Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Summary

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Abstract

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledzinowej myszy myszy (RSC) przy użyciu mikroskopii dwufotonowej in vivo w transgenicznej linii myszy Thy1-GFP. Takie podejście stwarza możliwość zbadania korelacji manipulacji behawioralnych ze zmianami w morfologii neuronów in vivo.

Procedura implantacji okna czaszkowego była uważana za ograniczoną tylko do łatwo dostępnych obszarów kory mózgowej, takich jak pole beczkowe. Nasze podejście pozwala na wizualizację neuronów w silnie unaczynionym RSC. RSC jest ważnym elementem obwodu mózgowego odpowiedzialnego za pamięć przestrzenną, wcześniej uważanym za problematyczny w obrazowaniu dwufotonowym in vivo.

Implantacja okna czaszkowego nad RSC jest połączona z wstrzyknięciem rekombinowanego wirusa adeno-związanego z ekspresją mCherry (rAAV^mCherry) do grzbietowego hipokampa. Ekspresja mCherry rozprzestrzenia się na projekcje aksonalne od hipokampa do RSC, umożliwiając wizualizację zmian zarówno w presynaptycznych boutonach aksonalnych, jak i postsynaptycznych kolcach dendrytycznych w korze.

Ta technika pozwala na długoterminowe monitorowanie zależnej od doświadczenia plastyczności strukturalnej w RSC.

Introduction

Mikroskopia dwufotonowa zrewolucjonizowała obserwację aktywności mózgu u żywych i zachowujących się zwierząt. Od czasu wprowadzenia na rynek w 1990 roku szybko zyskało popularność i jest obecnie wdrażane jako jedno z najciekawszych i najbardziej innowacyjnych podejść do badania wielu aspektów aktywności mózgu in vivo ^1,2. Zastosowania te obejmują pomiary przepływu krwi, aktywację neuronów (np. za pomocą wskaźników poziomu wapnia lub natychmiastowej wczesnej ekspresji genów) oraz morfologię komórek neuronalnych. Coraz więcej laboratoriów korzysta z mikroskopów dwufotonowych, wdrażając tę technikę w całym świecie naukowym jako nowy standard obrazowania mózgu in vivo.

Standardowe podejście polega na wszczepieniu okna czaszkowego (okrągłego otworu w czaszce pokrytego szkłem nakrywkowym) nad lufą lub korą wzrokową mózgu myszy ³. Następnie, w zależności od protokołu eksperymentalnego, mysz przechodzi serię sesji wizualizacji i treningu behawioralnego, co pozwala monitorować zmiany w aktywności mózgu i morfologii neuronów w czasie ^4,5. W obu przypadkach kraniotomia dotyczy tylko kości ciemieniowej, bez krzyżowania szwów. Powszechnie uważa się, że główną wadą tej techniki jest jej ograniczone zastosowanie do łatwo dostępnych kory mózgowej, takich jak beczka lub kora wzrokowa. Implantacja okna czaszki nad innymi obszarami stwarza wiele trudności ze względu na nadmierne krwawienie i/lub utrudnienia przestrzenne.

W tym artykule proponujemy wszczepienie okna czaszkowego powyżej kory zaśledziony (RSC) jako kolejny możliwy obszar zainteresowania dla mikroskopii dwufotonowej in vivo ⁶. RSC jest ważnym elementem obwodu mózgowego odpowiedzialnym za tworzenie pamięci przestrzennej. Anatomicznie RSC jest częścią sieci neuronalnej łączącej regiony korowe, hipokampowe i wzgórzowe ⁷. Jest silnie zaangażowany w szereg zachowań, takich jak uczenie się przestrzenne i wymieranie, a także nawigacja przestrzenna ⁶.

