – istotnego i nieistotnego (projekt całkowitej zmiany). Na przykład zastosuj zapachy truskawki i cynamonu (O3 i O4) oraz światła niebieskie i żółte (L3 i L4). Należy jednak upewnić się, że badane osobniki nadal kierują się tym samym wymiarem istotnym, aby znaleźć poprawną odpowiedź. Te same warunki będą obowiązywać dla drugiego przesunięcia wewnątrzwymiarowego (tj. IDS2).
   5. Podobnie jak w poprzedniej dyskryminacji, przeprowadź u myszy odwrócenie przesunięcia wewnątrzwymiarowego (IDSRe). Zastosuj te same warunki, co w CDRe.
   6. W przypadku drugiego przesunięcia wewnątrzwymiarowego (IDS2) zastosuj te same warunki, co w IDS.
   7. Analogicznie, zastosuj te same warunki, co w CDRe, dla drugiego odwrócenia przesunięcia wewnątrzwymiarowego (IDSRe2).
   8. W przesunięciu zewnątrzwymiarowym (EDS) myszy muszą wybrać poprawny otwór po zaprezentowaniu nowego wymiaru bodźca. Zaprezentuj parę bodźców z nowego wymiaru, którym jest tekstura. Na przykład użyj grubego papieru ściernego (T1) jako poprawnej odpowiedzi i drobnego papieru ściernego (T2) jako błędnej, a następnie zaprezentuj je z dwoma nowymi zapachami, np. cytryny i moreli (O7 i O8). Poprzednio istotny wymiar stał się teraz nieistotny. Nie prezentuj już poprzednio nieistotnego wymiaru.
   9. W przypadku odwrócenia zewnątrzwymiarowego (EDSRe) zastosuj te same warunki, co w CDRe.
2. Mierz wyniki myszy, aż osiągną kryterium 8 poprawnych wyborów na 10 kolejnych prób, aby ukończyć każdy etap. Skonfiguruj program (patrz Tabela Materiałów), aby automatycznie przejść do następnego etapu po osiągnięciu kryterium. Przerwij codzienną sesję po 40 min, lub jeśli mysz nie wykona żadnej reakcji przez 5 kolejnych minut, zakończ sesję i kontynuuj następnego dnia z tą samą myszą na etapie, na którym przerwała.
   1. Dla każdego etapu mierz czas potrzebny na osiągnięcie kryterium. Jeśli mysz nie osiągnie kryterium w jednej sesji, zsumuj całkowity czas z kolejnych sesji. Dla każdej próby mierz czas od prezentacji bodźców (zapachów, świateł, tekstur) do reakcji w postaci włożenia nosa w otwór (latencja odpowiedzi).
3. Na koniec każdej sesji przemyj aparat 70% alkoholem.
4. Zawsze stosuj tę samą kolejność dyskryminacji. Jednak losowo zmieniaj wymiary bodźców i pary użytych egzemplarzy; reprezentuj je równomiernie w grupach eksperymentalnych i stosuj przeciwbilansowanie między grupami.
5. Upewnij się, że wymiary percepcyjne są równomiernie przeciwbilansowane wewnątrz i pomiędzy grupami eksperymentalnymi, tak aby każde możliwe przesunięcie ED było reprezentowane (tj. ze światła na zapach, ze światła na teksturę, z zapachu na światło, z zapachu na teksturę, z tekstury na światło, z tekstury na zapach). Kombinacje egzemplarzy są zbyt liczne, aby umożliwić pełne przeciwbilansowanie; dlatego w celu zmniejszenia liczby stopni swobody zawsze używaj egzemplarzy w parach, np. bodziec waniliowy z lawendowym itd. (patrz Tabela 1).

5. Procedura paradygmatu ID/ED „dwuwymiarowego”

Uwaga: Innym warunkiem do pomiaru zdolności przełączania zestawu uwagi, stosowanym zarówno u naczelnych^12,17, jak i u gryzoni¹³, jest paradygmat „dwuwymiarowy”. W tym przypadku w całym teście wykorzystuje się tylko dwa wymiary percepcyjne.

