Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Summary

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Abstract

Identyfikacja genów odpowiedzialnych za indukcję embrionalną stawia wiele wyzwań; by wymienić tylko kilka, wydzielane cząsteczki mogą być mało obfite, mogą nie być wydzielane, ale przywiązane do komórki sygnalizacyjnej (komórek sygnałowych), lub mogą wymagać obecności partnerów wiążących lub cząsteczek regulatorowych znajdujących się przed nimi. W związku z tym, w poszukiwaniu produktów genowych zdolnych do wywołania wczesnej odpowiedzi indukcyjnej soczewki u kompetentnej ektodermy, wykorzystaliśmy system klonowania ekspresji, który pozwoliłby na identyfikację czynników parakrynnych lub jukstakrynowych, a także białek transkrypcyjnych lub innych białek regulatorowych. Pule mRNA wstrzyknięto do oocytów Xenopus, a reagującą tkankę umieszczono bezpośrednio na oocytach i poddano wspólnej hodowli. Po funkcjonalnym klonowaniu ldb1 z biblioteki cDNA na etapie płytki nerwowej w oparciu o jej zdolność do wywoływania ekspresji markera wczesnego plakodu soczewki foxe3 w ektodermie zwierzęcej z kompetentną soczewką, scharakteryzowaliśmy wzorzec ekspresji mRNA i oznaczyliśmy progresję rozwojową po nadekspresji lub knockdownie ldb1. System ten jest odpowiedni w bardzo wielu różnych kontekstach, w których dąży się do identyfikacji induktora lub jego cząsteczek regulatorowych na wczesnym etapie łańcucha dostaw za pomocą odpowiedzi funkcjonalnej w kompetentnej tkance.

Introduction

Zaawansowane podejścia genetyczne do identyfikacji genów będących przedmiotem zainteresowania na podstawie ich funkcji lub utraty funkcji^1,2 są integralną częścią zrozumienia złożonych zdarzeń wzorcowych w rozwoju. W połączeniu z potężnymi technikami genetyki odwrotnej dostępnymi dla coraz szerszego wachlarza systemów i badaczy^3-5, możliwe jest teraz zidentyfikowanie genów odgrywających kluczową rolę funkcjonalną w szlaku, a następnie wyjaśnienie, które funkcjonują na poziomie komórkowym i w interakcji z innymi produktami genowymi. Jednym z podejść do funkcjonalnej identyfikacji genów będących przedmiotem zainteresowania, które przyniosło wiele kluczowych odkryć w przeszłości, jest klonowanie ekspresji^6,7.

Naszym ostatnim celem⁸ było zidentyfikowanie wczesnych czynników indukcyjnych soczewki, ponieważ wykazano, że początkowe etapy procesu indukcji soczewki kręgowców zachodzą już w stadium gastruli. W tym celu użyliśmy przejściowo kompetentnej ektodermy⁹ zwierzęcych czapek (etap 11-11,5¹⁰) zarodków Xenopus jako tkanki reagującej na indukcję oraz oocytu Xenopus stadium VI jako źródła produkcji czynników indukujących.

Poniższy protokół opiera się na protokołach klonowania wyrażeń i selekcji sib Smitha i Harlanda^6,7, z powodzeniem używanych również przez innych^11-13. W naszym systemie ekspresji oocytów (po raz pierwszy wykorzystanym do produkcji czynników indukujących przez Lustiga i Kirschnera¹⁴) wybierane i identyfikowane są pule wstrzykniętych transkryptów zdolnych do bezpośredniego lub pośredniego powodowania oocytów do wytwarzania czynników wywołujących odpowiedź indukcyjną soczewki w ektodermie kapsowej zwierząt w postaci czapeczki zwierzęcej. Ponieważ system jest przydatny do bezpośredniej ekspresji wydzielanych cząsteczek indukujących (mRNA INHBB wstrzyknięte do oocytów powoduje indukcję mezodermy w ektodermie⁸ zwierząt kompetentnych dla mezodermy), pierwotnie spodziewaliśmy się, że procedura przesiewowa będzie przydatna głównie do identyfikacji czynników parakrynnych. Ponieważ jednak zidentyfikowaliśmy czynnik jądrowy na naszym ekranie (ldb1⁸), jasne jest, że system może być używany do identyfikacji szerokiej gamy cząsteczek, takich jak transkrypcyjne lub translacyjne czynniki regulatorowe, miRNA, kofaktory lub czynniki jukstakrynowe.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii.