Aby zobrazować zmiany morfologiczne neuronów, używamy transgenicznej linii myszy wyrażającej zielone białko fluorescencyjne (GFP) pod promotorem thy1. U tych myszy GFP ulega ekspresji w około 10% neuronów w mózgu, co pozwala na wyraźną wizualizację aksonów korowych i dendrytów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej ⁸. Kolejną innowacją, którą proponujemy, jest wstrzyknięcie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 2/1 (rAAV2/1) kodującego białko czerwonej fluorescencji (mCherry) pod specyficznym dla neuronu promotorem camkii ⁹ do głębszych struktur mózgu rzutujących na RSC, takich jak hipokamp. Ekspresja rAAV2/1^mCherry w hipokampie myszy Thy1-GFP pozwala na jednoczesną wizualizację elementów pre- i postsynaptycznych synaps hipokampowo-korowych ¹⁰. Ekspresja mCherry sterowana przez rAAV potrzebuje od dwóch do trzech tygodni, aby białko osiągnęło wystarczający poziom w końcach aksonalnych. Okres ten jest zgodny ze zwykłym czasem wymaganym do rekonwalescencji po kraniotomii.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk.

Uwaga: Niektóre sceny w powiązanym filmie są przyspieszone. W tych scenach wskazywany jest współczynnik prędkości.

1. Przygotowanie do operacji

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia, szklane pojemniki na płyny i waciki w autoklawie. Używaj jednorazowych rękawiczek. Wyczyść stół chirurgiczny, ramę stereotaktyczną i całe otoczenie 70% etanolem. Użyj sterylnej podkładki chirurgicznej, aby stworzyć sterylną przestrzeń dla całego wysterylizowanego sprzętu. Pokrój piankę żelową na małe kawałki i namocz je w sterylnej soli fizjologicznej.
   Uwaga: Zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowania, etanol nie jest ani środkiem sterylizującym, ani środkiem dezynfekującym wysokiego poziomu. Powinien być stosowany wyłącznie jako środek czyszczący/odtłuszczający na wcześniej wysterylizowanych powierzchniach.
2. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i ustaw poziom izofluranu na 5%, a przepływ tlenu na 2 l/min. Ta procedura powinna zająć około 3 minut.
3. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Użyj szczypania ogona lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone.
4. Za pomocą precyzyjnego trymera ogol włosy od tyłu głowy (między uszami) aż do oczu.
5. Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej i ustabilizuj głowę za pomocą nauszników.
6. Ustaw poziom znieczulenia na 1,5-2% izofluranu i 0,3 l/min tlenu.
7. Nałóż maść na oczy.
8. Zwierzę należy wstrzyknąć podskórnie tolfedynę (4 mg/kg), butomidor (2 mg/kg) i Baytril (5 mg/kg), aby zapobiec odpowiednio zapaleniu, bólowi i infekcji.
9. Wstrzyknąć zwierzęciu domięśniowo deksametazon (0,2 mg/kg), aby zapobiec obrzękowi mózgu.
   nuta: Możliwe jest wstrzyknięcie deksametazonu podskórnie lub dootrzewnowo w celu zapobieżenia uszkodzeniu mięśni.
10. Oczyść skórę za pomocą sterylnych wacików bawełnianych z Betadine, a następnie 70% etanolem.
11. Zmień rękawice i spryskaj je 70% etanolem.
    nuta: Podczas używania rękawiczek jednorazowych nie należy dotykać sterylnego pola. Dotykaj zwierzęcia wyłącznie końcówkami sterylnych narzędzi chirurgicznych i sterylnymi wacikami.

