Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53510

⸱

20 stycznia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Identyfikacja bezpośrednich celów cząsteczek ukierunkowanych na genom pozostaje głównym wyzwaniem. Aby zrozumieć, w jaki sposób cząsteczki wiążące DNA angażują się w genom, opracowaliśmy metodę, która opiera się na sieciowaniu małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC).

Streszczenie

Genom jest celem niektórych z najskuteczniejszych chemioterapeutyków, ale większość z tych leków nie ma specyficznej sekwencji DNA, co prowadzi do toksyczności ograniczającej dawkę i wielu niepożądanych skutków ubocznych. Celowanie w genom za pomocą małych cząsteczek specyficznych dla sekwencji może umożliwić uzyskanie cząsteczek o zwiększonym indeksie terapeutycznym i mniejszej liczbie efektów poza celem. Poliamidy N-metylopirolu/N-metyloimidazolu to cząsteczki, które można racjonalnie zaprojektować, aby celować w określone sekwencje DNA z wyjątkową precyzją. W przeciwieństwie do większości naturalnych czynników transkrypcyjnych, poliamidy mogą wiązać się z metylowanym i chromatynowym DNA bez utraty powinowactwa. Specyficzność sekwencji poliamidów była szeroko badana in vitro z identyfikacją miejsc pokrewnych (CSI) oraz tradycyjnymi podejściami biochemicznymi i biofizycznymi, ale badanie wiązania poliamidu z celami genomowymi w komórkach pozostaje nieuchwytne. Tutaj przedstawiamy metodę sieciowania małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC), która identyfikuje miejsca wiązania poliamidu w całym genomie. COSMIC jest podobny do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), ale różni się na dwa ważne sposoby: (1) stosuje się fotośrodek sieciujący, aby umożliwić selektywne, kontrolowane czasowo wychwytywanie zdarzeń wiązania poliamidu, oraz (2) uchwyt powinowactwa biotyny jest używany do oczyszczania koniugatów poliamid-DNA w warunkach półdenaturacji w celu zmniejszenia DNA, które nie jest kowalencyjnie związane. COSMIC to ogólna strategia, która może być wykorzystana do ujawnienia zdarzeń wiązania całego genomu poliamidów i innych chemioterapeutyków ukierunkowanych na genom.

Wprowadzenie

Informacje niezbędne do wytworzenia każdej komórki w ludzkim organizmie są zakodowane w DNA. Selektywne wykorzystanie tych informacji determinuje los komórki. Czynniki transkrypcyjne (TFs) to białka, które wiążą się ze specyficznymi sekwencjami DNA, aby wyciszyć lub aktywować określoną podgrupę genów w genomie; nieprawidłowe funkcjonowanie czynników transkrypcyjnych wiąże się z wystąpieniem szerokiego spektrum chorób, w tym wad rozwojowych, nowotworów oraz cukrzycy.1,2 Naszym celem było opracowanie cząsteczek zdolnych do selektywnego wiązania się z genomem i modulowania sieci regulacyjnych genów.

Poliamidy składające się z N-metylopirolu i N-metylimidazolu są racjonalnie zaprojektowanymi cząsteczkami, które mogą celować w DNA z specyficznością i powinowactwem dorównującym naturalnym czynnikom transkrypcyjnym.3-6 Cząsteczki te wiążą się ze specyficznymi sekwencjami w małej bruździe DNA.4,5,7-11 Poliamidy były wykorzystywane zarówno do represji, jak i aktywacji ekspresji konkretnych genów.4,12-19 Wykazują one również interesujące właściwości przeciwwirusowe20-24 oraz przeciwnowotworowe12,13,25-30. Atrakcyjną cechą poliamidów jest ich zdolność do dostępu do sekwencji DNA, które są zmetylowane31,32 i owinięte wokół białek histonowych9,10,33.