Uwaga: Rysunek 1 pokazuje schematyczny przegląd procedur eksperymentalnych.

1. Przygotowanie oocytów

1. Samice X. laevis przed zaszczepieniem ze 150 j. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) na około tydzień przed izolacją oocytów. Wstrzyknąć 1 ml 150 j./ml PMSG do grzbietowego worka chłonnego za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 29 G.
2. Przygotować roztwory do wstrzyknięcia oocytu i testu oocyty-kapturek.
   1. Przygotować wolne od Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, 50 mM HEPES pH 7,2.
   2. Przygotować OR2: OR2- plus 1 mM CaCl₂ i 1 mM MgCl_2.
   3. Przygotować OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg/ml BSA, 100 μg/ml Gentamycyny, pH 7,8.
   4. Przygotuj 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO_3.
   5. Przygotuj 3% Ficoll w 1x MBS.
   6. Przygotować 1x NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca(NO₃)₂, 1 mM MgSO₄, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO₃, 2 mM Na₃PO₄, pH 7,4.
3. Znieczulić samicę w 0,03% roztworze soli metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (MS222) w 0,1 x MBS (najpierw rozpuść 0,3 g MS222 w 10 ml 95% etanolu, a następnie rozcieńczyć w 1 l 0,1 x MBS), umieszczając żabę w roztworze na 10 - 15 minut lub do momentu, gdy przestanie reagować.
   1. Sprawdź, czy znieczulenie zostało zakończone, obracając znieczuloną żabę na plecy, aby upewnić się, że nie reaguje (niecałkowicie znieczulone żaby poruszają kończynami lub przewracają ciało).
4. Chirurgicznie wyizoluj fragmenty jajnika, wykonując nacięcie brzucha przez skórę i ścianę ciała za pomocą ostrza skalpela, izolując tkankę jajnika za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść fragmenty jajników w OR2-. Zamknij ścianę ciała jedwabnym szwem 3-0 na zakrzywionej igle 24 mm i zamknij skórę osobno tymi samymi szwami. Umożliwiają odzysk samicy w 1 g / L soli akwariowej w wodzie.
5. Za pomocą cienkich kleszczyków rozerwij tkankę jajnika na małe (10 - 20 oocytów) kawałki i przenieś do świeżego OR2-.
6. Odblokować fragmenty jajników w 2,0 mg/ml kolagenazy A w OR2- delikatnie mieszając na wytrząsarce przez 1 godzinę, przenosząc do świeżej kolagenazy i mieszając przez dodatkową godzinę.
7. Umyj oocyty 10 razy w OR2 [zawierającym Ca⁺⁺/Mg^++], odrzucając mniejsze oocyty.
8. Umyj oocyty w OCM dwa razy i przenieś do świeżego OCM. Wyizoluj oocyty w stadium VI według wielkości po oględzinach i odrzuć niedojrzałe (mniejsze) oocyty: oocyty w stadium VI są większe niż niedojrzałe oocyty z równomierną pigmentacją w półkuli zwierzęcej i mają średnicę około 1,2-1,4 mm.
9. Przed wstrzyknięciem należy utrzymać oocyty w temperaturze 18 - 20 °C w OCM. Uwaga: Szalki Petriego pokryte agarozą mogą być używane w celu zminimalizowania przywierania oocytów do szalki.