2. Chirurgia okna czaszkowego

1. Podnieś skórę kleszczami i za pomocą mikronożyczek nacinaj skórę poziomo wzdłuż podstawy głowy, a następnie ukośnie do przedniego punktu między oczami. Zdjąć płatek skóry.
2. Nałóż maść lidokainową za pomocą sterylnego wacika na okostną, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu i bólowi.
3. Użyj sterylnych wacików bawełnianych lub skalpela, aby usunąć okostną. Osusz czaszkę sterylnymi wacikami.
4. Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie skóry, aby je unieruchomić i zapobiec kontaktowi z cementem dentystycznym. Poczekaj, aż klej wyschnie.
5. Połóż sterylne szkło nakrywkowe o średnicy 3 mm na czaszce z przodu szwu lambdoidalnego. Wyśrodkować szkiełko nakrywkowe na współrzędnych RSC: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Zaznacz krawędzie szkiełka nakrywkowego, drapiąc powierzchnię czaszki sterylną igłą. Włóż szkło nakrywkowe z powrotem do sterylnego pojemnika z 70% etanolem.
6. Użyj szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z zadziorem o małej średnicy, aby obrysować okrąg o średnicy 3 mm. Oczyść miejsce wiercenia z pyłu kostnego za pomocą sterylnych wacików nasączonych solą fizjologiczną. Użyj pianki żelowej i wacików, aby zatrzymać sporadyczne krwawienie i oczyścić kość.
7. Pomiędzy wierceniem sprawdź grubość kości za pomocą cienkich kleszczy, delikatnie dotykając koła kości i sprawdzając jej ruchomość. Należy pamiętać, że kość jest grubsza w obszarze szwu. Przerwij wiercenie, gdy koło kostne jest ruchome, a na obwodzie pozostaje tylko równa, cienka warstwa kości. Oczyść pole operacyjne z całego pozostałego pyłu kostnego za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną.
8. Upuść sterylną sól fizjologiczną na obszar wiercenia, zakrywając wywiercony okrąg. Ostrożnie podważ krąg kostny cienkimi kleszczami, a następnie delikatnie, ale stanowczo usuń kość, podnosząc ją do góry. Uważaj, aby nie przekrzywić kręgu kostnego podczas jego podnoszenia, aby zapobiec możliwemu uszkodzeniu opony twardej.
9. Delikatnie nałóż piankę żelową nasączoną sterylną solą fizjologiczną na oponę twardą, aby zatrzymać krwawienie. Poczekaj, aż krwawienie zostanie całkowicie zatrzymane. Ostrożnie usuń piankę żelową, aby nie zakłócać procesu krzepnięcia.
   Uwaga: Obszar szwu jest silnie unaczyniony, więc krwawienie w tym momencie może okazać się głębokie. Konieczne jest odczekanie odpowiedniego czasu, aż krwawienie całkowicie się zatrzyma. Pomocne jest utrzymanie nasączonej solą pianki żelowej w stanie schłodzonym poprzez umieszczenie jej na lodzie.

3. Wstrzyknięcie wirusa

1. Podłącz pompę infuzyjną do wieży stereotaktycznej i podłącz sterownik.
2. Wprowadzić igłę 35G do strzykawki. Przepłukać strzykawkę 10 razy etanolem, aby ją wysterylizować i 10 razy sterylnym solem fizjologicznym, aby usunąć ślady etanolu. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Włożyć strzykawkę do pompy.
   Uwaga: Rozważ użycie innych środków dezynfekujących.
3. Rozmrozić pojedynczą dawkę preparatu rAAV2/1^mCherry (zalecane 10¹² pfu) i przechowywać na lodzie. Napełnić strzykawkę roztworem wirusa.
4. Wyśrodkuj igłę na bregmie, a następnie delikatnie włóż do hipokampa, używając następujących współrzędnych: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Współrzędne te będą znajdować się w pobliżu krawędzi kraniotomii. Odczekaj 5 minut, aż tkanka się ustabilizuje.
5. Wstrzyknąć 0,7 μl roztworu rAAV2/^{1 mCherry} z szybkością 50 nl/min. Odczekać 10 minut, aż wirus w pełni się zaadsorbuje. Delikatnie wyjąć igłę. Osusz pianką żelową, jeśli wystąpi krwawienie. Powtórz z miejscem po stronie przeciwnej.

