Analiza porównawcza ludzkiego hormonu wzrostu w surowicy przy użyciu testów SPRi, Nano-SPRi i ELISA

Podsumowanie

Proponowana praca ocenia potencjał diagnostyczny testów bezpośredniego i wzmocnionego powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPRi), szczególnie do wykrywania rekombinowanego ludzkiego hormonu wzrostu w wzbogaconej ludzkiej surowicy, poprzez bezpośrednie porównanie wyników SPRi z dostępnym na rynku zestawem do testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Streszczenie

Czułe i selektywne metody wykrywania ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) w szerokim zakresie stężeń (wysokie poziomy 50-100 ng ml⁻¹ i minimalne poziomy 0.03 ng ml⁻¹) we krwi krążącej są niezbędne, ponieważ zmienne poziomy mogą wskazywać na zmienioną fizjologię. Na przykład zaburzenia wzrostu występujące w dzieciństwie można zdiagnozować, mierząc poziom hGH we krwi. Ponadto, niewłaściwe stosowanie rekombinowanego hGH w sporcie nie tylko stanowi problem etyczny, ale także stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia osoby nadużywającej. Jedna z popularnych strategii pomiaru nadużywania hGH polega na wykrywaniu stosunku 22 kDa hGH do całkowitego hGH, ponieważ poziomy endogenne inne niż 22 kDa spadają po podaniu egzogennego rekombinowanego hGH (rhGH). Obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPRi) to narzędzie analityczne, które umożliwia bezpośrednie (bezznacznikowe) monitorowanie i wizualizację oddziaływań biomolekularnych poprzez rejestrowanie zmian współczynnika załamania światła w sąsiedztwie powierzchni czujnika w czasie rzeczywistym. Natomiast najczęściej stosowana metoda kolorymetryczna, test immunoenzymatyczny (ELISA), wykorzystuje przeciwciała detekcyjne znakowane enzymami do pośredniego pomiaru stężenia analitu po dodaniu substratu, który wywołuje zmianę koloru. Aby zwiększyć czułość wykrywania, amplifikowany SPRi wykorzystuje format testu kanapkowego i kropki kwantowe bliskiej podczerwieni (QD) w celu zwiększenia siły sygnału. Po bezpośrednim wykryciu SPRi rekombinowanego rhGH w wzbogaconej surowicy ludzkiej, sygnał SPRi jest wzmacniany przez sekwencyjne wstrzyknięcie przeciwciała detekcyjnego pokrytego QD w bliskiej podczerwieni (Nano-SPRi). W tym badaniu oceniono potencjał diagnostyczny bezpośredniego i amplifikowanego SPRi do pomiaru rhGH w ludzkiej surowicy i porównano bezpośrednio z możliwościami dostępnego na rynku zestawu ELISA.

Wprowadzenie

Ludzki hormon wzrostu (hGH) to peptyd składający się z 191 aminokwasów (22 kDa) wytwarzany przez przysadkę mózgową i bezpośrednio uwalniany do krwiobiegu. Interakcje między peptydem podwzgórza hormonem uwalniającym hormon wzrostu (GHRH) a somatotropiną indukują pulsacyjne wydzielanie hGH. W rezultacie poziomy hGH wahają się od wysokich w zakresie 50-100 ng/ml do niskich w zakresie 0,03 ng/ml¹. Niedobór lub nadmiar hGH w organizmie może wywoływać szeroki zakres nieprawidłowych objawów fizjologicznych. Na przykład nadmierny poziom hGH może prowadzić do gigantyzmu² i cukrzycy³. Obniżony poziom hGH powoduje niski poziom cukru we krwi u noworodków oraz słabą gęstość kości i depresję u dorosłych⁴.

Podawanie rekombinowanej formy hGH (rhGH) poprawia beztłuszczową masę mięśniową przy jednoczesnej redukcji tkanki tłuszczowej. W związku z tym, substancja ta stała się lekiem z wyboru dla sportowców zawodowych i amatorów, ponieważ poprawia siłę fizyczną, która daje przewagę w sporcie wyczynowym. rhGH jest zakazany przez Światową Agencję Antydopingową (WADA)^5,6 i wiele wysiłków międzynarodowych badaczy skupiło się na opracowaniu testów, które mogą wykryć jego obecność lub działanie anaboliczne.

Test immunoenzymatyczny (ELISA) był preferowaną metodą oznaczania hGH we krwi pełnej⁷. Chociaż ELISA jest niezawodną techniką oferującą dobrą czułość i selektywność, jest stosunkowo czasochłonna i pracochłonna. Ponadto test ELISA opiera się na pośrednim wykrywaniu hGH za pomocą znaczników enzymatycznych. Natomiast powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) pozwala na bezpośrednie wykrywanie hGH bez użycia etykiet w czasie rzeczywistym. Zasada wykrywania SPR polega na tym, że powierzchnia detekcyjna składa się z pryzmatu pokrytego cienką warstwą metalu (złota lub srebra); Kiedy monochromatyczne spolaryzowane światło oddziałuje z powierzchnią metalu, generowane są "plazmony powierzchniowe". Wiązanie analitu z receptorem powierzchniowym unieruchomionym na powierzchni metalu zaburza warunki rezonansowe, powodując przesunięty spadek rezonansu, który można następnie skorelować ze stężeniem analitu. Obecnie na rynku dostępne są bioczujniki oparte na SPR, które oferują bezznacznikową technikę monitorowania zdarzeń wiązania biomolekularnego i reakcji biochemicznych w czasie rzeczywistym^8-10. Niedawno SPRi został opracowany w odpowiedzi na potrzebę multipleksowania (tj. monitorowania wielu zdarzeń wiązania jednocześnie), co nie było możliwe w klasycznych biosensorach SPR. W ten sposób SPRi pojawił się jako narzędzie do jednoczesnego monitorowania kilku powiązanych zdarzeń. Obecne systemy SPRi opierają się na obrazowaniu mikroskopowym powierzchni, która jest wzbudzana światłem pod określonym kątem i o określonej długości fali¹⁰. Obraz jest następnie rejestrowany na matrycy CCD (Charge-Coupled Device).

