Operacyjne wewnątrz-/zewnątrzwymiarowe zadanie zmiany ustawień dla myszy

Summary

Zaburzenia poznawcze związane z uwagą są podstawową cechą wielu chorób psychicznych. W tym miejscu przedstawiamy opracowanie nowatorskiego automatycznego systemu do skutecznego badania zdolności zmiany ustawień uwagi, funkcji wykonawczych i innych zdolności poznawczych u myszy o wysokiej trafności translacyjnej do badań na ludziach.

Abstract

Zmiany w kontroli wykonawczej i elastyczności poznawczej, takie jak zdolność do zmiany nastawienia uwagi, są podstawowymi cechami kilku chorób neuropsychiatrycznych. Najczęściej stosowanymi testami neuropsychologicznymi do oceny zmiany ustawień uwagi u ludzi są Wisconsin Card Sorting Test (WCST) oraz CANTAB Intra-/Extra-dimensional set shift task (ID / ED). Zadania te dowiodły znaczenia klinicznego i zostały zmodyfikowane i z powodzeniem zaadaptowane do badań na modelach zwierzęcych. Jednak obecnie dostępne zadania dla gryzoni mają kilka ograniczeń, głównie ze względu na ich ręczne procedury testowe, które hamują postęp translacyjny w medycynie psychiatrycznej. Aby przezwyciężyć te ograniczenia i lepiej naśladować oryginalną wersję u naczelnych, przedstawiamy opracowanie nowatorskiego, opartego na instrumentach dwukomorowego zadania "Operon" ID/ED dla gryzoni. Wykazaliśmy skuteczność tego nowatorskiego zadania w mierzeniu różnych aspektów elastyczności poznawczej u myszy, w tym tworzenia i zmiany zestawu uwagi oraz uczenia się odwróconego. Co więcej, pokazujemy wysoką elastyczność tego zadania, w którym można manipulować trzema różnymi wymiarami percepcyjnymi za pomocą dużej liczby bodźców dla każdego wymiaru. To nowatorskie zadanie ID/ED Operon może być skutecznym narzędziem przedklinicznym do testowania leków i/lub dużych genetycznych badań przesiewowych istotnych dla badania dysfunkcji wykonawczych i objawów poznawczych występujących w zaburzeniach psychicznych.

Introduction

Zmiana nastawienia uwagi jest miarą elastyczności poznawczej i funkcji wykonawczych¹. Odnosi się do zdolności do przełączania się między arbitralnymi regułami wewnętrznymi ("zestawy poznawczo-uważne"). Najpowszechniej stosowanymi zadaniami neuropsychologicznymi do pomiaru zmiany ustawień uwagi i elastyczności poznawczej u ludzi są Test Sortowania Kart Wisconsin (WCST)² oraz nowsza i bardziej wyrafinowana wersja: wewnątrz- i pozawymiarowa zmiana zestawu uwagi (ID/ED) w Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB)^3,4. Zadania te zostały wykorzystane do zidentyfikowania określonych nieprawidłowości poznawczych w szerokim zakresie zaburzeń psychicznych, w tym autyzmu⁵, schizofrenii⁶, choroby Parkinsona⁷, zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych⁸ i zaburzeń z deficytem uwagi/nadpobudliwości⁹. Znaczenie kliniczne i solidne podejście metodologiczne WCST i testów ID/ED wzbudziły zainteresowanie wdrożeniem podobnych testów w badaniach przedklinicznych^10,11. Zadania te pozwalają na selektywny pomiar w obrębie tego samego przedmiotu różnych zdolności poznawczych, takich jak uczenie się dyskryminacyjne, uczenie się odwrócone, tworzenie zestawu uwagi, przesunięcie uwagi w tym samym wymiarze (tj. przesunięcie wewnątrzwymiarowe: IDS) i między różnymi wymiarami percepcyjnymi (tj. przesunięcie pozawymiarowe: EDS). Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ odrębne obwody mózgowe, a także neuropatologia mogą zmieniać te różne funkcje poznawcze na różne sposoby. Na przykład, wykazano efekt podwójnej dysocjacji lub specjalizacji funkcjonalnej między bocznymi (u małp i ludzi) / przyśrodkowym (u gryzoni) a orbitalnym regionem PFC w zadaniach zmiany nastawienia uwagi. Podczas gdy kora oczodołowo-czołowa jest bardziej zaangażowana w fazy odwrócenia tych zadań, boczny/przyśrodkowy obszar PFC rządzi etapami przesunięcia pozawymiarowego^12-14.

Gryzonie te testy koncentracji uwagi dla naczelnych zostały pomyślnie wygenerowane^13-16. Jednak niektóre aspekty tych wersji gryzoni ograniczają ich zastosowanie i zastosowanie. Na przykład zadania te są uruchamiane ręcznie, a zatem są bardzo pracochłonne i trudne do standaryzacji. Co więcej, obecność wzmacniaczy pokarmowych wewnątrz bodźców może skutkować niejednoznaczną interpretacją reakcji zwierząt i potencjalną stronniczością w podejmowaniu wyborów¹⁰. Cechy te ograniczyły przepustowość testów i, co ważniejsze, ich zastosowanie w badaniach genetycznych i/lub przesiewowych leków na dużą skalę.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia i zwiększyć potencjalne zastosowania paradygmatów zmiany ID/ED u gryzoni, prezentujemy tutaj nowatorskie dwukomorowe zadanie oparte na instrumentach, aby przetestować elastyczność poznawczą u myszy. To nowatorskie zadanie ściśle naśladuje zadanie ID/ED stosowane u naczelnych u ludzi i innych niż ludzie i omija problemy związane z wcześniejszymi wersjami gryzoni.

Protocol

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia oraz lokalny Komitet ds. Użytkowania Zwierząt i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych Dyrektyw Rady Wspólnoty Europejskiej.

Uwaga: Rysunek 6 pokazuje oś czasu całej procedury protokołu do testowania zadania ID/ED.