Aby zmierzyć kompleksową specyficzność wiązania cząsteczek wiążących DNA, nasze laboratorium opracowało metodę identyfikacji miejsc pokrewnych (CSI – cognate site identifier).34-39 Przewidywane występowanie miejsc wiązania na podstawie specyficzności in vitro (tzw. genomescapes) może być wyświetlane na genomie, ponieważ intensywności wiązania in vitro są wprost proporcjonalne do stałych asocjacji (Ka).34,35,37 Mapy genomowe te pozwalają zrozumieć stopień zajętości genomu przez poliamidy, jednak pomiar wiązania poliamidów w żywych komórkach stanowi wyzwanie. DNA jest ściśle upakowane w jądrze komórkowym, co może wpływać na dostępność miejsc wiązania. Dostępność tych chromatynowych sekwencji DNA dla poliamidów pozostaje zagadką.

W ostatnim czasie pojawiło się wiele metod badania oddziaływań między małymi cząsteczkami a kwasami nukleinowymi.40-48 Jedną z takich technik jest chemiczne wychwytywanie powinowactwa i masowo równoległe sekwencjonowanie DNA (chem-seq). Chem-seq wykorzystuje formaldehyd do sieciowania małych cząsteczek z docelowym obszarem genomu oraz biotynilowaną pochodną wybranej małej cząsteczki do wychwycenia oddziaływania ligand–cel.48,49

Sieciowanie formaldehydem prowadzi do pośrednich oddziaływań, które mogą generować wyniki fałszywie dodatnie.50 Opracowaliśmy nową metodę sieciowania małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny (COSMIC),51 wykorzystującą fotosiewnik w celu wyeliminowania tak zwanych „widmowych” pików.50 W pierwszej kolejności zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy trifunkcyjne pochodne poliamidów. Cząsteczki te zawierały poliamid wiążący DNA, fotosiewnik (psoralen) oraz uchwyt powinowactwa (biotynę, Rycina 1). Dzięki zastosowaniu trifunkcyjnych poliamidów możemy kowalencyjnie utrwalić oddziaływania poliamid–DNA za pomocą naświetlania promieniowaniem UV o długości fali 365 nm, która nie uszkadza DNA ani nie indukuje sieciowania niezależnego od psoralenu.51 Następnie fragmentujemy genom i oczyszczamy wychwycone DNA w rygorystycznych, półdenaturujących warunkach, aby zredukować ilość DNA związanego niekowalencyjnie. W związku z tym postrzegamy COSMIC jako metodę powiązaną z chem-seq, ale z bardziej bezpośrednim odczytem celowania w DNA. Co ważne, słabe powinowactwo psoralenu do DNA (Ka 103-104 M-1) nie wpływa w sposób wykrywalny na swoistość poliamidu.51,52 Wzbogacone fragmenty DNA mogą być analizowane za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy51 (COSMIC-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji53 (COSMIC-seq). Dane te umożliwiają bezstronne, kierowane genomem projektowanie ligandów, które oddziałują z pożądanymi loci genomicznymi i minimalizują efekty poza docelowe.

Schemat powstawania adduktów poliamid-DNA obejmujący sekwencjonowanie; analiza genomu za pomocą qPCR, sekwencjonowanie.
Rysunek 1. Bioaktywne poliamidy i schemat COSMIC. (A) Poliamidy w formie spinki do włosów 1–2 celują w sekwencję DNA 5′-WACGTW-3′. Poliamidy liniowe 3–4 celują w 5′-AAGAAGAAG-3′. Pierścienie N-metyloimidazolu zostały pogrubione dla przejrzystości. Puste i wypełnione kółka reprezentują odpowiednio N-metylpirol i N-metyloimidazol. Kwadrat reprezentuje 3-chlorotiofen, a romby reprezentują β-alaninę. Psoralen i biotyna są oznaczone odpowiednio jako P i B. (B) Schemat COSMIC. Komórki są traktowane trifunkcyjnymi pochodnymi poliamidów. Po sieciowaniu za pomocą naświetlania UV o długości fali 365 nm, komórki są lizowane, a DNA genomowe poddawane ścinaniu. Dodaje się magnetyczne kulki pokryte streptawidyną w celu wychwytu adduktów poliamid–DNA. DNA jest uwalniane i może być analizowane za pomocą ilościowego PCR (qPCR) lub sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sieciowanie w żywych komórkach