4. Implantacja okna czaszkowego

1. Połóż sterylne, wysuszone szkło nakrywkowe na wierzchu opony twardej w wywierconej ramie okrągłej. Przytrzymaj szkło nakrywkowe kleszczami, aby delikatnie spłaszczyć oponę twardą i zbliżyć krawędzie szkła nakrywkowego do powierzchni czaszki.
   nuta: Możliwe jest, że szkło nakrywkowe przerwie skrzep i krwawienie zostanie wznowione. W takim przypadku podnieś szklankę nakryciową, umieść ją w alkoholu, wysusz i wróć do kroku 2.9.
2. Za pomocą sterylnej igły nałóż gęsty klej cyjanoakrylowy na krawędzie szkła nakrywkowego, aby przymocować je do czaszki. Poczekaj, aż klej wyschnie.
3. Umieść pręt mocujący (nakrętka M2 lub wykonany na zamówienie projekt) w przedniej części czaszki. Nałóż klej cyjanoakrylowy na krawędzie pręta. Poczekaj, aż klej wyschnie.
   1. Umieść listwę stabilizującą w pozycji, która umożliwi poziome ustawienie okna czaszki podczas sesji obrazowania. Umieść go jak najdalej od okna. Jeśli zostanie umieszczony zbyt blisko okna, pręt i śruba łącząca go z wykonanym na zamówienie uchwytem mogą stanowić przeszkodę dla obiektywu podczas procesu obrazowania.
4. Przygotuj akryl dentystyczny i nałóż go na powierzchnię czaszki wokół szkła. Pomocne jest uformowanie wokół okna kształtu przypominającego krater. Stworzy to wgłębienie dla wody nałożonej później do obrazowania za pomocą obiektywu wodnego.
5. Utwórz czapkę z akrylem dentystycznym, zakrywającą resztę obszaru operacyjnego, krawędzie skóry, listwę mocującą, wzmacniając krater wokół okna czaszki. Poczekaj, aż cement dentystyczny stwardnieje.
6. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je w komorze rekonwalescencji.
7. Poczekaj, aż zwierzę dojdzie do siebie po operacji, obserwując funkcje fizjologiczne.
8. Stosować analgezję pooperacyjną (karprofen, 10 mg/kg) i antybiotyki (baytril, 5 mg/kg) przez 48 godzin.

5. Obrazowanie

1. Uruchom laser Ti:Sapphire, włącz mikroskop. System wykorzystany w tym eksperymencie wyposażony jest w laser dwufotonowy, system OPO oraz podwójny GaAsP PMT.
2. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie.
3. Wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej i umieścić je w masce do znieczulenia gazowego pod mikroskopem. Zmniejsz przepływ tlenu do 0,3 l/min, a stężenie izofluranu do 1,5-2%.
4. Przymocuj zwierzę do niestandardowej ramy mikroskopu za pomocą M2 (lub innego niestandardowego systemu). Wypoziomuj okno czaszki.
   nuta: Możliwe jest zastosowanie systemu mocowania głowicy producenta mikroskopu, chociaż specyficzna niestandardowa rama daje lepsze wyniki (lepsza stabilność głowicy, stałe pozycjonowanie w wielu sesjach podczas przewlekłego eksperymentu).
5. Korzystając z ustawień mikroskopu szerokokątnego i obiektywu o małym powiększeniu, wyśrodkuj widok na jednej ze stron kory zaśledziłowej i skoncentruj go na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
6. Nałóż kroplę wody do akrylowej studzienki przypominającej krater. Przełącz się na długodystansowy obiektyw do zanurzenia w wodzie. Przesuń obiektyw w kierunku okna czaszki, aż łąkotka wodna połączy próbkę z obiektywem.
7. Przełącz się na ustawienia dwufotonowe i rozpocznij skanowanie próbki od góry do dołu przy użyciu najmniejszego powiększenia. Przejście opony twardej będzie widoczne jako olśnienie silnego, niespecyficznego sygnału.
8. Dostosuj ustawienia akwizycji mikroskopu w obu kanałach (GFP i mCherry) zgodnie z siłą sygnału z ogniw fluorescencyjnych, aby pokryć cały zakres dynamiki.
9. Po znalezieniu odpowiedniego neuronu (z drzewem dendrytycznym oddzielonym od innych komórek) wykonaj wstępne skanowanie, używając tylko zestawu filtrów GFP z najmniejszym powiększeniem i odległością z wynoszącą 5 mikronów.
10. Uzyskaj maksymalny rzut zeskanowanego stosu i wydrukuj go w celu opatrzenia adnotacjami (używając odwróconych kolorów).
11. Ustaw powiększenie na wartość, która pozwoli na zobrazowanie pożądanych szczegółów morfologicznych. Zobrazuj całe drzewo dendrytyczne w kanałach GFP i mCherry, używając maksymalnej projekcji jako przewodnika.