Do tej pory opracowano kilka testów opartych na SPR, które wykrywają hGH^11-14. Jedna szczególna strategia, znana jako metoda izoformowa¹⁵, opiera się na wykrywaniu stosunku 22 kDa hGH do całkowitego hGH, ponieważ poziomy endogenne inne niż 22-kDa spadają po podaniu egzogennej rhGH. Ostatnio de Juan-Franco i wsp.^{W czasopiśmie 11} poinformowano o opracowaniu immunoczujnika opartego na spr do selektywnego wykrywania izoform hGH o stężeniach 22 kDa i 20 kDa w próbkach surowicy ludzkiej. Przeciwciała monoklonalne specyficzne dla każdej izoformy unieruchomiono bezpośrednio na złotym czujniku, co pozwoliło na jednoczesny pomiar obu izoform w jednym wstrzyknięciu z granicą wykrywalności na poziomie 0,9 ng ^ml-1. Alternatywnie, SPR został użyty do badań przesiewowych przeciwciał o wysokiej swoistości wobec hGH¹³. Jeśli stężenie docelowego analitu spadnie poniżej granicy wykrywalności systemu SPRi (16-19 dla różnych rodzajów analitu i powierzchni.

W tej pracy zbadano potencjał analityczny biosensorów opartych na SPRi i Nano-SPRi, szczególnie do wykrywania rhGH w wzbogaconej ludzkiej surowicy i porównania jego zdolności wykrywania bezpośrednio do ELISA. Następujące parametry zostaną poddane przeglądowi i rozważone: czas detekcji, czułość, profil kinetyczny, odtwarzalność i swoistość.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i próbek białek do SPRi

1. Przygotować 100 ml roztworu soli fizjologicznej (PBS) o niskiej zawartości soli fizjologicznej i fosforanów o niskiej zawartości soli, zawierającego 10 mM fosforanu, 150 mM chlorku sodu i pH 7,4.
2. Przygotować 50 ml roztworu PBS o wysokiej zawartości soli zawierającego 10 mM fosforanu, 750 mM chlorku sodu i pH 7,4.
3. Przygotować 5 ml 10 mM octanu sodu.
4. Przygotować zapas 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w roztworze PBS o niskiej zawartości soli.
5. Przygotować roztwór podstawowy rekombinowanego ludzkiego hormonu wzrostu (rhGH) o stężeniu 1 μg/ml w roztworze PBS o niskiej zawartości soli.
6. Przygotować roztwory podstawowe przeciwciała anty-rhGH i kontroli ujemnej o stężeniu 100 μg/ml.

2. Przygotuj chip SPRi do macierzy przeciwciał

1. Oczyść chip przez sonikację w 120 ml stabilizowanego roztworu piranii (3:1 stężony kwas siarkowy do 30% nadtlenku wodoru) przez 90 minut w temperaturze 50 °C, a następnie spłukuj i sonikuj wodą przez 5 minut. Następnie opłucz wióry etanolem i osusz strumieniem azotu.
2. Umieść złoty chip w komorze UV/Ozonu na 30 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
3. Dodać 150 mg kwasu 11-merkaptoundekanowego do 20 ml etanolu w probówce zawierającej mieszadło i nakrętkę probówki.
4. Umieść chip w probówce i probówce/chipie mikrofalowym o mocy 50 W i temperaturze 50 °C na 5 minut.
5. Opłucz chipsy etanolem i moczyć w etanolu przez 5 minut.
6. Następnie spłucz wodą i moczyć w wodzie przez 5 minut.
7. Dodać 150 mg 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu do 20 ml wody w probówce zawierającej mieszadło i nakrętkę probówki. Chip mikrofalowy jak w kroku 2.4.
8. Opłucz frytki wodą i moczyć w wodzie przez 5 minut.
9. Dodaj 150 mg N-hydroksysukcynimidu do 20 ml wody w probówce zawierającej mieszadło i nakrętkę probówki. Chip mikrofalowy jak w kroku 2.4.
10. Opłucz frytki wodą i moczyć w wodzie przez 5 minut.
11. Przygotuj 250 μM glikolu polietylenowego (PEG, 800 Da) w 20 ml wody w probówce zawierającej mieszadło i nakrętkę probówki. Chip mikrofalowy jak w kroku 2.4.
    Uwaga: Podgrzewanie PEG800 w kuchence mikrofalowej na powierzchni czujnika jest wykonywane jako etap blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek surowicy i kompleksów kropek kwantowych wykorzystanych później w eksperymencie. Osiąga się to dzięki temu, że PEG800 reaguje z niezajętymi gołymi miejscami złota na chipie.
12. Opłucz frytki wodą i moczyć w wodzie przez 5 minut.
13. Przygotować 15 μg/ml roztworu przeciwciała anty-rhGH i roztworu kontroli ujemnej anty-immunoglobuliny G (anty-IgG) i dodać 10 μl każdego roztworu przeciwciała do studzienki na płytce 384-dołkowej.
14. Zaprojektuj wzór plamkowania w mikromacierzy (4 x 7 ćwiartek dla każdej próbki) i nałóż chip z przeciwciałami za pomocą trzpienia z końcówką teflonową o średnicy 500 μm.
15. Inkubuj nakrapiany chip przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i w wilgotnej atmosferze 75% lub wyższej.
16. Opłucz i namocz chipsy w wodzie przez 5 minut. Następnie wysuszyć wióry strumieniem azotu.