1. Aparatura

Rysunek 1. Dwukomorowy aparat " Operon ". (A) Widok z góry całej aparatury oraz (B) widok z przodu pojedynczej komory naśladującej punkt widzenia myszy podczas badania. 1: bodźce wzrokowe (LED); 2: magazyn żywności; 3: otwór na nos; 4: bodziec dotykowy (tekstura); 5: bodziec węchowy; 6: automatyczne drzwi przesuwne; 7: światło domu; 8: wiązka światła podczerwonego do sterowania drzwiami. Komory (16 x 16 x 16 cm³) oddzielone są przezroczystymi drzwiczkami z tworzywa sztucznego (6). Promienie świetlne w podczerwieni (8) śledziły ruchy zwierząt i kontrolowały otwieranie/zamykanie drzwi automatycznych, aby umożliwić myszowi zmianę komór. W każdej komorze znajdują się dwa otwory do wykłuwania nosa (3) z promieniami podczerwonymi, a pomiędzy nimi magazyn żywności (2) z wiązkami światła, w którym dozownik granulek dostarczał wzmocnienie żywności. Światło w domu (7) znajduje się nad każdym z dwóch magazynów żywności. Każdy otwór w nos jest wyposażony w szereg zmiennych bodźców, które mogą różnić się w trzech różnych wymiarach percepcyjnych (zapach, widok, takt). Pierwotnie opublikowane w 'The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice'¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uwaga: Aparat operonowy (Rysunek 1) składa się z dwóch identycznych komór ze ścianami z pleksiglasu i aluminiową podłogą (16 x 16 x 16^cm3 dla każdej komory). Komory są oddzielone przezroczystymi drzwiczkami działowymi z pleksiglasu, które mogą być automatycznie sterowane, aby umożliwić myszowi dostęp do każdej komory. Każda komora ma dwa otwory na nos z wiązkami światła podczerwonego, a pomiędzy nimi magazyn żywności z wiązkami światła, w którym dozownik granulek dostarczał wzmocnienie żywności. Wentylator i lampa domowa znajdują się nad każdym z dwóch magazynów spożywczych.

1. Wyposaż każdą dziurkę w nos w pewną liczbę zmiennych bodźców (Tabela 1), które różnią się trzema różnymi wymiarami percepcyjnymi (tj. zapach, wzrok, dotyk). Uwaga: Bodźce sugerowane w Tabeli 1 zostały wybrane w celu uniknięcia wszelkich czynników zakłócających i/lub stronniczości wynikających z unikania lub preferencji. Pięć par próbek dla każdego wymiaru pozwala na testowanie wszystkich zmian wewnątrz obiektu, z nowymi bodźcami na każdej zmianie.
   1. Aby dostarczyć bodźce węchowe do otworów w nosie, użyj olfaktometru rozcieńczenia, który kondycjonuje powietrze napływające do otworów w nosie poprzez automatyczne osuszanie, filtrowanie, nawadnianie i kontrolowanie prezentacji par zapachów.
      1. Użyj jednego olfaktometru, aby kontrolować dwa otwory na nos. Reguluj przepływ powietrza za pomocą pompy powietrza i podciśnienia w celu usunięcia zapachu z otworów na nos. Podłącz pompę powietrza do wlotu olfaktometru, a podciśnienie do wylotów zamontowanych na urządzeniu do szturchania nosa. Następnie podłącz wylot do dostarczania zapachu do każdego wlotu nosa. Dostosuj natężenie przepływu do 1,5 l na minutę.
      2. Rozcieńczyć zapachy zapachowe w stosunku 1:20 w oleju mineralnym i napełnić butelki olfaktometru.
   2. W celu uzyskania bodźców wizualnych umieść diody elektroluminescencyjne (LED) na każdym otworze w kształcie nosa i zabezpiecz je w metalowym panelu komory (patrz szczegóły na rysunku 1 i tabeli 1). Podłącz je do interfejsu wyjściowego.
   3. Aby uzyskać bodźce dotykowe, zamontuj wymienne tekstury podłogi przed każdym otworem na nos. Zamontuj różne tekstury na przesuwnym wsporniku i przesuwaj je za pomocą ramek pod podłogą, tak aby były przedstawione w korespondencji z małym otworem (3 x 3 cm²) w podłodze przed każdym otworem na nos.
2. Kontroluj prezentację bodźców za pomocą oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta, aby automatycznie zmieniać bodźce o różnych wymiarach w trakcie eksperymentu.
3. Umieść kamerę na górze aparatu, aby rejestrować podstawową zmienność i aktywność lokomotoryczną za pomocą oprogramowania do monitorowania behawioralnego (np. Ethovision, Anymaze), które może pomóc w eliminacji zwierząt, które mają problemy niezwiązane z funkcjami poznawczymi.

ODORY TEKSTURY ŚWIATŁA brzoskwinia kontra szałwia rzep kontra folia Światła włączone V. Światła wyłączone wanilia kontra lawenda Gruby papier ścierny v. Drobny papier ścierny Czerwony kontra zielony truskawka kontra cynamon Tektura gładka kontra tektura prążkowana Niebieski i żółty grejpfrut kontra oregano Gąbka kontra gładkie tworzywo sztuczne Pomarańczowy kontra biały cytryna kontra morela papier o strukturze plastra miodu kontra folia aluminiowa Napraw światła V. światła

Tabela 1. Przykłady używane w zadaniu ID/ED Operon. Dyskryminacje złożone opierają się na ustalonych kombinacjach par wzorców (zob. rysunek 2 w celu zapoznania się z przykładem sekwencji dyskryminacji). Przykładowe pary z różnych wymiarów są przedstawione w losowych kombinacjach. Bodźcami neutralnymi dla różnych wymiarów są: strumień powietrza bez zapachu; biała księga; brak bodźców świetlnych. Tabela pierwotnie opublikowana w czasopiśmie "The Ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice" (Ostateczne, wewnątrz- i pozawymiarowe zadanie zmiany ustawienia uwagi dla myszy)"¹⁹.

2. Przygotowanie zwierząt

Uwaga: Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki uzyskano od samców myszy C57BL/6J, w wieku od 3 do 7 miesięcy, podczas fazy światła.