2. Wstrzykiwanie transkrypcji bibliotecznych

1. Przygotuj kierunkową bibliotekę cDNA¹⁵ przy użyciu RNA wyekstrahowanego na odpowiednim etapie rozwoju (na przykład stadium płytki nerwowej 14¹⁰). Kup bibliotekę cDNA lub skonstruuj ją za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z przeglądem w czterech poniższych krokach.
   1. Wyizolować około 5 μg mRNA, używając produktu do wzbogacania o poli(A)+ RNA (patrz tabela materiałów) i postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: Transkrypty, które mają być użyte do wytworzenia biblioteki cDNA, mogą być ograniczone do tkanki indukującej (takiej jak płytka nerwowa, po mikrodysekcji pożądanej tkanki) lub mogą pochodzić z całych zarodków na określonym etapie.
   2. Wyprodukuj cDNA za pomocą komercyjnego zestawu, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta.
   3. Związać około 20 ng cDNA do wektora dołączonego do zestawu handlowego lub innego odpowiedniego wektora. Odpowiedni wektor plazmidowy obejmuje sekwencje zapewniające stabilność mRNA, takie jak sekwencje 5' β-globiny i 3 sekwencje poli(A) (pCS2+, pTnT, pCS105).
   4. Przekształć ligację w kompetentne komórki bakteryjne przy użyciu zalecanego przez dostawcę protokołu transformacji szoku cieplnego.
      Uwaga: Alternatywnie, kolekcja klonów z otwartą ramką odczytu (ORFeome) jest dostępna na rynku i może być używana do generowania transkrypcji do wstrzyknięcia.
2. Przygotuj 10 pul plazmidów o złożoności 10³ do 10⁴ (10⁴ do 10⁵ całkowitej złożoności). Odpowiada to 10 płytkom z 1 000 - 10 000 kolonii każda.
   1. Hodowlę z biblioteki płytek na 10 15-centymetrowych płytkach LB-ampicyliny, wzrost 12 - 18 godzin w temperaturze 37 °C i zebranie kolonii z każdej z nich przez delikatny nacisk za pomocą szklanego rozsiewacza w 7 ml LB.
   2. Przygotować bulion glicerolowy z 0,5 ml (dodać do 0,2 ml sterylnego glicerolu i przechowywać w temperaturze -20 °C), a pozostałe 6,5 ml wykorzystać do przygotowania DNA za pomocą standardowego, dostępnego w handlu zestawu do minipreparatyki DNA, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta.
3. Linearyzować zgrupowany plazmidowy DNA (1,0 - 2,0 μg) za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego^{trawienia 16} w temperaturze 37 °C przez 1 - 1,5 godziny. Wyizolować zlinearyzowane DNA za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform, a następnie wytrącić etanol i ponownie zawiesić w wodzie zgodnie ze specyfikacją zastosowanego zestawu polimerazy RNA. Zsyntetyzuj sens RNA za pomocą komercyjnego zestawu polimerazy RNA zgodnie ze wskazówkami producenta.
4. Przygotować igły do mikroiniekcji (za pomocą ściągacza igieł ze szklaną rurką kapilarną) o średnicy około 20 μm; zmierzyć końcówki igieł pod mikroskopem złożonym za pomocą skalibrowanego mikrometru ocznego. Uwaga: Ustawienia ściągacza igieł muszą być empirycznie określone, aby wyprodukować igłę z cienką końcówką, tak aby po złamaniu drobnymi kleszczami dawała pożądany rozmiar końcówki.
5. Przygotować (wepchnąć glinę w jednolitą warstwę na dnie naczynia) wyłożone gliną szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm z równoległymi rowkami, aby utrzymać oocyty na miejscu podczas mikroiniekcji; wykonać rowki za pomocą sondy Mall lub pipety Pasteura stopionej na końcówce w płomieniu. Jako alternatywę dla gliny przygotuj naczynia agarozowe, wykonując wgłębienia za pomocą formy elastomerowej¹⁷. Przenieś oocyty za pomocą pipety o szerokim otworze do 3% Ficoll w 1X MBS (około 2 ml) w rzędach w naczyniach wyłożonych gliną.
6. Za pomocą mikrowstrzykiwacza napełnij igłę 1 ng/nl RNA i wyreguluj równowagę, aby wytworzyć lekkie dodatnie ciśnienie (aby zapobiec tworzeniu się cytoplazmy oocytów).
7. Wstrzyknąć oocyty z około 20 nl RNA w regionie równikowym. Odczekaj 1 godzinę, aż wstrzyknięte oocyty pozostaną w Ficoll-MBS, a następnie delikatnie przenieś do 1x MBS. Inkubować przez 8–24 godziny w temperaturze 20 °C przed badaniem czapek u zwierząt.