3. Konfiguracja i blokowanie eksperymentu SPRi

1. Zainicjuj instrument i wybierz katalog. Wybierz kamerę czasu rzeczywistego i uruchom pompę strzykawkową z prędkością 1 ml/min na 10 ml odgazowanej wody. Włóż chip do instrumentu i wstrzykuj wodę, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte.
2. Po wypłukaniu chipa 10 ml wody rozpocznij akwizycję obrazu, a następnie przełącz bufor na PBS o niskiej zawartości soli i pozwól mu pracować z prędkością 1 ml/min przez 5 ml, a następnie zwolnij prędkość przepływu do 20 μl/min przez 20 minut.
3. Wybierz obraz o wysokim kontraście , który pokazuje unieruchomione przeciwciała zauważone na chipie.
4. Wybrać i zdefiniować pojedyncze okrągłe plamki o wielkości 400 μm odpowiadające unieruchomionym przeciwciałom.
5. Po tym, jak instrument prześledzi krzywe plazmonu, wybierz kąt roboczy, który ma największe nachylenie w krzywych odbicia.
6. Przepuść przez system działający bufor o stężeniu 20 μl/min PBS o niskiej soli, aż sygnał ze wszystkich wybranych miejsc ustabilizuje się.
7. Załadować BSA (100 μg/ml) w buforze bieżącym do pętli próbki (150 μl) z zaworem wtryskowym w pozycji obciążenia. Następnie przestaw zawór do pozycji wtrysku, aby wstrzyknąć roztwór do komory przepływowej.
   Uwaga: BSA jest wstrzykiwany w celu kowalencyjnego związania się z powierzchnią reaktywną aminy, pozostała niezwiązana BSA zostanie zmyta z powierzchni poprzez płukanie buforem.
8. Wstrzyknąć 150 μl roztworu 10 mM octanu sodu na powierzchnię, a następnie wstrzyknąć 150 μl PBS o wysokiej zawartości soli.
9. Wstrzyknąć 150 μl etanoloaminy (1 mM) w celu dezaktywacji powierzchni reaktywnej aminy.
10. Wstrzyknąć 150 μl 10 mM octanu sodu, aby umyć powierzchnię.
11. Następnie należy przełączyć uruchomiony bufor na PBS o stężeniu 50 μg/ml BSA przy natężeniu przepływu 250 μl/min, co daje łącznie 5 ml.
    Uwaga: 50 μg/ml BSA dodaje się do buforu bieżącego w celu dodatkowego zablokowania powierzchni poprzez niekowalencyjne zajęcie miejsc niespecyficznych i odbywa się to w celu dalszego zmniejszenia niespecyficznego wiązania białek surowicy z powierzchnią.
12. Zmienić natężenie przepływu na 5 μl/min i pozostawić do ustabilizowania się przez 20 minut.

4. Wykrywanie ludzkiego hormonu wzrostu za pomocą SPRi

1. Przygotować roztwór o ustalonym stężeniu rhGH (30 000 pg/ml; 250 pg/ml; 25 pg/ml; 2,5 pg/ml i 0,25 pg/ml) w 10% surowicy i rozcieńczyć w PBS zawierającym 1 mg/ml BSA.
2. Przygotować roztwór w proporcji 2:1, dodając 1 μl przeciwciał detekcyjnych anty-rhGH znakowanych biotyną (6 μM) do 3 μl kropek kwantowych pokrytych streptawidyną w bliskiej podczerwieni (1 μM) w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i inkubować przez 30 minut w celu skutecznego sprzężenia.
3. Wstrzyknąć 150 μl roztworu surowicy ludzkiej z dodatkiem hGH do pętli iniekcyjnej. Powoduje to silny wzrost sygnału, po którym następuje powolny spadek z niespecyficznie związanej surowicy spłukiwanej z powierzchni.
4. Gdy sygnał się ustabilizuje, umyj powierzchnię roztworem 450 mM chlorku sodu dodanym do uruchomionego bufora.
5. Rozcieńczyć roztwór przeciwciał wykrywających anty-rhGH i kropek kwantowych do stężenia 10 nM (2:1) z działającym buforem (PBS o stężeniu 50 μg/ml BSA) i wstrzyknąć do celi przepływowej.

5. Analiza danych SPRi

Uwaga: Po wstrzyknięciu ludzkiej surowicy z dodatkiem rhGH i wzmacniacza kropek kwantowych, następuje wzrost zmiany odbicia z powodu wzmocnionego przesunięcia krzywych plazmonu. Powoduje to powstanie obrazu różnicowego przedstawiającego obraz w skali szarości skorelowany z sygnałem na chipie.