1. Zważ myszy, pojedynczo w domu, a następnie dotykaj przez 1 minutę przez trzy alternatywne dni.
2. Po tygodniu aklimatyzacji do pojedynczego mieszkania rejestruj masę ciała i 24-godzinne przyjmowanie pokarmu przez trzy kolejne dni, aby określić masę wyjściową i spożycie pokarmu.
3. Stosuj lekki reżim deprywacji żywności przez 1 tydzień przed treningiem do testu. Sprawdzaj masę ciała zwierząt każdego dnia podczas ograniczania jedzenia przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać około 90% ich wyjściowej masy ciała podczas swobodnego karmienia. Przez trzy kolejne dni przed fazą treningu habituacyjnego podawaj myszom w ich domowej klatce również ≈20 granulek wzmacniających pokarm. Są to granulki spożywcze, które zostaną użyte w kolejnych testach.
   Uwaga: Ograniczenie pokarmu ma na celu zwiększenie motywacji zwierząt do pracy w zadaniu, jednak nie należy przekraczać 10% utraty masy ciała podczas żadnej fazy całej procedury, ponieważ może to prowadzić do nieprawidłowych zachowań i nadmiernego stresu u myszy, co może wpłynąć na wyniki.
   1. Alternatywnie, aby uniknąć trzymania w jednym miejscu, należy pozostawić myszy w grupach (od 2 do 4 w każdej klatce) i zapewnić im dostęp do pokarmu ad libitum przez określony czas po przeprowadzeniu testu. Sprawdzaj masę ciała zwierząt każdego dnia podczas ograniczania jedzenia przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać około 90% ich wyjściowej masy ciała podczas swobodnego karmienia.

3. Przyzwyczajenie

1. Trenuj myszy w ciągu 1-dniowej sesji trwającej 40 minut, aby poruszały się wewnątrz urządzenia bez przegrody drzwiowej, gdzie wbicie nosa w dowolny otwór na nos powoduje dostarczenie granulek do pojemnika na żywność. Podczas tej fazy używaj tylko neutralnych bodźców (Tabela 1) dla wszystkich różnych wymiarów (Habituacja 1).
2. Następnego dnia trenuj zwierzęta przez 40 minut, aby pod koniec każdej próby przemieszczały się z jednej komory do drugiej (Habituacja 2). Używaj tylko neutralnych bodźców dla wszystkich różnych wymiarów. Również w tej fazie, szturchanie nosa w którymkolwiek z otworów na nos skutkuje dostarczeniem granulki do magazynu żywności. Kiedy mysz odzyska nagrodę w magazynie żywności, opuść drzwi działowe, aby umożliwić myszy dostęp do drugiej komory na następną próbę.
3. Trzeciego dnia (Habituacja 3) wytrenuj zwierzęta do wykonywania dwóch prostych rozróżnień (SD1 i SD2; np. rzep vs. film; Wskazówka świetlna włączona vs. sygnalizacja świetlna wyłączona; Brzoskwinia vs. Sage) do kryterium 8 poprawnych odpowiedzi w 10 kolejnych próbach. Nie używaj tych przykładów ponownie podczas kolejnych faz testu.
   1. Na początek umieść mysz w jednej komorze z neutralnymi bodźcami, podczas gdy w drugiej komorze włączane są bodźce; następnie opuść drzwi, aby umożliwić myszowi dostęp do komory z aktywowanymi bodźcami. Mysz musi nauczyć się wybierać otwór w kształcie nosa, w którym prezentowany jest właściwy bodziec. Sesje trwają 40 minut.
   2. Nagrodź wkłucie nosa w odpowiedni otwór za pomocą śrutu, a kiedy mysz wejdzie do magazynu żywności, opuść drzwi działowe, aby umożliwić myszowi dostęp do drugiej komory na następną próbę. Nie nagradzaj wtykania nosa w niewłaściwy otwór i włącz światło w domu na 5 sekund. Następnie opuść drzwi, aby umożliwić myszy dostęp do drugiej komory na następną próbę.
   3. Przeprowadź pierwsze dziesięć prób na każdym etapie jako próby kształtowania: jeśli mysz wybierze niewłaściwy otwór, zapisz błąd, ale nie kończ próby, dopóki mysz nie wbije się również we właściwy otwór. W kolejnych próbach, jeśli mysz wbije się w niewłaściwą dziurę, zapisz błąd i wyłącz wszystkie bodźce wymiarowe, aby zakończyć próbę.
   4. Zakończ każdą sesję po 40 minutach lub jeśli mysz nie udzieli żadnej odpowiedzi przez pięć kolejnych minut, w zależności od tego, co nastąpiło wcześniej. Jeśli mysz nie spełni kryterium w jednej sesji, kontynuuj test następnego dnia.
   5. Jeśli mysz nie jest w stanie osiągnąć kryterium w SD1 lub SD2 Habituacji 3 po 5 sesjach, przerwij testowanie myszy i wyeliminuj ją z badania, ponieważ nie jest ona w stanie wiarygodnie przeprowadzić podstawowych dyskryminacji, które mogłyby następnie wpłynąć na wyniki zadania ID/ED.

Rysunek 2. Przykład zadania ID/ED. Pokazany jest przykład paradygmatu ID/ED "utkniętego w zestawie" i "dwuwymiarowego". Na podstawie książki "The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice" (Ostateczne wewnątrz- i pozawymiarowe zadanie zmiany ustawienia uwagi dla myszy'¹⁹). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Procedura paradygmatu ID/ED 'Stuck in-set'

Uwaga: Dla tej procedury, wcześniej stosowanej zarówno u naczelnych, jak i gryzoni^7,15,16, konieczne jest manipulowanie trzema różnymi wymiarami percepcji dla każdej testowanej myszy. Jeśli chodzi o fazy przyzwyczajenia, wszystkie codzienne sesje testowe rozpoczynają się od umieszczenia myszy w jednej z dwóch komór, w których wszystkie bodźce są neutralne. Przed rozpoczęciem próby sygnały bodźca są włączane w przeciwległej komorze. Następnie drzwi działowe są opuszczane, aby umożliwić myszowi dostęp do drugiej komory, w której włączone są bodźce.