1. W tym protokole należy zastosować kolejność dyskryminacji oraz procedurę opisaną dla protokołu „stuck-in-set” aż do etapu EDS (patrz przykład na Rysunku 2):
   1. W przypadku SD i kolejnych etapów należy używać tych samych par co w protokole „stuck-in-set”, aż do etapu IDS2Re. Jak pokazano w przykładzie na Rysunku 2, należy użyć dwóch zapachów (O1 i O2, przyjmując O1 jako bodziec poprawny).
   2. W przypadku CD, podobnie jak w protokole „stuck-in-set”, należy wprowadzić nowy wymiar (na przykład światło, L1 i L2), który jest nieistotny i będzie służył jako czynnik zakłócający.
   3. Etap CDRe jest analogiczny do protokołu „stuck-in-set”, zatem egzemplarze i wymiar istotny pozostają niezmienione, ale zwierzęta muszą nauczyć się, że wcześniej poprawny bodziec jest teraz niepoprawny (np. O1).
   4. W IDS należy zawsze stosować nowe pary bodźców dla obu wymiarów (O3 i O4, L3 i L4, gdzie O3 jest bodźcem poprawnym).
   5. W IDSRe myszy wykonują odwrócenie (reversal) etapu IDS. Jako poprawny egzemplarz należy wybrać ten, który był niepoprawny podczas IDS (np. O4).
   6. W IDS2 należy wprowadzić nowe pary bodźców dla obu wymiarów (O5 i O6, L5 i L6).
   7. Podobnie jak w poprzednich etapach odwrócenia, w IDS2Re zwierzęta muszą nauczyć się, że wcześniej poprawny bodziec jest teraz niepoprawny (np. O5).
   8. W protokole „dwuwymiarowym” podczas EDS myszy muszą wybrać poprawną odpowiedź po tym, jak wcześniej nieistotny wymiar staje się wymiarem istotnym. Zatem światło jest nowym wymiarem istotnym, który wskazuje poprawną odpowiedź. W szczególności poprawną odpowiedzią jest światło czerwone (L7). Odwrotnie, wcześniej istotny wymiar (w przykładzie zapach) staje się teraz nieistotny.
   9. Po EDS, podczas odwrócenia (EDSRe), należy zastosować te same warunki co w CDRe. Wymiar istotny pozostaje taki sam jak w EDS, ale egzemplarze poprawne i niepoprawne zostają zamienione. W ten sposób, na przykład, poprawną odpowiedzią jest teraz światło zielone (L8).

6. Analiza danych

1. Zmierz wydajność, określając: liczbę prób do osiągnięcia kryterium; czas do osiągnięcia kryterium (w minutach); czas od prezentacji bodźców do reakcji w postaci pchnięcia nosem (latencja odpowiedzi).
2. Do analizy statystycznej wykorzystaj analizę wariancji (ANOVA) z różnymi etapami (SD, CD, CDRe, IDS, IDSRe, IDS2, IDSRe2, EDS oraz EDSRe) jako czynnik wewnątrzobiektowy, aby zbadać liczbę prób wymaganych do osiągnięcia kryteriów, czas potrzebny na ukończenie każdego etapu oraz latencję odpowiedzi. Przeprowadź analizy post-hoc przy użyciu testu Newmana-Keulsa. Uwaga: przyjęta wartość istotności to p<0.05.