3. Test na czapeczkę zwierzęcą

1. Przygotuj 3/4x NAM i uzyskaj cienkie kleszcze, pętlę do włosów, zakrzywione fragmenty szkiełek nakrywkowych, gliniane naczynia z wgłębieniami w kształcie miseczek do przechowywania oocytów. Wykonaj zakrzywione fragmenty szkiełka nakrywkowego, rozbijając szklane szkiełka nakrywkowe na małe fragmenty (około 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) i przechodząc przez płomień, aż krawędzie wypolerują się i opadną, tworząc zakrzywiony kawałek.
2. Zapłodnić jaja X. laevis ¹⁸ poprzez in vitro lub naturalne krycie i hodowlę do etapów gastruli (10 - 11 godzin po zapłodnieniu w RT) w 0,1x MBS przed sortowaniem według etapów; zebrać zarodki w połowie gastruli (stadium 11 - 11,5)¹⁰.
3. Przenieś zarodki na szalkę Petriego wypełnioną mniej więcej do połowy z 3/4x NAM. Za pomocą dwóch par cienkich kleszczy usuń błonę zapłodnienia (witelinę) z gastrulae.
4. Przenieś oocyty do 3/4x NAM (około 2 ml) w naczyniach wyłożonych gliną i unieruchamiaj w indywidualnych wyciskach w glinie, wytwarzając wyciski w celu pomieszczenia poszczególnych zarodków, jak opisano powyżej.
5. Przenieś zarodki do wyłożonych gliną naczyń i odetnij kapelusze zwierząt z gastrulae za pomocą dwóch par cienkich kleszczy. Należy uważać, aby wyizolować tylko ektodermę czapeczki zwierzęcej, a nie tkankę równikową¹⁸.
6. Umieść zwierzęcą czapkę na półkuli zwierzęcej każdego oocytu, tak aby wewnętrzna powierzchnia kapturka zwierzęcia stykała się z oocytem. Trzymaj rekombinanty razem, nakładając zakrzywiony szklany fragment szkiełka nakrywkowego i wywierając nacisk w dół na szkło, spłaszczając ektodermę, gdy szkiełko nakrywkowe styka się z gliną (nakrętki zwierzęce mogą pozostać otwarte z wewnętrzną warstwą wystawioną na powierzchnię oocytu przez 6 - 8 godzin lub dłużej).
   Uwaga: Alternatywnie umieść czapkę zwierzęcia w glinianym wgłębieniu jej wewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry i umieść oocyt na czapce; Zabezpiecz rekombinant małymi przedłużeniami gliny.
7. Hodowla w temperaturze 20 °C do momentu, gdy zarodki kontrolne osiągną pożądane stadium do oznaczenia.
8. Oddzielić rekombinant, usuwając szkiełko nakrywkowe/glinkę i izolując ektodermę za pomocą kleszczy i pętli do włosów.
9. Utrwal fragmenty ektodermalne przez 1 godzinę w MEMFA (3,8% formaldehydu w MEM [0,1 M MOPS pH 7,4, 2 mM EGTA i 1 mM MgSO₄]).
10. Przenieść fragmenty (i zarodki kontrolne) z MEMFA do etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Analiza odpowiedzi w ektodermie przez hybrydyzację in situ (ISH)