1. Zaimportuj dane do programu do analizy danych. Wykreślić sygnał SPRi (% odbicia) w funkcji czasu (s) i określić różnicę między plamkami przeciwciał anty-rhGH i przeciwciał kontroli ujemnej po płukaniu o wysokiej zawartości soli.

6. Protokół ELISA (Dzień 1)

1. Przechowywać wszystkie składniki testu zawarte w zestawie rhGH ELISA w temperaturze 2-8 °C. Obejmuje to płytki dołkowe pokryte przeciwciałem anty-rhGH, wzorce (0-5) w surowicy owczej, kontrole (1 i 2) w surowicy ludzkiej, bufor sprzężony, (200x) bufor do płukania, chromogen TMB (tetrametylobenzydyna) i odczynnik zatrzymujący.
2. Ustaw odczynniki i postępuj zgodnie z metodami opisanymi w komercyjnym protokole zestawu ELISA.
3. Po pierwsze, przed otwarciem opakowania foliowego pozwól 96-dołkowym pokrytym przeciwciałem anty-rhGH ogrzać się do temperatury pokojowej.
4. Następnie usunąć żądaną liczbę pasków z 8 dołkami do oznaczenia i ponownie zamknąć opakowanie foliowe zawierające pozostałe studzienki i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
5. Przygotować wzorce przez rozpuszczenie w 2 ml wody destylowanej dla wzorca #0, w 1 ml wody destylowanej dla wzorców (1-5) i w 1 ml wody destylowanej dla próbek kontrolnych (1&2). Poniżej znajduje się tabela odpowiednich stężeń wzorców i kontroli (tabela 1):

pkt. pkt. pkt.

Standardów	Stężenie (ng/ml)
0	0
1	0,17
cyfra arabska	0,94
3	Godzina 2,63
4	Rozdział 10.4
5	26,9
Sterowanie #1	1,22 ± 0,33 ng/ml
Sterowanie #2	4,97 ± 1,25 ng/ml

Tabela 1. Koncentracje wzorców i kontroli zawartych w komercyjnym zestawie ELISA.

6. Przygotować próbki, które zawierają hormon rhGH w 10% surowicy ludzkiej w następujących stężeniach (tabela 2):

pkt. pkt.

próbka	Stężenie (ng/ml)
1	0,025
cyfra arabska	0,2
3	0,5
4	Rozdział 2.5
5	10
6	Rozdział 30

Tabela 2. Stężenia próbek rhGH przygotowane w 10% surowicy.

7. Dodać 50 μl każdego wzorca, próbki kontrolnej i próbki do każdego dołka (w trzech egzemplarzach). Uszczelnić studzienki i inkubować z wzorcami, próbkami kontrolnymi i próbkami rhGH O/N w temperaturze 4 °C pod delikatnym wstrząsaniem.

7. Protokół ELISA (Dzień 2)

1. Wyjmij płytkę z wytrząsarki i pozwól jej ogrzać się do temperatury RT (15-20 min) przed przystąpieniem do testu.
2. Usuń Anti-rhGH-HRP, sprzężony bufor, przemyj bufor (200x), chromogen TMB (tetrametylobenzydyna) i zatrzymaj odczynnik z lodówki i pozwól ogrzać się do RT.
3. Przygotowanie odczynnika: (zgodnie ze specyfikacją producenta)
   1. Rozcieńczyć Anti-rhGH-HRP 40x sprzężonym buforem. Przygotuj bufor do płukania, rozcieńczając 200x wodą destylowaną.
4. Dodać 50 μl koniugatu anty-rhGH-HRP do każdego dołka, uszczelnić dołki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie wstrząsając.
5. Zdekantować roztwór ze studzienek, odwrócić płytkę i osuszyć na chłonną tkankę. Następnie dodaj 200 μl buforu do płukania do każdej studzienki.
6. Zdekantować roztwór myjący i stuknąć do sucha w chłonną chusteczkę. Powtórz ten krok 3 razy.
7. Dodaj 100 μl chromogenu do każdej studzienki w ciągu 15 minut po etapie mycia. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, delikatnie wstrząsając. Roztwory zmieniają kolor z bezbarwnego na niebieski.
8. Dodać 100 μl odczynnika zatrzymującego do każdego dołka. Roztwory zmieniają kolor z niebieskiego na żółty. Natychmiast odczytać absorbancję każdej studzienki przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
9. Wykreślić krzywą standardową dla podanych norm (0-5). Następnie wykreślić gęstość optyczną rhGH w 10% próbkach surowicy w funkcji stężenia każdej próbki.

Wyniki

Wydajność SPRi i Nano-SPRi (SPRi z wykorzystaniem NanoEnhancers) porównano z metodą ELISA w celu wykrywania rhGH w złożonym środowisku. Różnice w konfiguracji tych metod opisano tutaj krótko. W przypadku SPRi (detekcja bezpośrednia, Rycina 1), przeciwciało wychwytujące jest unieruchomione na powierzchni, a następnie wstrzykuje się próbkę i bezpośrednio mierzy wiązanie analitycznego z powierzchnią sensora w czasie rzeczywistym i bez użycia znaczników. Natomiast w metodzie Nano-SPRi (Rycina 1), po związaniu analitycznego z powierzchnią sensora, następuje kolejne wstrzyknięcie kropek kwantowych pokrytych przeciwciałami detekcyjnymi w celu wzmocnienia sygnału SPRi.