Wyniki

Rycina 2 pokazuje przykład zadania ID/ED. Pary bodźców (albo „Dyskryminacja 1”, albo „Dyskryminacja 2”) są prezentowane losowo na każdym etapie, a mysz musi wybrać właściwy bodziec w każdej parze. W poniższej tabeli przykładu prawidłowy egzemplarz zaznaczono pogrubioną czcionką. Na pierwszym etapie (SD lub prosta dyskryminacja) bodźce prezentowane w dwóch otworach do wkładania nosa różniły się w jednym z trzech wymiarów (np. O1: wanilia vs. O2: lawenda) a mysz otrzymuje nagrodę za wybranie prawidłowego egzemplarza (np. O1). Gdy badany osiągnie kryterium na tym etapie, rozpoczyna się kolejny etap (CD lub dyskryminacja złożona), w którym te same egzemplarze istotnego wymiaru są prezentowane z przypadkowo nałożonymi egzemplarzami drugiego, nieistotnego wymiaru, wprowadzonego jako czynnik zakłócający (np.., L1: światło niebieskie vs. L2: światło żółte). Na tym etapie możliwe są dwie różne dyskryminacje („Dyskryminacja 1” lub „Dyskryminacja 2”). W kolejnym etapie (CDRe lub odwrócenie dyskryminacji złożonej), warunki otrzymywania nagrody zostają odwrócone, natomiast egzemplarze i istotny wymiar pozostają niezmienione: mysz musi nauczyć się, że bodziec, który wcześniej był poprawny, teraz jest niepoprawny (np. zapach lawendy jest teraz nagradzany). W następnym etapie (IDS lub przesunięcie wewnątrzwymiarowe) wprowadzane są nowe egzemplarze (zarówno zapachy, jak i światła), jednak istotny wymiar (w tym przykładzie zapach) pozostaje ten sam (np. truskawka jest właściwym wyborem). W kolejnym etapie (IDR lub odwrócenie wewnątrzwymiarowe), warunki nagradzania zostają odwrócone. Po drugim przesunięciu wewnątrzwymiarowym (IDS2 i jego odwróceniu), wprowadza się nowe egzemplarze w celu przetestowania przesunięcia zewnątrzwymiarowego (EDS), w którym zmienia się istotny wymiar. W EDS typu „stuck-in-set” (utknięcie w zbiorze), mysz musi skupić się na nowym wymiarze (np. tekstura, T1: papier ścierny o grubej ziarnistości w porównaniu z T2: drobnoziarnisty papier ścierny), natomiast wcześniej istotny wymiar (w tym przypadku zapach) staje się teraz wymiarem nieistotnym. W przypadku EDS dwuwymiarowego („two-dimension”), wcześniej nieistotny wymiar (w tym przypadku światło) staje się teraz wymiarem istotnym. W końcowej fazie (EDSRe lub odwrócenie ekstrawymiarowe) zależności nagród zostają odwrócone.

Aby uzyskać wiarygodne wyniki, wymiary bodźców wykorzystywane w zadaniu powinny być opanowane w równym stopniu. Jak pokazano na Rysunku 3, dyskryminacje wzrokowa, dotykowa i węchowa w tym nowym aparacie wymagały podobnego czasu (F_(2,64)=0.36; p=0.69) oraz podobnej liczby prób (F_(2,64)=0.059; p=0.94) do osiągnięcia kryterium, co sugeruje, że zwierzęta są w stanie przeprowadzać proste dyskryminacje niezależnie od prezentowanego wymiaru.

Jeśli w fazach testowania zadania wypracowano niezawodny zestaw uwagi, wyniki normalnej myszy typu dzikiego powinny być gorsze w etapie EDS w porównaniu z etapami poprzedzającymi i następującymi, zgodnie z doniesieniami z wcześniejszych badań na gryzoniach i naczelnych^12,13. W szczególności w etapie EDS powinien wystąpić wyraźny wzrost czasu i liczby prób niezbędnych do osiągnięcia kryteriów w porównaniu z etapami IDS. Jak pokazano na Rysunku 4, w naszym eksperymencie z protokołem „stuck-in-set” analiza wyników myszy wykazała efekt dyskryminacji dla liczby prób (F_(8,168)=9,23; p<0,0001) oraz czasu (F_(8,168)=8,62; p<0,0001) wymaganego do osiągnięcia kryteriów. Rzeczywiście, myszy potrzebowały więcej prób i więcej czasu na rozwiązanie etapu EDS w porównaniu z etapami CD, IDS, IDS2 i EDSRe (p<0,05; Rysunek 4A-B). Podobnie analiza wyników w protokole „two-dimension” (Rysunek 5)) wykazała istotny efekt dyskryminacji dla liczby prób (F_(8,72)=3,66; p<0,005) oraz czasu (F_(8,72)=4,65; p<0,0005) potrzebnego do osiągnięcia kryteriów. Wykazaliśmy, że myszy wymagały więcej prób (p<0,05) i więcej czasu (p<0,05) na rozwiązanie EDS w porównaniu z CD, IDS, IDS2 i EDSRe (Rysunek 5A-B). Nie powinno być obserwowanych różnic w zdolnościach do zmiany (shifting) między myszami testowanymi przy różnych wymiarach.