1. Przygotuj rozwiązania dla ISH.
   1. Przygotuj 1x PBS: 0,01 M sól fizjologiczna buforowana fosforanem, NaCl 0,138 M, pH 7,4
   2. Przygotowanie PBS-Tween (PTw): 1x PBS, 0,1% Tween-20
   3. Przygotuj 100x roztwór Denharta: 2% BSA, 2% poliwinylopirolidon, 2% Ficoll
   4. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny: 50% formamidu, 5x SSC, 1 mg/ml RNA drożdży torula, 1 μg/ml heparyny, 1x roztwór Denharta, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H₂O
   5. Przygotuj bufor kwasu maleinowego (MAB): 100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, pH 7,5
   6. Przygotuj MAB + blok: MAB, 2% odczynnik blokujący (podgrzać do 60 °C do rozpuszczenia)
   7. Przygotuj bufor fosfatazy alkalicznej (AP): 100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH₂O
2. Przygotuj sondę RNA.
   1. Korzystając z komercyjnego zestawu polimerazy RNA i mieszanki dig-NTP, dodaj do probówki o pojemności 1,5 ml (reakcja 50 μl): 25,5 μl DEPC-H₂O, 10 μl 5X buforu transkrypcyjnego, 2,5 μl 10x mieszanka dig-NTP, 5 μl 100 mM DTT, 2 μl RNAsin, 2 μl zlinearyzowana matryca DNA (~1 μg/μl), 3 μl polimerazy RNA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min.
   2. Dodać 2 μl polimerazy RNA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 min.
   3. Sprawdź 2 μl reakcji na 1% żelu agarozowym.
   4. Dodać 1 μl DNazy RQ1 bez RNaz i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
   5. Wytrącić sondę, dodając 50 μl DEPC-H₂O, 25 μl 10 M octanu amonu i 313 μl etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc (O/N), a następnie odzyskać RNA przez odwirowanie w temperaturze 13 800 x g przez 20 minut. Umyć 500 μl 75% etanolu, krótko odwirować, usunąć etanol i pozostawić granulat do wyschnięcia na powietrzu. Dodać 50 μl DEPC-H₂O.
   6. Dodać bufor hybrydyzacyjny do końcowego stężenia ~0,5 μg/μl.
3. Przygotuj tkankę do hybrydyzacji. O ile nie zaznaczono inaczej, napełniać fiolki do góry przy każdej opisanej zmianie roztworu (około 4 ml).
   1. Usuń etanol z fiolek i przenieś zarodki do 75% etanolu/PTw, a następnie 50% etanolu/PTw przez 10 minut każdy, poziomo na wahaczu.
   2. Umyj trzy razy w PTw przez 5 minut na bujaku.
   3. Przenieść do 10 μg/μl Leczenie proteinazą K w PTw; rurki skalne pionowo 15 min.
   4. Płukać dwa razy po 10 min w 0,1 M Trietanoloamina pH 7,8 - rurki skalne pionowo.