  1. Zacznij od ~2,5x107 komórek H1 lub innych hodowanych komórek.
    UWAGA: Ta liczba komórek H1 odpowiada pięciu 10-centymetrowym szalkom (około 40% konfluencji).
  2. Hodować komórki w pożywce E8 na szalkach pokrytych powierzchnią, na której znajdują się pluripotencjalne komórki macierzyste (patrz Wykaz materiałów) i inkubować je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zbieraj komórki enzymatycznie (patrz Lista materiałów). Uwaga: Nie pozwól, aby komórki H1 przekroczyły 90% zbiegu; konfluencja indukuje spontaniczne różnicowanie komórek H1. Aby policzyć komórki, należy wyhodować dodatkowe 10-centymetrowe naczynie komórek, podnieść komórki enzymatycznie, jak opisano w sekcjach 1.8-1.10 i policzyć je za pomocą hemocytometru.
    1. Przygotować pożywki hodowlane E8 zgodnie z opisem w Chen i wsp.54 Rozdział 54
  3. Przed dodaniem poliamidu należy usunąć zużyte pożywki hodowlane za pomocą pipety Pasteura przymocowanej do pułapki próżniowej. Dodać świeżą pożywkę za pomocą pipety serologicznej i dozownika do pipet (8 ml na 10-centymetrowe naczynie).
    UWAGA: Dodaj pożywkę z boku naczynia, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Od tego momentu należy chronić komórki przed światłem, aby uniknąć przedwczesnego sieciowania foto
    4. .
  4. Dodać poliamid pipetą (8 μl 400 μM poliamidu w DMSO, stężenie końcowe 400 nM) bezpośrednio do pożywki hodowlanej w każdym szalu. Zakręć naczyniem, aby równomiernie rozproszyć poliamid w podłożu.
    UWAGA: Stężenie może być różne, ale upewnij się, że nie obserwuje się toksyczności komórkowej dla wybranego leczenia.
  5. Inkubować komórki 24 godziny 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 i upewnić się, że są chronione przed światłem.
    UWAGA: Czas inkubacji można zmieniać, aby zmierzyć wiązanie poliamidu w czasie.
  6. Umyj każde 10-centymetrowe naczynie 4 ml PBS (1,05 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 155,17 mM chlorku sodu, 2,97 mM dwuzasadowego fosforanu sodu) za pomocą pipety serologicznej i dozownika do pipet. Odessać PBS i dodać 3 ml pożywki hodowlanej E8.
  7. Przy przyciemnionych światłach zdejmij pokrywkę z 5 naczyń hodowlanych i umieść komórki na płaskiej powierzchni na zewnątrz okapu. Umieść szklany filtr na 5 szalkach hodowlanych, aby odfiltrować światło o λ < 300 nm. Umieść źródło UV na filtrze. Próbki sieciowane 30 min przy napromieniowaniu UV 365 nm (2,4 mW/cm2).
    UWAGA: Czas sieciowania należy określić empirycznie.
  8. Przenieś naczynia hodowlane z powrotem do okapu. Zassać pożywkę za pomocą pipety Pasteura przymocowanej do syfonu próżniowego. Umyj każde 10-centymetrowe naczynie 4 ml PBS. Zassać PBS. Dodać 3 ml enzymu do dysocjacji komórek (patrz Lista materiałów) na 10-centymetrowe naczynie, aby zdysocjować komórki. Inkubować 5 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Nie podgrzewaj wstępnie enzymu.
  9. Ugasić enzym za pomocą 3 ml pożywki E8 na naczynie. Przenieś zdysocjowane komórki do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Od tego momentu umieszczaj komórki na lodzie.
  10. Odwirować zdysocjowane komórki 5 min, 500 x g w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant w celu usunięcia enzymu i pożywki.
    UWAGA: Punkt pauzy. Komórki mogą być zamrażane w ciekłym azocie, przechowywane w temperaturze -80 °C w celu późniejszej obróbki.