U normalnej myszy typu dzikiego pierwsza nauka odwrócenia (i.e., CDRe) jest trudniejsza niż pierwotne rozróżnianie (i.e., CD). Zgodnie z tym, jak wynika z Rysunków 4 i 5, myszy potrzebowały więcej prób (p<0.05; Rysunek 4-5A) i więcej czasu (p<0.05; Rysunek 4-5B), aby ukończyć ten etap. Co więcej, wyniki nauki odwrócenia powinny ulegać poprawie od CDRe przez IDSRe do IDS2Re, co wykazaliśmy w naszym eksperymencie z zastosowaniem protokołów „stuck-in-set” oraz „two-dimension”. Wyniki te dodatkowo wzmacniają dowody na formowanie się zestawu uwagi w trakcie wykonywania zadania.

W trakcie wykonywania zadania myszy powinny zwiększać szybkość reakcji na kolejnych etapach. Odpowiednio, analiza czasu reakcji wykazała istotny efekt dyskryminacji (F_(8,200)=42,59; p<0,0001). W szczególności, jak pokazują reprezentatywne wyniki na Rysunku 4C , czas reakcji (poke) na etapie IDS2 uległ skróceniu w porównaniu z etapami IDS, CD i SD (p<0,0005). Co więcej, czas reakcji wydłużył się podczas etapu EDS w porównaniu z poprzednimi etapami IDS2 i IDS2Re oraz następującymi etapami EDSRe (p<0,05). Zgodnie z tymi wynikami, analiza czasu reakcji podczas zadania „dwuwymiarowego” również wykazała istotny efekt dyskryminacji (F_(7,63)=9,98; p<0,0005). Jak pokazano na Rysunku 5C, czas dokonania wyboru wydłużył się podczas EDS w porównaniu z wcześniejszymi IDS2 i IDS2Re oraz następującym EDSRe (p<0,05). Ponieważ czas reakcji jest uważany za wskaźnik procesów decyzyjnych¹⁸, wyniki te sugerują ponadto, że myszy napotkały trudności w przetwarzaniu nowej reguły dyskryminacyjnej podczas EDS. Na podstawie wyników behawioralnych myszy typu dzikiego (Rysunki 4-5) ustalono, że minimalna liczebność próby (na podstawie analizy mocy R) dla każdej grupy eksperymentalnej powinna wynosić 8.

Rysunek 3. Proste dyskryminacje światła, zapachu i tekstury są równoważne. (A) Liczba prób i (B) czas wymagany do osiągnięcia kryterium w prostych dyskryminacjach z wykorzystaniem wyłącznie bodźców świetlnych, zapachowych lub teksturalnych. Wartości reprezentują średnią ± SEM we wszystkich Rysunkach 2-4. Dane pierwotnie opublikowane w 'The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice'¹⁹.

Rycina 4. Wyniki samców myszy szczepu C57BL6J typu dzikiego w zadaniu ID/ED Operon z modelem „stuck-in-set”. (A) Liczba prób, (B) czas (w minutach) i liczba dni potrzebnych do osiągnięcia kryterium w różnych etapach zadania ID/ED Operon z zastosowaniem paradygmatu ID/ED „stuck-in-set”. (C) Czas (w sekundach), który upłynął od otwarcia drzwi przegrody do reakcji w postaci włożenia nosa do otworu (latencja reakcji) w poszczególnych etapach zadania. Przebadano łącznie 26 myszy; 4 myszy wykluczono, ponieważ nie wkładały nosa w sposób wiarygodny w celu pobrania wzmocnienia pokarmowego podczas treningu lub nie były w stanie ukończyć całej procedury. A: *p <0.05 względem CD, IDS, IDS2, IDS2Re i EDSRe; B: *p <0.05 względem CD, IDS2, IDS2Re i EDSRe. A i B: #p<0.05, ##p<0.005 względem CD, IDSRe i IDS2Re. C: *p <0.05 względem IDS2, IDS2Re i EDSRe. Należy zauważyć, że myszy były w stanie ukończyć całe zadanie w ciągu 5-9 dni we wszystkich eksperymentach przedstawionych na Ryc. 3-4. Dane pierwotnie opublikowane w „The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice”¹⁹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5. Wyniki samców myszy szczepu C57BL6J typu dzikiego w zadaniu ID/ED Operon w wersji dwuwymiarowej. (A) Liczba prób, (B) czas (w minutach) i liczba dni potrzebnych do osiągnięcia kryterium w różnych etapach zadania ID/ED Operon z zastosowaniem paradygmatu dwuwymiarowego. (C)Czas (w sekundach) upływający od otwarcia drzwi dzielnika do reakcji w postaci włożenia nosa w otwór (latencja odpowiedzi) w różnych etapach zadania. Przebadano łącznie 13 myszy; 3 myszy wykluczono, ponieważ nie wkładały nosa w otwór w sposób powtarzalny w celu pobrania wzmocnienia pokarmowego podczas treningu lub nie były w stanie ukończyć całej procedury. A i B: #p<0.05 względem CD i IDS2Re, *p <0.05 względem CD, IDS, IDS2, EDSRe. C: *p <0.05 względem IDS2, IDS2Re i EDSRe. Dane pierwotnie opublikowane w 'The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice'¹⁹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Oś czasu całej procedury protokołu do testowania zadania ID/ED.