Rycina 1. Schematyczne przedstawienie porównania trybu bezpośredniego (SPRi) i trybu wzmocnionego (Nano-SPRi) detekcji rhGH w surowych próbkach. Ligandy (rhGH lub przeciwciała specyficzne dla IgG) zostały unieruchomione w formacie macierzy na biochipie SPRi. Białko docelowe (rhGh) dodane do ludzkiej surowicy i wprowadzone na powierzchnię sensora jest wykrywane bezpośrednio (SPRi) lub sekwencyjnie uwydatniane za pomocą NanoEnhancers (Nano-SPRi). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

W przypadku metody ELISA płytki wielodołkowe są dostarczane uprzednio funkcjonalizowane przeciwciałem wychwytującym, a po wprowadzeniu próbki dochodzi do związania badanego anality. Następnie wprowadza się przeciwciało detekcyjne, po czym dodaje się substrat. Gęstość optyczną mierzy się przy 450 nm. W niniejszym badaniu wykorzystano komercyjny zestaw ELISA (Rysunek 2) do pomiaru rhGH dodanego do 10% ludzkiej surowicy.

Rycina 2. Schematyczna reprezentacja procedury testu ELISA. Białko rhGH (niebieskie owale) jest wprowadzane do dołków, które zostały uprzednio funkcjonalizowane przeciwciałami monoklonalnymi (żółte) specyficznymi dla rhGH. Oddziaływania nieswoiste są eliminowane poprzez płukanie dołków buforem do mycia, a następnie wprowadzenie przeciwciała detekcyjnego funkcjonalizowanego peroksydazą chrzanową (HRP, fioletowe). Roztwór zmieni kolor po dodaniu substratu tetrametylobenzydyny (TMB, złoty). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 3 przedstawia krzywą miareczkowania rhGH dodanego do 10% surowicy ludzkiej, wykreśloną w funkcji otrzymanej wartości OD przy 450 nm. Zaobserwowano dobrą odpowiedź liniową, a granica wykrywalności została określona na 1 ng/ml. Współczynnik zmienności (CV) wyniósł 6,5%, co wskazuje na dobrą powtarzalność.

Rycina 3. Analiza danych ELISA. Stężenie rhGH dodanego do surowicy przedstawiono w funkcji uzyskanej OD przy 450 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Następnie za pomocą SPRi oceniono detekcję rhGH dodanego do ludzkiej surowicy. Bezpośrednia detekcja rhGH pozwoliła na uzyskanie odpowiedniej krzywej gradientu stężeń (Rysunek 4), gdzie każdy punkt reprezentuje średnią wartość różnicy odblaskowości obliczoną z trzech krzywych kinetycznych SPRi dla każdego stężenia. Granica wykrywalności (LOD) została określona na poziomie 3,61 ng/ml. Test bezpośredniej detekcji SPRi charakteryzował się wysoką powtarzalnością, ponieważ współczynnik zmienności (CV) testu wyniósł zaledwie 4,1%.

Rycina 4. Bezpośrednia detekcja SPRi hGH dodanego do 10% ludzkiej surowicy. Wynikowy znormalizowany wykres kinetyki SPRi po wstrzyknięciu różnych ilości hGH dodanego do ludzkiej surowicy, a następnie wstrzyknięciu buforu o wysokim zasoleniu (przerywana linia pionowa) w celu usunięcia niespecyficznych oddziaływań. Krzywa gradientu stężeń reprezentująca wiązanie różnych ilości hGH dodanego do ludzkiej surowicy z powierzchnią sensora, która została uprzednio funkcjonalizowana biotynilowanym przeciwciałem specyficznym dla hGH. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby zwiększyć czułość biosensora SPRi, na powierzchnię sensora sekwencyjnie wprowadzono NanoEnhancers (kropki kwantowe QD uprzednio funkcjonalizowane przeciwciałami detekcyjnymi), aby uwidocznić obecność rhGH dodanego do ludzkiej surowicy. Po odjęciu tła NanoEnhancers pozwoliły na wzmocnienie odpowiedzi biosensora do poziomu 7,9%, przy jednoczesnej minimalnej zmianie sygnału w kontrolowanych obszarach zainteresowania (przeciwciała specyficzne dla immunoglobulin G (IgG) – zmiana odbiciowości o 0,38%; rycina 5). Obrazowanie powierzchni sensora wykazało, że tylko obszary zainteresowania z unieruchomionymi przeciwciałami specyficznymi dla rhGH wykazują największą zmianę kontrastu, co bezpośrednio potwierdza odpowiedź kinetyczną sensorgramu.