   5. Dodaj 12,5 μl bezwodnika octowego do probówek i miel pionowo przez 5 min. Powtórz z dodatkowymi 12,5 μl bezwodnika octowego przez 5 min.
   6. Prać w PTw 5 min pionowo na bujaku.
   7. Ponownie napraw w 4% paraformaldehydzie 20 min na bujaku. Bufor do hybrydyzacji cieplnej do 60 °C.
   8. Umyj trzy razy w PTw przez 5 minut na bujaku.
   9. Usuń wszystkie oprócz ~1 ml PTw z każdej probówki i dodaj 250 μl buforu Hyb; delikatnie zakręć probówkami do wymieszania. Rury skalne w pionie 5 min.
   10. Zastąp roztworem Hyb Buffer o temperaturze 60 °C (0,5 ml) i delikatnie mieszaj w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Zastąp świeżym buforem Hyb i mieszaj w temperaturze 60 °C przez dwie do 4 godzin.
   11. Podgrzej sondę (1 ml przy 0,5 μg/μl w buforze Hyb) do 60 °C (3 min). Usuń Hyb Buffer i dodaj sondę do probówek. Delikatnie mieszać O/N w temperaturze 60 °C.
4. Przygotuj tkankę na przeciwciała.
   1. Ciepły bufor Hyb i 2x SSC + 0,1% roztwory Tween-20 do 60 °C.
   2. Zastąp roztwór sondy buforem Hyb (zachowaj sondy w temperaturze -20 °C do 2-3 razy ponownego użycia). Prać w temperaturze 60 °C przez 10 min.
   3. Umyć trzykrotnie w temperaturze 60 °C w 2x SSC-Tween (po 20 minut z mieszaniem).
   4. Prać trzykrotnie w temperaturze 60 °C w 0,2x SSC-Tween (po 20 minut z mieszaniem).
   5. Umyj dwa razy w MAB (RT) przez 15 minut każdy poziomo na bujaku.
   6. Dodać 1 ml MAB + blok. Prać 2 godziny pionowo na bujaku.
   7. Przenieść do 1 ml MAB + bloku zawierającego 1/2 000 Anti-digoxygenin-AP. Kołysz pionowo w temperaturze 4 °C O/N.
5. Przygotuj tkankę do odczynnika barwiącego.
   1. Zastąp roztwór przeciwciała roztworem MAB; umyj trzy razy w MAB po 5 minut poziomo na kołysce.
   2. Umyj trzy razy w MAB po 1 godzinie, poziomo na bujaku.
   3. Umyj dwa razy w buforze AP po 10 minut poziomo na kołysce.
   4. Przenieś tkankę do wielodołkowej plastikowej tacki, usuń bufor AP i dodaj odczynnik BM Purple (~1 ml). Pozwól, aby reakcja postępowała w ciemności 5 minut do O/N.
   5. Po uzyskaniu odpowiedniego zabarwienia przenieś tkankę do fiolek z PTw. Umyj dwa razy po 10 minut w PTw na kołysce.
   6. Utrwalić w roztworze Bouina w temperaturze 4 °C O/N na wahaczu.
   7. Umyj Bouin's trzema praniami 70% etanolu/30% PTw w RT. Przejdź do przechwytywania obrazu za pomocą epi-illuminacji i kamery zamontowanej pod mikroskopem, wybielając w razie potrzeby¹⁸.