1. Aby wytrenować zwierzę w rozwijaniu zestawu lub uprzedzeń w kierunku określonego wymiaru percepcyjnego (np. zapachu, światła lub tekstury podłogi), wystaw myszy na następujące dyskryminacje przedstawione w tej kolejności (patrz również przykład na rysunku 2):
   1. W przypadku prostej dyskryminacji (SD) należy wprowadzić myszy do wymiaru (zapachu, światła lub tekstury, patrz rysunek 2), który jest istotny we wszystkich zadaniach aż do EDS. Oznacza to, że odpowiedni wymiar to ten, który wskazuje, gdzie znajduje się prawidłowa odpowiedź. Postępując zgodnie z przykładem z rysunku 2, przedstaw dwa zapachy, takie jak wanilia (O1) i lawenda (O2), a następnie wybierz O1 jako prawidłową odpowiedź.
   2. Dla dyskryminacji złożonej (CD) wprowadź drugi wymiar, na przykład światło, który jest nieistotny (tj. nie wskazuje, gdzie jest prawidłowa odpowiedź). Przedstaw dwie lampy (L1 i L2) razem z zapachami (O1 i O2), aby uzyskać dwie możliwe rozróżnienia (patrz przykład na rysunku 2). Poprawne i niepoprawne przykłady są takie same jak w SD.
   3. W celu odwrócenia dyskryminacji złożonej (CDRe) pozostaw wzorce i odpowiedni wymiar bez zmian, ale pozwól zwierzętom nauczyć się, że poprzednio prawidłowy bodziec jest teraz nieprawidłowy. Na przykład wybierz lawendę jako właściwą odpowiedź, a wanilia jest teraz nieprawidłowym wyborem. Te same warunki zostaną spełnione dla innych faz odwrócenia (tj. IDSRe, IDS2Re i EDSRe).
   4. Następnie wybierz przesunięcie wewnątrzwymiarowe (IDS), w którym nowe przykłady są używane zarówno dla istotnych, jak i nieistotnych wymiarów (projekt całkowitej zmiany). Na przykład użyj truskawek i cynamonu (O3 i O4) jako zapachów oraz niebieskiego i żółtego światła (L3 i L4) jako świateł. Upewnij się jednak, że osoby badane nadal postępują zgodnie z tym samym odpowiednim wymiarem, aby znaleźć prawidłową odpowiedź. Te same warunki zostaną znalezione dla drugiego przesunięcia wewnątrzwymiarowego (tj. IDS2).
   5. Jeśli chodzi o poprzednią dyskryminację, niech myszy wykonają odwrócenie przesunięcia wewnątrzwymiarowego (IDSRe). Użyj tych samych warunków, co w CDRe.
   6. W przypadku przesunięcia wewnątrzwymiarowego 2 (IDS2) należy użyć tych samych warunków, co w przypadku przesunięcia międzywymiarowego.
   7. Podobnie, użyj tych samych warunków, co w CDRe dla odwrócenia przesunięcia wewnątrzwymiarowego 2 (IDSRe2).
   8. W przesunięciu pozawymiarowym (EDS) niech myszy wybiorą właściwą dziurę po nowo przedstawionym wymiarze bodźca. Przedstaw parę bodźców z nowego wymiaru, jakim jest faktura. Na przykład użyj grubego papieru ściernego (T1) jako prawidłowej odpowiedzi i drobnego papieru ściernego (T2) jako nieprawidłowego i zaprezentuj im dwa nowe zapachy, na przykład cytryny i moreli (O7 i O8). Wymiar, który wcześniej był istotny, stał się nieistotny. Nie prezentuj już wcześniej nieistotnego wymiaru.
   9. W przypadku odwrócenia pozawymiarowego (EDSRe) należy użyć tych samych warunków, co w CDRe.
2. Mierz wydajność myszy, aż osiągną kryterium 8 prawidłowych wyborów z 10 kolejnych prób, aby ukończyć każdy etap. Ustaw program (patrz Tabela materiałów) tak, aby automatycznie przechodził do następnego etapu po osiągnięciu kryterium. Przerwij codzienną sesję po 40 minutach lub, jeśli mysz nie odpowiada przez 5 kolejnych minut, zakończ sesję i kontynuuj następnego dnia z myszą na tym samym etapie, na którym została przerwana.
   1. Dla każdego etapu zmierz czas potrzebny do osiągnięcia kryterium. Jeśli mysz nie spełni kryterium w jednej sesji, zsumuj całkowity czas potrzebny w kolejnych sesjach. Dla każdej próby zmierz czas od prezentacji bodźców (zapachów, świateł, tekstur) do reakcji szturchnięcia nosem (opóźnienie do odpowiedzi).
3. Na koniec każdej sesji przetrzyj aparat 70% alkoholem.
4. Stosuj zawsze tę samą kolejność dyskryminacji. Jednak losowo zmieniaj wymiary bodźca i pary użytych przykładów i jednakowo reprezentuj je w grupach eksperymentalnych i równoważ je między grupami.
5. Upewnij się, że równo równoważysz wymiary percepcyjne używane w każdej grupie eksperymentalnej i pomiędzy nimi, tak aby każde możliwe przesunięcie ED było reprezentowane (tj. światło do zapachu, światło do tekstury, zapach do światła, zapach do tekstury, tekstura do światła, tekstura do zapachu). Kombinacje przykładów są zbyt liczne, aby umożliwić pełne zrównoważenie; Dlatego, aby zmniejszyć stopnie swobody, zawsze używaj przykładów w parach; na przykład bodziec waniliowy z lawendą itp. (patrz tabela 1).

5. "Dwuwymiarowa" procedura paradygmatu ID/ED

Uwaga: Innym warunkiem do pomiaru zdolności zmiany nastawienia uwagi, używanym zarówno u naczelnych^12,17, jak i u gryzoni¹³, jest paradygmat "dwuwymiarowy". W tym przypadku w całym teście używane są tylko dwa wymiary percepcyjne.