Rysunek 5. Detekcja rhGH przy użyciu testu kanapkowego z dodatkiem 10% surowicy ludzkiej. Wykres kinetyczny SPRi po wstrzyknięciu rhGH (30 ng/ml) w buforze (10 mM PBS, 150 mM chlorku sodu, pH = 7.4) na uprzednio funkcjonalizowany chip z kwasem 11-merkapto-undekanowym / przeciwciałem specyficznym dla rhGH oraz kontrolnym przeciwciałem IgG, a następnie zablokowany BSA, po czym dodano kropki kwantowe pokryte przeciwciałem detekcyjnym (NanoEnhancers). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby zademonstrować praktyczną użyteczność biosensora Nano-SPRi, oceniono zakres pomiarowy rhGH w próbkach surowych. W wyniku zastosowania NanoEnhancers uzyskano rozszerzony zakres pracy od 30 000 pg/ml do 0,25 pg/ml (Rysunek 6). Należy zauważyć, że każdy punkt na krzywej miareczkowania stanowi średnią z trzech niezależnych eksperymentów. W konsekwencji obliczona dolna granica wykrywalności wyniosła 9,20 pg/ml, a współczynnik zmienności wyniósł 20%.

Rycina 6. Detekcja hGH dodanego do ludzkiej surowicy za pomocą Nano-SPRi. Znormalizowany wykres kinetyki SPRi przedstawiający sygnał wzmocniony przez hGH_specific_Anti-QDs dla próbek ludzkiej surowicy z dodatkiem różnych stężeń hGH. Pionowa przerywana linia (szara) oznacza moment wstrzyknięcia buforu płuczącego. (b) Krzywa gradientu stężeń reprezentująca wiązanie NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDs) do powierzchni sensora uprzednio funkcjonalizowanej kwasem 11-merkapto-undekanowym / przeciwciałem specyficznym dla hGH, po wstrzyknięciu różnych ilości hGH dodanego do ludzkiej surowicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Następnie porównano zmiany zachodzące w krzywej odblaskowości SPR w funkcji stężenia dla metody bezpośredniej oraz metody bioanalizy z użyciem NanoEnhancer (Rysunek 7). W technice detekcji bezpośredniej, dla zakresu od 25 do 0,25 pg/ml, sygnał zaczął osiągać plateau, co nie jest zaskakujące, ponieważ stężenia te spadają poniżej granicy detekcji (LOD) wynoszącej 3 ng/ml (Rysunek 7). Podobnie w technice wzmocnionej, dla stężeń poniżej LOD wynoszącej 9,2 pg/ml, sygnał zaczął osiągać plateau i nie wykazywał praktycznie żadnych zmian.

Rycina 7. Analiza porównawcza SPRi i Nano-SPRi. Ten wykres słupkowy przedstawia procentową zmianę odzwierciedlania (%R) po wprowadzeniu rhGH dodanego do ludzkiej surowicy (detekcja bezpośrednia), a następnie po wstrzyknięciu NanoEnhancers (detekcja wzmocniona) dla stężeń 30 000 pg/ml, 250 pg/ml, 25 pg/ml, 2,5 pg/ml i 0,25 pg/ml. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ponadto oceniono specyficzność biosensora Nano-SPRi. Jako kontrolę wstrzyknięto insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1) dodany do ludzkiej surowicy, ponieważ hGH stymuluje wydzielanie IGF-1 poprzez receptor hormonu wzrostu na błonie hepatocytów. Po wstrzyknięciu IGF-1 w surowicy kolejno podano NanoEnhancers, a odpowiedź sygnału SPR nie wykazała żadnego specyficznego wiązania (Rysunek 8). Jednakże, gdy do tego samego miejsca funkcjonalizowanego przeciwciałem przeciwko rhGH wstrzyknięto próbkę surowicy z dodatkiem rhGH, zaobserwowano wzmocnienie sygnału. Podsumowując, platforma Nano-SPRi wykazała doskonałą specyficzność i selektywność w stosunku do rhGH.

Rycina 8. Ocena selektywności Nano-SPRi względem rhGH. Odpowiedź biosensora Nano-SPRi po wstrzyknięciu rhGH (czarny) i IGF-1 (czerwony) do wzbogaconej surowicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W celu określenia korelacji między intensywnością sygnału SPRi a wartościami gęstości optycznej w badaniu ELISA przeprowadzono analizę korelacji z wykorzystaniem współczynnika korelacji Pearsona (Rysunek 9). Za istotną uznano wartość p <0,01. Jak pokazano na tym wykresie, występuje dobra korelacja między poziomami rhGH w surowicy ludzkiej z dodatkiem analitu, zmierzonymi za pomocą metod SPRi i ELISA. Wartość r dla 9 różnych próbek wyniosła 0,9263.

Rycina 9. Analiza korelacji Pearsona między metodą ELISA a Nano-SPRi. Wykres przedstawia korelację intensywności sygnału Nano-SPRi (oś y) z wartościami gęstości optycznej ELISA (oś x). (Współczynnik korelacji Pearsona n = 9, r = 0.9263, p = 0.00000183). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Stałą dysocjacji równowagowej (K_D) wyznaczono przy użyciu oprogramowania GraphPad dla testów ELISA. Obliczona wartość K_D wyniosła około 79 nM (Tabela 3). Szybkości asocjacji (K_a) i dysocjacji (K_d) nie udało się wyznaczyć metodą ELISA. Jednakże, przy zastosowaniu oprogramowania do analizy danych, metoda bezpośredniego wykrywania pozwoliła uzyskać wartość K_D wynoszącą 23 pM, przyjmując masę cząsteczkową 22 kDa odpowiadającą jednej cząsteczce rhGH. Obliczone szybkości asocjacji i dysocjacji wyniosły odpowiednio 6,1 x10⁷ M^-1s^-1 oraz 1,33 x 10^-3 sec^-1. Oznacza to w praktyce, że w każdej sekundzie rozpada się 0,13% kompleksów rhGH i przeciwciał. W przypadku eksperymentu SPRi z wzmocnieniem zaobserwowano silniejszą ogólną interakcję między NanoEnhancers a rhGH, ponieważ obliczone powinowactwo wiązania wyniosło 4,3 pM. Ponadto odnotowano wyższą szybkość asocjacji dla NanoEnhancers i rhGH niż dla przeciwciała wychwytującego/rhGH, jednak szybkość dysocjacji wskazuje, że w każdej sekundzie rozpada się 0,26% kompleksów NanoEnhancer/rhGH/przeciwciała wychwytującego.