2. Izolacja chromatyny

  1. Dodać 1,2 ml buforu COSMIC (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad komórek dla każdej próbki w 1,2 ml buforu KOSMIC.
    1. Dodać po 133 μl 100 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 100 mM benzamidyny i 150 μM inhibitorów proteazy pepstatyny w stanie świeżym do końcowego stężenia 1 mM dla PMSF i benzamidyny oraz 1,5 μM dla pepstatyny. Podziel roztwór lizatu komórkowego na dwie bursztynowe probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
  2. Sonikacja za pomocą sonikatora przez 35 minut (10 sekund włączenia, 10 sekund wyłączenia, 60% mocy), aby rozdrobnić genom do wartości od 100 do 500 pz.
    1. Utrzymuj poziom roztworu chromatyny w probówce mikrowirówki równolegle do poziomu wody w zbiorniku. Potwierdź ten poziom poprzez oględziny.
      UWAGA: Potwierdź, że DNA zostało ścięte 1,5% żelem agarozowym. 55
      2. Rozdział
    2. Zoptymalizuj empirycznie czas sonikacji. Użyj minimalnej ilości lodu w zbiorniku do schłodzenia próbek i upewnij się, że lód nie przeszkadza między próbkami a rogiem kubka.
  3. Odwirować próbkę 12 000 x g 10 min. Roztwór wodny zawierający rozpuszczalną chromatynę należy zachować przenosząc go do nowej bursztynowej probówki do mikrowirówki za pomocą pipety. Wyrzuć granulkę.
  4. Przenieś 110 μl (10%) próbki do nowej probówki do mikrowirówki i oznacz ją jako wejściowe DNA. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Pozostałą część próbki chromatyny należy zachować na lodzie do wykorzystania w kroku 3.3.

3. Wychwytywanie wiązań krzyżowych ligand-DNA

  1. Za pomocą pipety dozować 60 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną w probówce do mikrowirówki. Dodać 1 ml buforu COSMIC i wymieszać na nutatorze przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umieść kulki magnetyczne na stojaku do separacji magnetycznej na 2 minuty, aby uchwycić koraliki. Usuń bufor COSMIC za pomocą pipety.
    UWAGA: Nie pozwól, aby koraliki wyschły. Przejdź od razu do następnego kroku.
  2. Dodać próbkę chromatyny (~1 ml) do kulek (60 μl) i ponownie zawiesić kulki. Inkubować chromatynę z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną przez co najmniej 4 godziny na obracającym się, kołyszącym się mieszadle w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby inkubować próbki O/N.