1. W odniesieniu do tego protokołu należy zastosować kolejność dyskryminacji i procedurę, którą należy zastosować, zgodnie z opisem dla protokołu "utknięcia w zestawie" aż do etapu EDS (zob. przykład na rysunku 2):
   1. Dla SD i następnych etapów użyj tych samych par "stuck-in-set", aż do IDS2Re. Jak pokazano na przykładzie na rysunku 2, użyj dwóch zapachów (O1 i O2, użyj O1 jako prawidłowego bodźca).
   2. W przypadku płyty CD, podobnie jak w protokole "stuck-in-set", wprowadź nowy wymiar (na przykład światło, L1 i L2), który jest nieistotny i służyłby jako czynnik zakłócający.
   3. CDRe jest podobny do protokołu "utknął w zestawie", a więc pozostaw próbki i odpowiedni wymiar bez zmian, ale pozwól zwierzętom nauczyć się, że poprzednio prawidłowy bodziec jest teraz nieprawidłowy (np. O1).
   4. W IDS używaj zawsze nowych par bodźców dla obu wymiarów (O3 i O4, L3 i L4, gdzie O3 jest prawidłowym bodźcem).
   5. W przypadku IDSRe poproś myszy, aby wykonały odwrócenie IDS. Wybierz prawidłowy przykład, czyli ten, który był nieprawidłowy podczas IDS (np. O4).
   6. Dla IDS2 wprowadź nowe pary bodźców dla obu wymiarów (O5 i O6, L5 i L6).
   7. Podobnie jak w poprzednich etapach odwrócenia, w IDS2Re niech zwierzęta nauczą się, że poprzednio prawidłowy bodziec jest teraz nieprawidłowy (np. O5).
   8. W przypadku "dwuwymiarowego" protokołu, EDS, myszy muszą wybrać właściwą odpowiedź po tym, jak wcześniej nieistotny wymiar staje się odpowiednim wymiarem. W ten sposób światło jest nowym istotnym wymiarem, który wskazuje na prawidłową reakcję. W szczególności prawidłowe jest światło czerwone (L7). I odwrotnie, poprzednio istotny wymiar (w przykładzie zapach) jest teraz nieistotny
   .
   9. Po EDS, dla odwrócenia (EDSRe), użyj tych samych warunków, co w CDRe. Odpowiedni wymiar jest taki sam jak w EDS, ale poprawne i niepoprawne przykłady są odwrócone. Tak więc, na przykład, zielone światło (L8) jest teraz poprawną odpowiedzią.

6. Analiza danych

1. Zmierz wydajność poprzez: liczbę prób, aby osiągnąć kryterium; czas osiągnięcia kryterium (w minutach); czas od prezentacji bodźców do reakcji szturchnięcia nosem (opóźnienie do odpowiedzi).
2. Do analizy statystycznej należy użyć analiz ANOVA z różnymi etapami (SD, CD, CDRe, IDS, IDSRe, IDS2, IDSRe2, EDS i EDSRe) jako czynnika wewnątrzobiektowego, aby zbadać liczbę badań wymaganych do spełnienia kryteriów, czas potrzebny do ukończenia każdego etapu oraz opóźnienie w odpowiedzi. Przeprowadzanie analiz post-hoc za pomocą testu Newmana-Keulsa. Uwaga: Przyjęta wartość istotności to p<0,05.

Results

Rysunek 2 pokazuje przykład zadania ID/ED. Pary bodźców ("Dyskryminacja 1" lub "Dyskryminacja 2") są losowo prezentowane na każdym etapie, a mysz musi wybrać właściwy bodziec w każdej parze. W tej przykładowej tabeli prawidłowy przykład jest podany pogrubioną czcionką. W pierwszym etapie (SD lub prosta dyskryminacja) bodźce prezentowane w dwóch otworach na nos różniły się w jednym z trzech wymiarów (np. O1: Wanilia vs. O2: Lawenda), a mysz jest nagradzana za wybór właściwego wzorca (np. O1). Gdy badany osiągnie kryterium na tym etapie, rozpoczyna się następny etap (CD lub dyskryminacja złożona), w którym te same wzorce odpowiedniego wymiaru są prezentowane losowo nakładane na wzorce drugiego, ale nieistotnego wymiaru, wprowadzonego jako czynnik zakłócający (np. L1: niebieskie światło vs. L2: żółte światło). Na tym etapie możliwe są dwie różne dyskryminacje ("Dyskryminacja 1" lub "Dyskryminacja 2"). W następnym etapie (CDRe lub odwrócenie dyskryminacji złożonej) sytuacje warunkowe nagrody są odwrócone, ale wzorce i odpowiedni wymiar pozostają niezmienione: mysz musi się nauczyć, że poprzednio prawidłowy bodziec jest teraz nieprawidłowy (np. zapach lawendy jest teraz nagradzany). W kolejnym etapie (IDS lub przesunięcie wewnątrzwymiarowe) wprowadzane są nowe wzorce (zarówno zapachy, jak i światła), ale odpowiedni wymiar (zapach w tym przykładzie) pozostaje taki sam (np. truskawka jest właściwym wyborem). W kolejnym etapie (IDR lub odwrócenie wewnątrzwymiarowe) nieprzewidziane sytuacje związane z nagrodą są odwracane. Po drugim przesunięciu wewnątrzwymiarowym (IDS2 i jego odwróceniu) wprowadzane są nowe przykłady w celu przetestowania przesunięcia pozawymiarowego (EDS), w którym zmienia się odpowiedni wymiar. W EDS "utkniętym w zestawie" mysz musi skupić się na nowym wymiarze (np. Tekstura, T1: gruby papier ścierny vs. T2: drobny papier ścierny), podczas gdy poprzednio istotny wymiar (w tym przypadku zapach) jest teraz wymiarem nieistotnym. W "dwuwymiarowym" EDS wymiar, który wcześniej był nieistotny (w tym przypadku światło), jest teraz wymiarem istotnym. W końcowym etapie (EDSRe lub odwrócenie pozawymiarowe) nieprzewidziane sytuacje związane z nagrodą są odwracane.

Aby uzyskać wiarygodne wyniki, wymiary bodźca użyte w zadaniu powinny być równie dobrze poznane. Jak pokazano na rysunku 3, dyskryminacja wzrokowa, dotykowa i zapachowa w tym nowym aparacie wymagała podobnego czasu (F_(2,64)=0,36; p=0,69) i podobnej liczby prób (F_(2,64)=0,059; p=0,94), aby osiągnąć kryterium, co sugeruje, że zwierzęta są w stanie dokonywać prostych dyskryminacji niezależnie od prezentowanego wymiaru.