Metoda	KD (Powinowactwo)	Ka  (stała szybkości asocjacji)	Kd  (stała dysocjacji)	granica wykrywalności
ELISA	79,45 x 10-9 M	Brak danych	ND	1 ng/ml
SPRi	23,2 x 10-12 M	6,1 x 107 M-1sek-1	1,33 x10-3 sek-1	3,61 ng/ml
Nano-SPRi	4,33 x 10-12 M	7,54 x 108 M-1sek-1	2,62 x 10-3 sek-1	0,0092 ng/ml

Tabela 3. Pełna analiza danych kinetycznych. Ocena powinowactwa, szybkości asocjacji (on-rate) i szybkości dysocjacji (off-rate) odpowiedzi przeciwciał przy użyciu oprogramowania GraphPad (ELISA) oraz programów do analizy danych (SPRi i Nano-SPRi). Do wyznaczenia awidności wybrano masę cząsteczkową 22 kDa, która odpowiada jednej cząsteczce rhGH. Granice wykrywalności dla wszystkich trzech badań określono przy użyciu programu Excel.

Dyskusja

Nieregularny poziom hGH, naturalnie występującego hormonu, został powiązany z licznymi zaburzeniami medycznymi, które wpływają na wzrost i rozwój człowieka. Co więcej, egzogenne podawanie rhGH jest powszechnie stosowane przez sportowców, mimo że jest zabronione, jako środek dopingujący w celu zwiększenia ich wydajności. Wyzwania związane z wykrywaniem niewłaściwego stosowania rhGH wynikają z trudności w odróżnieniu egzogennego hGH od formy endogennej. W związku z tym obecnie zatwierdzona technika wykrywania egzogennego hGH opiera się na pomiarze stosunku izoformy 22 kDa hGH do izoformy 20 kDa. Ponieważ test izoformy wymaga jednoczesnego pomiaru wielu izoform hGH w krótkim czasie w szerokim zakresie stężeń, uznaliśmy platformę SPRi za idealne dopasowanie. Ponadto endogenny poziom hGH waha się do bardzo niskiego poziomu (0,03 ng/ml) we krwi, dlatego system wykrywania musi być w stanie wygodnie zmierzyć ten zakres z wysoką swoistością. W rezultacie zbadaliśmy również w tym badaniu potencjał Nano-SPRi jako narzędzia diagnostycznego dla hGH i porównaliśmy go bezpośrednio z SPRi i klasycznym testem immunologicznym ELISA.

Na podstawie wyników uzyskanych w tym badaniu, główną zaletą metody SPRi i Nano-SPRi jest to, że stężenia rhGH mogą być mierzone w szybszy sposób w porównaniu z bardziej konwencjonalną metodą ELISA. Standardowy czas pomiaru poziomu rhGH w jednej próbce metodą wykrywania bezpośredniego wynosił 1 godzinę, podczas gdy Nano-SPRi wymagał 2 godzin ze względu na dodatkowe etapy procesu. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku eksperymentów SPRi i Nano-SPRi, przed wstrzyknięciem próbki, zdecydowanie zaleca się etap kalibracji. Ponadto wstrzyknięcie surowej próbki, takiej jak ludzka surowica, powoduje pewne niespecyficzne interakcje, w wyniku czego konieczne jest wstrzyknięcie buforu o wysokiej zawartości soli, aby ujawnić tylko określone interakcje. Warto również zauważyć, że etap mycia jest absolutnie konieczny po wprowadzeniu cząsteczek blokujących na powierzchnię czujnika, w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek. Jeśli chodzi o test ELISA, wymagania czasowe są znacznie większe (~16-18 godzin) w przypadku analizy jednej próbki. Potrzebny jest dłuższy czas inkubacji, ponieważ czułość testu jest zwiększona, szczególnie w tym badaniu, ponieważ skupiono się na porównaniu dolnej granicy wykrywalności.