Etap	Opis	Uwagi dodatkowe	Literatura
Prosta dyskryminacja (SD)
Rozróżnianie związków (CD)	Bodźce różnią się w dwóch wymiarach percepcyjnych, takich jak kolor i kształt w przypadku bodźców wzrokowych w zadaniu dla ludzi lub tekstura i zapach w przypadku gryzoni.
Uczenie odwracalne (CDRe – IDSRe – IDS2Re – EDSRe)	Dwa egzemplarze w obrębie wymiaru percepcyjnego mają odwrócone warunki wzmocnienia, tak że to, co wcześniej było poprawne, staje się niepoprawne i na odwrót)	W seryjnym uczeniu się odwracania (serial reversal learning) wyniki ulegają poprawie wraz z kolejnymi odwróceniami w obrębie jednej serii. Zatem etapy odwracania (t.j.., CDRe, IDSRe, IDS2Re) nie tylko oceniają funkcję różnych obszarów korowych, ale służą również do 1) uformowania zestawu poznawczo-uwagowego badanego na etapie EDS oraz 2) zapobiegania warunkowaniu przesądnemu w odniesieniu do niezamierzonych aspektów bodźca	- Uszkodzenia kory oczodołowo-czołowej u myszy (Bissonette et al., 2008) i małp (Dias et al., 1996) upośledziły uczenie odwrócenia - fMRI podczas wykonywania zadania uczenia się odwrócenia (reversal learning) wykazało aktywację kory oczodołowej (Hampshire i Owen, 2006)
Przesunięcie wewnątrzwymiarowe (IDS – IDS2)	Wprowadza się nowe egzemplarze, lecz ten sam wymiar zostaje wzmocniony	Etapy IDS służą jako kluczowa kontrola wewnętrzna (t.j.., EDS powinno być trudniejsze niż IDS), a także przyczyniać się do ukształtowania poznawczo-uwagowej konfiguracji (cognitive-attentional set)	Wyczerpanie dopaminy w PFC upośledzało tworzenie zestawu uwagi (Robbins i Roberts, 2007). Małpy z uszkodzeniami wywołanymi przez 6-OHDA nie wykazały klasycznej redukcji liczby błędów od pierwszej (IDS1) do ostatniej (IDS5) dyskryminacji, co powinno odzwierciedlać nabycie zestawu uwagi.
Przesunięcie ekstradymentonalne (EDS)	protokół „stuck-in-set” (utrwalenia schematu): wcześniej nieistotny wymiar bodźca zostaje zastąpiony nowym wymiarem bodźca, który natychmiast staje się istotny	Brak przełączenia się na nowy istotny wymiar nie może być przypisany do żadnej wcześniejszej nauki dotyczącej tego wymiaru, ponieważ nie był on wcześniej doświadczany. Zatem niepowodzenie to odzwierciedla perseverację w odniesieniu do poprzednio istotnego wymiaru.	Wykazano, że uszkodzenia mPFC upośledzają EDS u myszy (Bissonette et al., 2008) oraz małp (Dias et al., 1996). - Pacjenci z uszkodzeniami płata czołowego wykazują deficyty w warunkach „perseveracji” (utkwienia w schemacie), ale nie w warunkach „dwuwymiarowych” (Owen et al., 1993) - Dopamina w mPFC modulowała wyniki EDS u myszy (Papaleo et al., 2008; Scheggia et al., 2014) i szczurów (Tunbridge et al., 2004)
	protokół „dwuwymiarowy”: wzmocnienie wcześniej nieistotnego wymiaru	pozorna niezdolność do zmiany nastawienia uwagi może wystąpić w sytuacji, gdy badany jest w stanie odwrócić uwagę od wymiaru, który był wcześniej istotny (gdy ten staje się nieistotny), lecz mimo to nie potrafi ponownie skoncentrować uwagi na nowym, istotnym wymiarze	- Uszkodzenie mPFC u szczurów (Birrell and Brown, 2000) upośledziło przesunięcie EDS - fMRI podczas wykonywania EDS wykazało aktywację brzuszno-bocznej części kory przedczołowej (Hampshire i Owen, 2006)