Jeśli w fazach testowych zadania opracowano niezawodny zestaw uwagi, wydajność normalnej myszy typu dzikiego powinna być gorsza w fazie EDS w porównaniu z poprzednimi i następnymi etapami, jak stwierdzono w poprzednich badaniach na gryzoniach i naczelnych^12,13. W szczególności w EDS należy stwierdzić znaczne wydłużenie czasu i liczby prób niezbędnych do osiągnięcia kryteriów w porównaniu z etapami IDS. Jak pokazano na rysunku 4, w naszym eksperymencie z protokołem "utknięcia w zestawie" analiza wydajności myszy ujawniła efekt dyskryminacji ze względu na liczbę prób (F_(8,168)=9,23; p<0,0001) i czas (F_(8,168)=8,62; p<0,0001) wymagane do spełnienia kryteriów. Rzeczywiście, myszy potrzebowały więcej prób i więcej czasu, aby rozwiązać etap EDS w porównaniu z etapami CD, IDS, IDS2 i EDSRe (p<0,05; Rysunek 4A-B). Podobnie, analiza wydajności testowanej za pomocą protokołu "dwuwymiarowego" (ryc. 5) wykazała istotny efekt dyskryminacji w odniesieniu do liczby prób (F_(8,72)=3,66; p<0,005) i czasu (F_(8,72)=4,65; p<0,0005) potrzebnego do spełnienia kryteriów. Rzeczywiście, pokazujemy, że myszy potrzebowały więcej prób (p<0,05) i więcej czasu (p<0,05) na rozwiązanie EDS w porównaniu z CD, IDS, IDS2 i EDSRe (Figura 5A-B). Nie należy zaobserwować różnic w zdolnościach do zmiany ruchu między myszami badanymi o różnych wymiarach.

W normalnym myszu typu dzikiego, pierwsze odwrócenie nauki (tj. CDRe) jest trudniejsze niż początkowa dyskryminacja (np. CD). Zgodnie z tym, jak wynika z rysunków 4 i 5, myszy potrzebowały więcej prób (p<0,05; Rysunek 4-5A) i więcej czasu (s<0,05; Rysunek 4-5B) , aby zakończyć ten etap. Co więcej, wydajność odwrócenia powinna ulec poprawie z CDRe na IDSRe i IDS2Re, jak pokazujemy w naszym eksperymencie zarówno z protokołem "utkniętym w zestawie", jak i "dwuwymiarowym". Wyniki te dodatkowo wzmacniają dowody na tworzenie zestawu uwagi poprzez zadanie.

Przez cały czas trwania zadania myszy powinny poprawiać swoją szybkość reagowania w kolejnych etapach. W związku z tym analiza opóźnienia do udzielenia odpowiedzi wykazała istotny efekt dyskryminacji (F_(8,200)=42,59; p<0,0001). W szczególności, jak pokazano za pomocą reprezentatywnych wyników na rysunku 4C, opóźnienie w szturchaniu na etapie IDS2 jest zmniejszone w porównaniu z opóźnieniami na etapach IDS, CD i SD (p<0,0005). Co więcej, opóźnienie w odpowiedzi wzrosło podczas etapu EDS w porównaniu z poprzednimi etapami IDS2 i IDS2Re oraz kolejnymi etapami EDSRe (p<0,05). Zgodnie z tymi wynikami, analiza opóźnienia w odpowiedzi podczas zadania "dwuwymiarowego" wykazała również istotny efekt dyskryminacji (F_(7,63)=9,98; p<0,0005). Jak pokazano na rysunku 5C, opóźnienie w dokonaniu wyboru było zwiększone podczas EDS w porównaniu z poprzednimi IDS2 i IDS2Re oraz kolejnymi EDSRe (p<0,05). Ponieważ opóźnienie odpowiedzi zostało uznane za wskaźnik przetwarzania decyzyjnego¹⁸, wyniki te sugerują ponadto, że myszy napotkały pewne problemy z przetwarzaniem nowej reguły dyskryminacji podczas EDS. Opierając się na wydajności behawioralnej myszy typu dzikiego (Figura 4-5), ustaliliśmy, że minimalna liczba wielkości próby (według analizy mocy R) dla każdej grupy eksperymentalnej powinna wynosić 8.

Rysunek 3. Proste rozróżnienia światła, zapachu i tekstury są równoważne. (A) liczba prób i (B) czas potrzebny do osiągnięcia kryterium prostej dyskryminacji wyłącznie z bodźcami świetlnymi, zapachowymi lub teksturalnymi. Wartości reprezentują średnią ± SEM na rysunkach 2-4. Dane pierwotnie opublikowane w czasopiśmie "The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice" (Zadanie zmiany ustawień wewnątrz- i pozawymiarowych dla myszy)"¹⁹.

Rysunek 4. Wydajność samców myszy typu dzikiego C57BL6J w zadaniu operonowym ID/ED "utkniętym w zestawie". (A) Próby, (B) czas (w minutach) i dni potrzebne do osiągnięcia kryterium na różnych etapach zadania ID/ED Operon przy użyciu paradygmatu ID/ED "utkniętego w zestawie". (C) Czas (w sekundach), jaki upłynął między otwarciem drzwiczek przegrody a reakcją szturchnięcia nosem (opóźnienie w reakcji) na różnych etapach zadania. W sumie przetestowano 26 myszy; 4 myszy zostały wykluczone, ponieważ nie były niezawodne w celu pobrania wzmocnienia pokarmu podczas treningu lub nie były w stanie ukończyć całej procedury. A: *p <0,05 w porównaniu z CD, IDS, IDS2, IDS2Re i EDSRe; B: *p <0,05 w porównaniu z CD, IDS2, IDS2Re i EDSRe. A i B: #p<0,05, ##p<0,005 kontra CD, IDSRe i IDS2Re. C: *p <0,05 w porównaniu z IDS2, IDS2Re i EDSRe. Należy zauważyć, że myszy były w stanie wykonać całe zadanie w ciągu 5-9 dni we wszystkich eksperymentach opisanych na rysunkach 3-4. Dane pierwotnie opublikowane w czasopiśmie 'The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice'¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Wydajność samców myszy typu dzikiego C57BL6J w "dwuwymiarowym" zadaniu operonu ID/ED.(A) Próby, (B) czas (w minutach) i dni potrzebne do osiągnięcia kryterium na różnych etapach zadania ID/ED Operon przy użyciu paradygmatu dwuwymiarowego. orazCzas (w sekundach), jaki upłynął między otwarciem drzwi przegrody a reakcją na szturchanie nosem (opóźnienie do odpowiedzi) na różnych etapach zadania. W sumie przetestowano 13 myszy; 3 myszy zostały wykluczone, ponieważ nie były w stanie niezawodnie pobrać wzmocnienia pokarmowego podczas treningu lub nie były w stanie ukończyć całej procedury. A i B: #p<0,05 w porównaniu z CD i IDS2Re, *p <0,05 w porównaniu z CD, IDS, IDS2, EDSRe. C:*p <0,05 w porównaniu z IDS2, IDS2Re i EDSRe. Dane pierwotnie opublikowane w 'The ultimate Intra- and Extradimensional Attentional Set-Shifting Task for Mice'¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Oś czasu całej procedury protokołu do testowania zadania ID/ED.