Wybór chemii powierzchni będzie się różnił w zależności od zastosowania i może to być realizowane jako jedno z ograniczeń techniki SPRi. W tym badaniu oceniono szeroki zakres i kombinację łączników chemicznych i cząsteczek blokujących, aby uzyskać właściwą kombinację w celu zaobserwowania optymalnej skuteczności wiązania rhGH z powierzchnią czujnika. Na przykład w tym badaniu połączenie BSA i PEG dobrze posłużyło do zminimalizowania interakcji niespecyficznych. Jednak w poprzednim badaniu¹⁷, w którym ligandem wychwytującym były aptamery, sam PEG służył jako najlepsza cząsteczka blokująca. Zmienne wpływające na skuteczność wiązania analitu z ligandem są również zależne od pH, buforu i temperatury. Dlatego w przypadku każdej aplikacji zmienne te muszą być optymalizowane. Ponadto bardzo ważne jest określenie optymalnego stężenia plam liganda na powierzchni chipa. Przed rozpoczęciem badania przeprowadza się eksperyment miareczkowania z różnymi stężeniami unieruchomionych ligandów. Jeśli chodzi o test ELISA, kluczowym krokiem w procedurze była dekantacja buforu płuczącego z dołków poprzez stukanie w mikropłytkę, ponieważ zapewniało to, że nie pozostały żadne resztki cieczy. Usunięcie płukania buforu za pomocą pipety nie było wystarczające, ponieważ jakakolwiek pozostała ciecz zakłócała odczyt sygnału próbki docelowej.

Jeśli chodzi o czułość, test ELISA (1 ng/ml) jest porównywalny z SPRi (3,61 ng/ml), ale nano-SPRi (9,20 pg/ml) zwiększa czułość o trzy rzędy wielkości, umożliwiając w ten sposób pomiary na niższych poziomach biologicznych rhGH 0,03 ng/ml. Jak wcześniej informowaliśmy^16,17, wzmocnienie sygnału przekazywane przez NanoEnhancers przypisuje się efektowi obciążenia masy i silnemu sprzężeniu, które istnieje między fluoroforami NIR a propagującymi plazmonami powierzchniowymi dla nanostruktur o złotej warstwie. Mimo że Nano-SPRi dodaje dodatkowy krok do procedury, ten poziom czułości może poszerzyć zastosowania technologii SPRi w różnych punktach sprzedaży.

SPRi zapewnia naukowcom pełny profil kinetyczny (K,_D, K_a i K_d) interakcji przeciwciało/rhGH, podczas gdy test ELISA może zgłaszać tylko wartości powinowactwa. Współczynnik zmienności (CV) wynosił poniżej 10% dla SPRi (4,1%) i ELISA (6,5%), co sugeruje dobrą odtwarzalność. Wartości powinowactwa ELISA i SPRi są różne, ponieważ przeciwciała wychwytujące unieruchomione na chipie czujnika różnią się od przeciwciał unieruchomionych na 96-dołkowej płytce ELISA. W przypadku Nano-SPRi zaobserwowano wyższą wartość CV (20%). Istnieje kilka parametrów, które mogą przyczyniać się do popełniania błędów przy określaniu CV. Na przykład w eksperymencie Nano-SPRi mierzone jest znacznie niższe stężenie analitu, dodanie NanoEnhancerów dodaje kolejny krok w procedurze, a eksperyment został przeprowadzony ręcznie. Uzyskano bardzo dobrą korelację między Nano-SPRi a testem ELISA w wykrywaniu rhGh w kolczastej surowicy ludzkiej. Wreszcie, ELISA może być niezawodną techniką, jednak sama metoda jest czasochłonna, co utrudnia jej stosowanie w sytuacjach wymagających monitorowania i multipleksowania w czasie rzeczywistym, jak ma to miejsce w przypadku hGH. Ponadto bardziej atrakcyjną cechą, która nie została zbadana bezpośrednio w tym badaniu, a którą SPRi oferuje w porównaniu z ELISA, jest możliwość pomiaru setek interakcji jednocześnie w czasie rzeczywistym. W związku z tym w przyszłości metoda Nano-SPRi będzie oceniana w celu jednoczesnego wykrywania wielu biomarkerów w czasie rzeczywistym (multipleksowanie) obecnych w surowicy w różnych stężeniach w celu zbadania jej potencjału jako realnego klinicznego narzędzia diagnostycznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało wychwytujące hormon wzrostu somatotropiny (GH1)	Przeciwciała Acris	DM1015
Albumina surowicy bydlęcej	Bioodczynniki Fisher	BP671-10
Przeciwciało wykrywające hormon wzrostu somatotropiny (GH1) znakowane biotyną	Przeciwciała Acris	AM09304BT-N
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid	TCI America	D1601
Etanoloamina	Acros Organics	141-43-5
Etanol	Fisher Chemicals	BP2818-4
Zestaw ELISA HGH dla ludzi	Invitrogen
Ludzkie surowica	Sigma Aldrich	H4522
Przeciwciało IgG królika	Sigma Aldrich	I5006
Kwas 11-merkaptoundekanowy	Sigma Aldrich
Nanostrip	Cyantek
N-hydroksysukcynimid	Sigma Aldrich		Bufor
fosforanowy	Invitrogen	00-3002
Glikol polietylenowy (800 Da)	Sigma Aldrich
Rekombinowany ludzki hormon wzrostu	Calbiochem	869008
Octan sodu	Sigma Aldrich	127-09-3
Chlorek sodu	Fisher Chemicals	7647-14-5
Kropki kwantowe bliskiej podczerwieni pokryte streptawidyną	Technologie życiowe
UV/Ozone Procleaner	Bioforce Nanosciences
Reaktor mikrofalowy	CEM Corporation		Odkryj system
SPRi-Arrayer	System mikromacierzy LabNext Xactll
Biochip SPR	HORIBA
SPRi-Lab+	HORIBA
Synergy Mx Wielomodowy czytnik mikropłytek	BioTek
Oprogramowanie do analizy danych ScrubberGen	HORIBA