Tabela 2: Etapy ID/ED Operon Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Opis etapów zadania, w tym odwołania do badań z wykorzystaniem lizek oraz badań farmakologicznych dotyczących roli obszarów mózgu zaangażowanych w poszczególne konstrukty testowane podczas zadania.

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy nowatorskie zautomatyzowane dwukomorowe zadanie "Operon" ID/ED dla myszy, które jest w stanie wiarygodnie mierzyć elastyczność poznawczą poprzez uczenie się zwrotne, tworzenie zestawów uwagi i przesuwanie. Paradygmat ten jest analogiczny do zadań WCST i ID/ED powszechnie stosowanych u naczelnych u ludzi i zwierząt i przezwycięża główne ograniczenia poprzednich wersji dla gryzoni. Ten paradygmat Operon może być wykorzystany jako nowe skuteczne narzędzie do dużych badań przesiewowych leków i/lub genetycznych istotnych dla funkcji poznawczych (dys)funkcji u myszy o dużym znaczeniu dla medycyny translacyjnej.

To zautomatyzowane zadanie ma następujące zalety w porównaniu z poprzednio używanym zadaniem ID/ED dla gryzoni: (1) ma mniej pracochłonne procedury niż wersje ręczne (np. oprogramowanie reguluje wszystkie fazy zadania, znacznie zmniejszając interwencje eksperymentatora); (2) eliminuje wszelkie źródła subiektywności w mierzonych parametrach (np. eksperymentator nie jest zobowiązany do oceny, czy zwierzę rzeczywiście dokonało odpowiedzi wyboru); (3) eliminuje wszelką możliwość, że myszy mogą podążać za wskazówkami związanymi ze wzmocnieniem w celu udzielenia odpowiedzi (tj. nagroda jest zawsze automatycznie dostarczana do centralnego magazynka); (4) unika arbitralnych warunków środowiskowych (np. korzystanie z labiryntów i aparatury o różnych rozmiarach/materiałach, stosowanie ręcznie przygotowanych bodźców podpowiadających); (5) Umożliwia manipulowanie trzema odrębnymi wymiarami za pomocą szerokiego zakresu różnych bodźców, zgodnie z równoważnymi zadaniami ludzkimi stosowanymi w warunkach klinicznych. Tutaj prezentujemy dane tylko od myszy, ale podobnych korzyści można się spodziewać również w przypadku szczurów.

W zadaniu istnieją krytyczne etapy, które są wewnętrznymi parametrami trafności konstrukcji, które można wykorzystać w celu zidentyfikowania wiarygodnej wydajności zmiany zestawu uwagi: i) gorsza wydajność w EDS w porównaniu z poprzednimi etapami, ii) ogólna poprawa z IDS do IDS2; (iii) specyficzną poprawę w kolejnych etapach odwrócenia, ponieważ im bardziej zwierzę jest szkolone w zakresie odwrócenia wewnątrz zestawu, tym lepiej powinno radzić sobie z kolejnymi odwróceniami wewnątrz zestawu²⁰; (iv) lepsze wyniki w EDSRe w porównaniu z EDS. To nowatorskie zadanie operonowe ID/ED prezentuje wszystkie te cechy, zgodne z wcześniejszymi badaniami na naczelnych przy użyciu zadania CANTAB ID/ED oraz u gryzoni przy użyciu ręcznej wersji "kopania"^12,13. Co więcej, każdy etap tego zautomatyzowanego zadania został przebadany w równoważnej liczbie prób, niezależnie od zastosowanego istotnego/nieistotnego wymiaru (tj. zapachu, tekstury i światła)¹⁹. Wykazało to, że wszystkie użyte bodźce mają podobną istotność i są odpowiednie do tworzenia nastawienia uwagi i/lub zmiany biegu. Nasze eksperymenty pokazują, że trudność w rozwiązaniu EDS jest również podkreślona przez wzrost opóźnień odpowiedzi. Czas przetwarzania wydłuża się, aby zachować optymalną dokładność podczas ostrzejszych dyskryminacji²¹. W związku z tym, biorąc pod uwagę opóźnienie w reagowaniu jako wskaźnik szybkości przetwarzania informacji, podejmowania decyzji i rozwiązywania problemów¹⁸, wolniejsze opóźnienia podczas EDS mogą odzwierciedlać strategię przyjętą w celu zmierzenia się z trudnościami w rozwiązaniu problemu zmiany zestawu.