scena opis Uwagi dodatkowe Odwołania Zwykła dyskryminacja (SD) Dyskryminacja złożona (CD) Bodźce różnią się w dwóch wymiarach percepcyjnych, takich jak kolor i kształt w przypadku bodźców wizualnych w zadaniu ludzkim lub między bodźcami tekstury i zapachu w przypadku gryzoni Uczenie odwrócone (CDRe – IDSRe – IDS2Re – EDSRe) Dwa przykłady w wymiarze percepcyjnym mają odwrócone warunkowości wzmocnienia, tak że to, co wcześniej było poprawne, jest następnie niepoprawne i na odwrót) W seryjnym uczeniu odwrócenia wydajność poprawia się wraz z kolejnymi odwróceniami w obrębie zestawu. Tak więc etapy odwrócenia (tj. CDRe, IDSRe, IDS2Re) nie tylko oceniają funkcję różnych obszarów korowych, ale także służą 1) tworzeniu zestawu poznawczo-uważnego kwestionowanego przez etap EDS oraz 2) zapobieganiu zabobonnemu warunkowaniu do niezamierzonych aspektów bodźca - Uszkodzenia kory oczodołowo-czołowej u myszy (Bissonette i wsp., 2008) i mnichów (Dias i wsp., 1996) upośledzone uczenie się odwrócone
- fMRI podczas wykonywania odwróconego uczenia się wykazało aktywację kory oczodołowo-czołowej (Hampshire i Owen, 2006) Przesunięcie wewnątrzwymiarowe (IDS – IDS2) Wprowadzane są nowatorskie wzorce, ale ten sam wymiar jest wzmocniony Etapy IDS służą jako kluczowa kontrola wewnętrzna (tj. EDS powinien być trudniejszy niż IDS), a także przyczyniają się do tworzenia zestawu poznawczo-uważnego Niedobór dopaminy w tworzeniu upośledzonego zestawu uwagi PFC (Robbins i Roberts, 2007). Małpy z uszkodzeniami 6-OHDA nie wykazały klasycznej redukcji błędów od pierwszej (IDS1) do ostatniej (IDS5) dyskryminacji, co powinno odzwierciedlać nabycie zestawu uwagi Przesunięcie międzywymiarowe (EDS) Protokół "utknął w zestawie": wcześniej nieistotny wymiar bodźca zostaje zastąpiony nowym wymiarem bodźca, który natychmiast staje się istotny Niepowodzenie w przejściu do nowego odpowiedniego wymiaru nie może być przypisane żadnemu wcześniejszemu poznaniu tego wymiaru, ponieważ nie było to wcześniej doświadczone. Porażka odzwierciedla zatem dążenie do wcześniej istotnego wymiaru - Wykazano, że zmiany w mPFC upośledzają EDS u myszy (Bissonette i wsp., 2008) i mokeys (Dias i wsp., 1996)
- Pacjenci z płatem czołowym są upośledzeni w stanie "perseweracji", ale nie w stanie "dwuwymiarowym" (Owen i wsp., 1993)
- Dopamina w wydajności EDS modulowanej mPFC u myszy (Papaleo i wsp., 2008; Scheggia i wsp., 2014) i szczury (Tunbridge i wsp., 2004) Protokół "dwóch wymiarów": wzmocniono wymiar, który wcześniej był nieistotny Pozorny brak zmiany zestawu uwagi może powstać, gdy badany jest w stanie przenieść uwagę z poprzednio istotnego wymiaru (gdy staje się on nieistotny), ale mimo to nie jest w stanie ponownie skupić uwagi na nowo istotnym wymiarze - Uszkodzenie mPFC u szczurów (Birrell i Brown, 2000) upośledzone przesunięcie EDS
- Wykazano aktywację fMRI podczas wykonywania na EDS (Hampshire i Owen, 2006)

Tabela 2: Etapy zadania ID/ED Operon. Opis etapów zadania, w tym odniesienia do zmian chorobowych i badań farmakologicznych dotyczących roli obszarów mózgu zaangażowanych w różne konstrukty badane podczas zadania.

Discussion

W tym badaniu przedstawiamy nowatorskie zautomatyzowane dwukomorowe zadanie "Operon" ID/ED dla myszy, które jest w stanie wiarygodnie mierzyć elastyczność poznawczą poprzez uczenie się zwrotne, tworzenie zestawów uwagi i przesuwanie. Paradygmat ten jest analogiczny do zadań WCST i ID/ED powszechnie stosowanych u naczelnych u ludzi i zwierząt i przezwycięża główne ograniczenia poprzednich wersji dla gryzoni. Ten paradygmat Operon może być wykorzystany jako nowe skuteczne narzędzie do dużych badań przesiewowych leków i/lub genetycznych istotnych dla funkcji poznawczych (dys)funkcji u myszy o dużym znaczeniu dla medycyny translacyjnej.

To zautomatyzowane zadanie ma następujące zalety w porównaniu z poprzednio używanym zadaniem ID/ED dla gryzoni: (1) ma mniej pracochłonne procedury niż wersje ręczne (np. oprogramowanie reguluje wszystkie fazy zadania, znacznie zmniejszając interwencje eksperymentatora); (2) eliminuje wszelkie źródła subiektywności w mierzonych parametrach (np. eksperymentator nie jest zobowiązany do oceny, czy zwierzę rzeczywiście dokonało odpowiedzi wyboru); (3) eliminuje wszelką możliwość, że myszy mogą podążać za wskazówkami związanymi ze wzmocnieniem w celu udzielenia odpowiedzi (tj. nagroda jest zawsze automatycznie dostarczana do centralnego magazynka); (4) unika arbitralnych warunków środowiskowych (np. korzystanie z labiryntów i aparatury o różnych rozmiarach/materiałach, stosowanie ręcznie przygotowanych bodźców podpowiadających); (5) Umożliwia manipulowanie trzema odrębnymi wymiarami za pomocą szerokiego zakresu różnych bodźców, zgodnie z równoważnymi zadaniami ludzkimi stosowanymi w warunkach klinicznych. Tutaj prezentujemy dane tylko od myszy, ale podobnych korzyści można się spodziewać również w przypadku szczurów.