5. Wybór i klonowanie Sib

1. Wybierz pulę o najwyższej aktywności (największa odpowiedź w tkance ektodermalnej).
2. Miareczkować (rozcieńczyć LB do odpowiedniej gęstości) zapas glicerolu dla puli o najwyższej aktywności i pokryć dziesięć nowych płytek około jedną dziesiątą kolonii z poprzedniego etapu (stosując sekcję 2 w powyższym protokole).
3. Zmniejsz rozmiar puli, dopóki aktywność nie zostanie przypisana do pojedynczej kolonii.
4. Uzyskać sekwencję DNA przy użyciu standardowych starterów w wektorze.

Results

W odpowiedzi na ekspresję mRNA wstrzykniętego do oocytów, odpowiadająca tkanka kapturka zwierzęcego została przetestowana pod kątem ekspresji otx2 przez hybrydyzację in situ (Rysunek 2 i Tabela 1); otx2 jest wyrażony w przypuszczalnej ektodermie soczewki (PLE) od zamknięcia cewy nerwowej przez pogrubienie plakodu soczewki¹⁹. Ponieważ jednak otx2 ulega również ekspresji w ektodermie przednich neuronów, a także w ektodermie gło...

Discussion

Opisana tutaj metoda funkcjonalnego klonowania genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie może być wykorzystana do identyfikacji szerokiego zakresu produktów genowych. Metoda ta rozszerza wcześniejsze prace, łącząc testy indukujące tkanki z technikami klonowania ekspresji. Wykorzystujemy szlaki metaboliczne oocytu Xenopus jako źródło produkcji czynników indukujących, bezpośrednio lub pośrednio, po wstrzyknięciu RNA. To, w połączeniu z zastosowaniem uznanych metod klonowania genu będącego pr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101	Badania rozwojowe przeciwciał Bank Hybridoma 12	/101	Przeciwciało monoklonalne do wykrywania tkanki mięśniowej
20x bufor SSC	Sigma	S6639	dla
bezwodnika octowego	Sigma	A6404	dla ISH
Anti-Dig-AP		Roche 11093274910	dla ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Oczyszczanie plazmidowego DNA
Odczynnik blokujący	Roche	11096176001	dla ISH
BM Purple	Roche	11442074001	dla pieca
do hybrydyzacji ISH Boekel	Fisher Scientific	13-245-121	dla
roztworu ISH Bouina	Sigma	HT10132	dla ISH
BSA	Sigma	A9647	dla OCM
CHAPS	Sigma	C3023	dla ISH
Kolagenaza A	Roche	10103578001	Defolikulacja oocytów
Cysteina	Sigma	C121800	Zarodki Dejelly
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	do
mieszanki znakowania ISH Dig-RNA		11277073910	do sond ISH
Kleszcze Dumont #5	World Precision Instruments	500233	do koperty Vitelline usuwanie
3-aminobenzoesanu etylu	Sigma	A5040	MS222 znieczulenie
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	do mediów iniekcyjnych
Formamid	Sigma	F9037	dla ISH
Siarczan gentamycyny	Sigma	G1914	do
OCM Kapilary szklane	World Precision Instruments	4878	3.5" długość, I,D, 0,530 mm
Szklane fiolki na próbki	Fisher Scientific	06-408B	dla ISH
Pętla			Włosy umieszczone w pipecie Pasteura do manipulacji tkankami
Sól sodowa heparyny	Sigma	H4784	do
wtryskiwacza ISH Nanolitr 2010	World Precision Instruments	Nanolitr 2010	Mikrowtryskiwacz sterowany mikroprocesorem
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Sól do odzyskiwania żab
IRBG XGC Xenopus zweryfikowana pełnowymiarowa kamera cDNA	Źródło Nauki biologiczne	989_IRBG	biblioteka cDNA
LB Płytki agarowe ze 100 &mikro; g/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm wstępnie wylane płytki LB-Amp do selekcji sib
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB do zbierania kolonii w selekcji sib z płytek i rozcieńczania kultur
Magnetyczny zestaw do izolacji mRNA	New England BioLabs	S1550S	do izolacji RNA wzbogaconego w poli(A)
Kwas maleinowy	Sigma	M0375	dla ISH
Ręczny mikromanipulator Microfil	World Precision Instruments	M3310R	Ręczny mikromanipulator
Mikser nutujący	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker do ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Glina do naczyń iniekcyjnych i preparacyjnych
buforowana fosforanem	Sigma	P5368	dla ISH
PMSG	Sigma	G4877	w celu stymulacji rozwoju oocytów
Poliwinylopirolidon	Sigma	PVP40	dla
programowalnego ściągacza	World Precision Instruments	PUL-1000	Ściągacz igieł do mikropipet
Proteinaza K	Sigma	P6556	dla ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	Budowa biblioteki cDNA
System kombinowany rybosondy	Promega	P1450	in vitro transkrypcja
Indeks górny Pełnowymiarowy zestaw do budowy biblioteki cDNA Life	Technologies	18248013	zestaw do budowy biblioteki cDNA
Szewy, jedwab 3-0	Fisher Scientific	19-037-516	Nić i igła do szycia po usunięciu oocytów
Torula RNA	Sigma	R3629	dla ISH
Trietanoloamina	Sigma	T1502	dla ISH
Tween 20	Sigma	P9416	dla
uniwersalnego systemu syntezy cDNA ryboklonu	ISH Promega	C4360	Alternatywny zestaw do budowy biblioteki cDNA
Xenopus Pełne klony wejściowe ORF - ORFeome	Collaboration Źródło: Bioscience	5055_XenORFeome	Klony ORFeome
XL2-Blue Ultrakompetentne komórki	Agilent Technologies	200150	do transformacji cDNA biblioteka