Results

Ekspresja GFP w podzbiorze neuronów u myszy reporterowej Thy1-GFP umożliwia obrazowanie in vivo dendrytów korowych i lokalnych projekcji aksonalnych w RSC. Rysunek 1A przedstawia maksymalną projekcję stosu obrazów z widocznymi wieloma dendrytami dodatnimi GFP. Ciało komórki jest zasłonięte przez tętnicę. Rysunek 1B przedstawia powiększony obraz w pojedynczej płaszczyźnie (zoom cyfrowy 3x) gałęzi dendrytycznej wskazanej w 1A. Szczegóły morfologii ...

Discussion

W niniejszej pracy przedstawiono protokół jednoczesnego dwufotonowego obrazowania in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w RSC przez okno czaszkowe. Procedura implantacji składa się z kilku kluczowych etapów. Najpierw zwierzę jest głęboko znieczulane i mocowane w ramie stereotaktycznej, następnie czaszka nad RSC jest rozrzedzana wiertłem wzdłuż zaznaczonych okrągłych linii i usuwana jest okrągła kość. Po zatrzymaniu krwawienia rAAV2/1^mCherry wstrzykuje się do hipokampa, a szkło nakrywko...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lek
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% przedoperacyjne
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% podczas operacji
Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg domięśniowo
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg podskórnie
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg podskórnie
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg podskórnie
Karprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg podskórnie
Lidokaina	Jelfa	Lignocainum	miejscowo
Lidokaina	Jelfa	20 mg/g	miejscowo
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dentystyczny; REF MS0005
Maść do oczu	Dedra	Lubrithal	miejscowo
klej CA	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental akryl	SpofaDental	Duracryl Plus
Ramka stereotaktyczna	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Aparatura	HSE-64-0720	Średnica 3 mm
Wiertło dentystyczne	Sigmed	Keystone KVet
Pręt mocujący	niestandardowych	śrubowych N/A	M2 lub M3
Kleszcze	Renex	PN-7B-SA
Mikronożyczki	Falcon	BM.183.180
Mikroskop preparacyjny	KOZO	XTL6445T
Obrazowanie< / strong>
Ramka uchwytu	Wykonany na zamówienie	mikroskop dwufotonowy Zeiss
		Upright Axio Examiner Z1	Jednostka laserowa: Koherent Chameleon 690-1040nm z optycznym oscylatorem parametrycznym 1050-1300nm. Obiektywy: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0,1 i LD Plan-APOCHROMAT 20x/1,0. Detekcja: Filtry pasmowoprzepustowe Zeiss BP 500-550 (GFP) i BP 570-610 (mCherry) oddzielone rozdzielaczem wiązki przy 560 nm i sprzężone z dwoma fotodetektorami GaAsP.
Reagent
Virus	prezent od K. Deisseroth		Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) wykazujący ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry pod kontrolą promotora CaMK