W zadaniu istnieją krytyczne etapy, które są wewnętrznymi parametrami trafności konstrukcji, które można wykorzystać w celu zidentyfikowania wiarygodnej wydajności zmiany zestawu uwagi: i) gorsza wydajność w EDS w porównaniu z poprzednimi etapami, ii) ogólna poprawa z IDS do IDS2; (iii) specyficzną poprawę w kolejnych etapach odwrócenia, ponieważ im bardziej zwierzę jest szkolone w zakresie odwrócenia wewnątrz zestawu, tym lepiej powinno radzić sobie z kolejnymi odwróceniami wewnątrz zestawu²⁰; (iv) lepsze wyniki w EDSRe w porównaniu z EDS. To nowatorskie zadanie operonowe ID/ED prezentuje wszystkie te cechy, zgodne z wcześniejszymi badaniami na naczelnych przy użyciu zadania CANTAB ID/ED oraz u gryzoni przy użyciu ręcznej wersji "kopania"^12,13. Co więcej, każdy etap tego zautomatyzowanego zadania został przebadany w równoważnej liczbie prób, niezależnie od zastosowanego istotnego/nieistotnego wymiaru (tj. zapachu, tekstury i światła)¹⁹. Wykazało to, że wszystkie użyte bodźce mają podobną istotność i są odpowiednie do tworzenia nastawienia uwagi i/lub zmiany biegu. Nasze eksperymenty pokazują, że trudność w rozwiązaniu EDS jest również podkreślona przez wzrost opóźnień odpowiedzi. Czas przetwarzania wydłuża się, aby zachować optymalną dokładność podczas ostrzejszych dyskryminacji²¹. W związku z tym, biorąc pod uwagę opóźnienie w reagowaniu jako wskaźnik szybkości przetwarzania informacji, podejmowania decyzji i rozwiązywania problemów¹⁸, wolniejsze opóźnienia podczas EDS mogą odzwierciedlać strategię przyjętą w celu zmierzenia się z trudnościami w rozwiązaniu problemu zmiany zestawu.

Wykazaliśmy, że nasz nowatorski aparat może być skutecznie używany z bardziej "klasycznym" paradygmatem zmiany zestawu uwagi, wykorzystującym tylko dwa wymiary w całym teście (tj. dwuwymiarowym) lub z paradygmatem utkniętym w układzie implikacyjnym, implikującym użycie trzech wymiarów. W zależności od interesującej nas domeny poznawczej możliwe jest wybranie najbardziej odpowiedniego protokołu. Oba te paradygmaty były wcześniej stosowane u ludzi, naczelnych i gryzoni^7,12-17. Jednak procedura utknięcia w zestawie jest w stanie rozróżnić różne składniki przesunięcia zestawu i jest bardziej selektywną miarą funkcjonowania płata czołowego u pacjentów^7,22. Co więcej, jednym z problemów, który może wystąpić w paradygmacie dwuwymiarowym , jest wyuczona nieistotność , która może zniekształcić wyniki. Wyuczona perseweracja nieistotności odnosi się do niezdolności do zwrócenia uwagi i uczenia się informacji, które wcześniej były nieistotne⁷. Taka sytuacja może wystąpić w fazie EDS paradygmatu dwuwymiarowego , ponieważ od podmiotu wymaga się przeniesienia uwagi na wymiar wcześniej nieistotny. W tym przypadku w zasadzie niemożliwe jest rozróżnienie, czy deficyt EDS jest spowodowany niezdolnością do odwrócenia uwagi od poprzednio istotnego wymiaru i/lub niemożnością przeniesienia uwagi na wcześniej nieistotny wymiar. Upośledzenie może więc po prostu odzwierciedlać aktywne hamowanie reagowania na wymiar, który wcześniej stał się nieistotny ze względu na jego losowe powiązanie ze wzmacniającą informacją zwrotną. W przeciwieństwie do tego, w stanie utknięcia w ustaleniu , niepowodzenie w przejściu do nowego odpowiedniego wymiaru nie może być przypisane jakiemukolwiek wcześniejszemu uczeniu się o tym wymiarze, ponieważ nie było to wcześniej doświadczane. Porażka odzwierciedla zatem dążenie do wcześniej istotnego wymiaru. Podsumowując, nawet jeśli u normalnych myszy typu dzikiego paradygmaty "utknięcia w zestawie" i "dwuwymiarowej" zmiany zestawu uwagi mogą dawać podobne wyniki, zdecydowanie preferujemy persewerację utkniętą w zestawie z powodów omówionych powyżej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ściany z pleksi i podłoga aluminiowa	Wykonane		(16 x 16 x 16 cm na każdą komorę)
Drzwi z pleksi	Komputer PC wykonany na
	Dell Inc.
Oprogramowanie MED-PC IV 	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	wykonane na zamówienie	Użyj kodu operacyjnego, aby automatycznie kontrolować prezentację bodźców i sekwencję etapów
Otwór na nos	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-314M
Magazyn żywności	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-303M
Dozownik pelletu do wzmacniania żywności	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-203-14P
Oświetlenie domowe	Med Associates, St. Albans, VT, Stany Zjednoczone)	ENV-315M
Olfaktometr rozcieńczania	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	PHM-275
Płynne substancje zapachowe	(Sigma Aldrich, Dorset, Wielka Brytania)		(patrz Tabela 1)
Olej mineralny	(Sigma Aldrich, Dorset, Wielka Brytania)	M5904
Pompa powietrza i próżnia	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	Próżnia PHM-280	jest zalecana do usuwania zapachów na koniec każdej próby
Diody elektroluminescencyjne (LED)			Przezroczysty klejnot o wysokiej intensywności, 3 mm
Tekstury			3x3 cm
Granulki wzmacniające	TestDiet	5TUL 14mg	Dla myszy