Wykazaliśmy, że nasz nowatorski aparat może być skutecznie używany z bardziej "klasycznym" paradygmatem zmiany zestawu uwagi, wykorzystującym tylko dwa wymiary w całym teście (tj. dwuwymiarowym) lub z paradygmatem utkniętym w układzie implikacyjnym, implikującym użycie trzech wymiarów. W zależności od interesującej nas domeny poznawczej możliwe jest wybranie najbardziej odpowiedniego protokołu. Oba te paradygmaty były wcześniej stosowane u ludzi, naczelnych i gryzoni^7,12-17. Jednak procedura utknięcia w zestawie jest w stanie rozróżnić różne składniki przesunięcia zestawu i jest bardziej selektywną miarą funkcjonowania płata czołowego u pacjentów^7,22. Co więcej, jednym z problemów, który może wystąpić w paradygmacie dwuwymiarowym , jest wyuczona nieistotność , która może zniekształcić wyniki. Wyuczona perseweracja nieistotności odnosi się do niezdolności do zwrócenia uwagi i uczenia się informacji, które wcześniej były nieistotne⁷. Taka sytuacja może wystąpić w fazie EDS paradygmatu dwuwymiarowego , ponieważ od podmiotu wymaga się przeniesienia uwagi na wymiar wcześniej nieistotny. W tym przypadku w zasadzie niemożliwe jest rozróżnienie, czy deficyt EDS jest spowodowany niezdolnością do odwrócenia uwagi od poprzednio istotnego wymiaru i/lub niemożnością przeniesienia uwagi na wcześniej nieistotny wymiar. Upośledzenie może więc po prostu odzwierciedlać aktywne hamowanie reagowania na wymiar, który wcześniej stał się nieistotny ze względu na jego losowe powiązanie ze wzmacniającą informacją zwrotną. W przeciwieństwie do tego, w stanie utknięcia w ustaleniu , niepowodzenie w przejściu do nowego odpowiedniego wymiaru nie może być przypisane jakiemukolwiek wcześniejszemu uczeniu się o tym wymiarze, ponieważ nie było to wcześniej doświadczane. Porażka odzwierciedla zatem dążenie do wcześniej istotnego wymiaru. Podsumowując, nawet jeśli u normalnych myszy typu dzikiego paradygmaty "utknięcia w zestawie" i "dwuwymiarowej" zmiany zestawu uwagi mogą dawać podobne wyniki, zdecydowanie preferujemy persewerację utkniętą w zestawie z powodów omówionych powyżej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ściany z pleksi i podłoga aluminiowa	Wykonane		(16 x 16 x 16 cm na każdą komorę)
Drzwi z pleksi	Komputer PC wykonany na
	Dell Inc.
Oprogramowanie MED-PC IV 	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	wykonane na zamówienie	Użyj kodu operacyjnego, aby automatycznie kontrolować prezentację bodźców i sekwencję etapów
Otwór na nos	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-314M
Magazyn żywności	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-303M
Dozownik pelletu do wzmacniania żywności	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-203-14P
Oświetlenie domowe	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-315M
Olfaktometr rozcieńczania	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	PHM-275
Płynne substancje zapachowe	(Sigma Aldrich, Dorset, Wielka Brytania)		(patrz Tabela 1)
Olej mineralny	(Sigma Aldrich, Dorset, Wielka Brytania)	M5904
Pompa powietrza i próżnia	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	Próżnia PHM-280	jest zalecana do usuwania zapachów na koniec każdej próby
Diody elektroluminescencyjne (LED)			Przezroczysty klejnot o wysokiej intensywności, 3 mm
Tekstury			3x3 cm
Granulki wzmacniające	TestDiet	5TUL 14mg	Dla myszy

na zamówienie zamówienie podłogi