4. Izolacja DNA oczyszczonego z powinowactwa

  1. Płukać koraliki w odstępie 7 minut w temperaturze pokojowej za pomocą następujących do mycia, aby usunąć niespecyficzne interakcje. Użyj magnetycznego stojaka separacyjnego, aby wychwycić koraliki po każdym praniu. Ponownie zawieszaj kulki po każdej zmianie bufora myjącego.
  2. Przed użyciem przygotować do płukania w destylowanej wodzie dejonizowanej i przefiltrować (0,2 μm). 1 i 2 należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Codziennie przygotuj świeży bufor do mycia 3. Dodać i usunąć płuczące z próbki za pomocą pipety. W przypadku 2 i 4 dodaj odpowiednio 1 i 3 (5 mM) do prania. Próbki można dodatkowo dwukrotnie przemyć buforem COSMIC (raz 12 godzin, raz 4 godziny) przed podanymi poniżej płukaniami.
    1. Umyć raz buforem do płukania 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Przemyć raz buforem płuczącym 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% deoksycholan sodu). Przemyć dwukrotnie buforem płuczącym 3 (4 M mocznik, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Przemyć dwukrotnie buforem Tris EDTA (TE) (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA).
  3. Zawiesić kulki w buforze o pojemności 200 μl TE za pomocą pipety. Ta próbka przechwyconego DNA jest określana jako DNA oczyszczone z powinowactwa (AP).
  4. Uzupełnij DNA wejściowe i AP 10x buforem odwracającym usieciowanie (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mM EDTA) do 1x końcowego stężenia. 56,57 Inkubować 30 min w temperaturze 90 °C.
    UWAGA: Promieniowanie UV o długości fali 254 nm może być również wykorzystane do odwrócenia wiązania poprzecznego psoralenu,58 ale dimery cyklobutylopirymidyny mogą powstawać z napromieniania na tej długości fali i zakłócać dalsze przetwarzanie DNA.
  5. W przypadku AP DNA umieścić probówkę mikrowirówki zawierającą próbkę na stojaku do separacji magnetycznej na 2 minuty w temperaturze pokojowej i wyizolować ciecz (DNA) za pomocą pipety. Przenieś DNA AP (które zostało uwolnione z kulek) do nowej bursztynowej probówki do mikrowirówki.
    UWAGA: Pożądane DNA AP znajduje się w płynie, nie jest już przyczepione do kulek.
  6. Zneutralizować DNA wejściowe i AP za pomocą stężonego HCl do pH 7, dodając około 1 μl 6 N HCl na 100 μl próbki za pomocą pipety. Potwierdź, że próbki zostały zneutralizowane, dodając pipetą ~0,5 μl na bibułę pH. ostrzeżenie: Skoncentrowany HCl jest silnie kwasem. Postępuj zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji dotyczącymi odpowiednich środków ochrony osobistej.
  7. Dodaj RNazę A (100 mg / ml) do końcowego stężenia 0,2 μg / μl zarówno do DNA, jak i AP. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Dodać proteinazę K (20 mg/ml) do końcowego stężenia 0,2 μg/μl zarówno do wejściowego DNA, jak i AP, dodać. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 55 °C.
  8. Oczyść DNA za pomocą zestawu do czyszczenia kolumny DNA (patrz Lista materiałów). 55 Elute DNA w 58 μl DNA klasyH2O. Przechowywać próbki wejściowe i AP w temperaturze -20 lub -80 °C
  9. Analiza DNA AP za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) ze starterami specyficznymi dla locus i/lub sekwencjonowania nowej generacji. Do qPCR należy użyć 2 μl AP DNA na locus o następujących parametrach: 1 cykl 95 °C 10 min i 40 cykli 95 °C 20 sekund, 54 °C lub 56 °C 20 sekund, 72 °C 40 sek.
    UWAGA: Temperaturę wyżarzania należy modyfikować zgodnie z temperaturą topnienia zastosowanych par podkładów. Wybierz temperaturę wyżarzania, która minimalizuje cykl kwantyfikacji bez niespecyficznego wzmocnienia.
    UWAGA: W przypadku analizy za pomocą sekwencjonowania nowej generacji należy dążyć do co najmniej 10 milionów zmapowanych odczytów. Liczbę zmapowanych odczytów można zwiększyć, zwiększając ilość DNA AP i łącząc mniej próbek w serię sekwencjonowania. Więcej odczytów poprawia czułość. Standardowe pakiety do analizy ChIP-seq (np. HOMER,59 MACS,60 i SPP61) współpracują z danymi COSMIC-seq. Podobnie jak w przypadku innych metod, które opierają się na sekwencjonowaniu nowej generacji, w tym sekwencjonowania genomu i sekwencjonowania ChIP, powtarzające się regiony powodują niejasności w dopasowaniu i składaniu, a tym samym pozostają wyzwaniem technicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby uwzględnić nierównomierną fragmentację genomu oraz inne zmienne, oczyszczone DNA powinno być zawsze normowane względem referencyjnego DNA wejściowego (Input DNA). Można zastosować primery specyficzne dla badanego locus. Pomocne jest również przeanalizowanie locus, z którym cząsteczka nie powinna się wiązać, w celu zastosowania kontroli negatywnej. Widzimy >100-krotny wzrost zajętości poliamidu po naświetlaniu światłem o długości fali 365 nm (Rysunek 2).

Wzbogacone DNA m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z głównych wyzwań związanych z konwencjonalnym ChIP jest identyfikacja odpowiednich przeciwciał. ChIP zależy w dużym stopniu od jakości przeciwciała, a większość komercyjnych przeciwciał jest nieakceptowalna dla ChIP. Konsorcjum Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) stwierdziło, że tylko 20% komercyjnych przeciwciał nadaje się do testów na obecność wirusa ChIP. 50 W przypadku COSMIC przeciwciała są zastępowane przez streptawidynę. Ponieważ poliamidy są funkcjonalizowane biotyną, streptawidyna jest stoso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

A.Z.A. jest wyłącznym właścicielem Vista Motif, LLC i WINStep Forward.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Ansari i prof. Parameswaranowi Ramanathanowi za pomocne dyskusje. Praca ta była wspierana przez granty NIH CA133508 i HL099773, stypendium wydziału H. I. Romnes, a nagroda W. M. Keck Medical Research Award dla A.Z.A. G.S.E. była wspierana przez stypendium Peterson Fellowship z Wydziału Biochemii i Bionauk Molekularnych Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. był wspierany przez Morgridge Graduate Fellowship oraz Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, a D.B. był wspierany przez grant NSEC z NSF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)dowolne źródło
Benzamidynadowolne źródło
Pepstatynadowolne źródło
Proteinaza Kdowolne źródło
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001
PBS, pH 7,4Life Technologies10010-023Można użyć innych źródeł
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA1110501
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104Z powodzeniem wypróbowaliśmy innych producentów kolumn DNA.
Zestaw do przygotowania próbek TruSeq ChIPIlluminaIP-202-1012Ten zestaw może być używany do przygotowania COSMIC DNA do sekwencjonowania nowej generacji
Matrigel Basement Membrane MatrixBD Biosciences356231Służy do powlekania płytek w celu wyhodowania H1 ESC
Papier pHz dowolnego źródła
bursztynowe probówkidowolne źródło
dowolne źródło
filtr pyrexdowolne źródłoNaczynia do pieczenia Pyrex są odpowiednie
qPCR master mixdowolne źródło
RNazadowolne źródło
HCl (6 N)dowolne źródło
10-centymetrowe naczynia do hodowli tkankowychdowolne źródło
Pipety serologicznedowolne źródło
Pipety Pasteuraz dowolnego źródła
Końcówki do pipetz dowolnego źródła
Probówki stożkowe o pojemności 15 ml zdowolnego źródła
Wirówkaz dowolnego źródła
Nutatorz dowolnego źródła
Magnetyczny stojak separacyjnyz dowolnego źródła
Źródło promieniowania UVCalSunB001BH0A1AMożna stosować inne źródła promieniowania UV, ale czas sieciowania musi być zoptymalizowany empirycznie
Misonix SonicatorQsonicaS4000 z klaksonem kubkowym 431C1Można stosować inne sonicy, ale warunki sonikacji muszą być zoptymalizowane empirycznie
Nawilżony inkubator CO2dowolne źródło
Szafa bezpieczeństwa biologicznego z wylotem podciśnieniaz dowolnego źródła
wirówkowe Mikrowirówka z dowolnym źródłem

Bibliografia

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544(2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406(2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286(2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137(2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wi zanie poliamidowesieciowanie DNAizolacja chromatynysieciowanie UVkulki z streptawidynsekwencjonowanie nast pnej generacjiilo ciowy PCR
Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.