Artykuł metodologiczny

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 stycznia 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinozytydy (PtdInsPs) są niezbędnymi lipidami sygnałowymi odpowiedzialnymi za rekrutację określonych efektorów i nadawanie organellom tożsamości i funkcji molekularnej. Każdy z siedmiu PtdInsP różni się rozmieszczeniem i liczebnością, które są ściśle regulowane przez określone kinazy i fosfatazy. Liczebność PtdInsP może ulegać gwałtownym zmianom w odpowiedzi na różne zdarzenia sygnalizacyjne lub zakłócenia w działaniu mechanizmów regulacyjnych. Aby zrozumieć, w jaki sposób zdarzenia te prowadzą do zmian w ilości PtdInsP i ich wynikającego z tego wpływu, ważne jest ilościowe określenie poziomów PtdInsP przed i po zdarzeniu sygnalizacyjnym lub między stanami kontrolnymi i nieprawidłowymi. Jednak ze względu na ich niską liczebność i podobieństwo, ilościowe określenie względnych ilości każdego PtdInsP może być trudne. W tym artykule opisano metodę ilościowego określania poziomów PtdInsP poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3H-mio-inozytolem, który jest włączony do PtdInsPs. Fosfolipidy są następnie wytrącane i deacylowane. Powstałe rozpuszczalne 3H-glicero-inozytydy są dalej ekstrahowane, rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i wykrywane przez scyntylację przepływową. Szczegółowo opisano etykietowanie i przetwarzanie próbek drożdży, a także konfigurację instrumentalną dla HPLC i scyntylatora przepływowego. Pomimo utraty informacji strukturalnych dotyczących zawartości łańcucha acylowego, metoda ta jest czuła i może być zoptymalizowana w celu jednoczesnego ilościowego oznaczania wszystkich siedmiu PtdInsP w komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinozytydy (PtdInsPs) są ważnymi fosfolipidami sygnałowymi, które pomagają regulować różne funkcje komórkowe, w tym transdukcję sygnału, transport błonowy i ekspresję genów, które następnie modulują zachowanie komórki wyższego rzędu, takie jak podział komórki, tożsamość organelli i aktywność metaboliczna1-3. Istnieje siedem gatunków PtdInsP, które pochodzą z fosforylacji 3, 4 i / lub 5 pozycji grupy głównej inozytolu fosfatydyloinozytolu (PtdIns), macierzystego fosfolipidu. Co ważne, siedem PtdInsP jest rozmieszczonych nierównomiernie, a lokalne stężenie każdego gatunku PtdInsP może wzrastać lub zmniejszać się w określonych miejscach subkomórkowych, w których wiążą się z odrębnym zestawem efektorów białkowych, co razem pozwala każdemu PtdInsP kontrolować tożsamość i funkcję błony gospodarza3,4. Ponadto poziomy każdego PtdInsP muszą być ściśle kontrolowane, ponieważ może to znacząco wpłynąć na intensywność sygnału wytwarzanego przez PtdInsP. Lokalizacja i poziomy każdego PtdInsP zależy od ukierunkowania i aktywności licznych kinaz lipidowych, fosfataz i fosfolipaz, które pośredniczą w syntezie i obrocie każdego PtdInsP3,4. W związku z tym nieprawidłowa regulacja mechanizmu regulacyjnego PtdInsP może zaburzać funkcjonowanie komórek, prowadząc do chorób takich jak rak i choroby zwyrodnieniowe2,5,6. Aby w pełni zrozumieć rolę i funkcje PtdInsP i ich mechanizmów regulacyjnych, opracowano zarówno techniki oparte na mikroskopii, jak i biochemiczne w celu śledzenia i ilościowego określania PtdInsP.

W wielu przypadkach PtdInsP wiążą się ze swoimi efektorami białkowymi poprzez specyficzną domenę białkową7-9. Te moduły białkowe często zachowują swoje prawidłowe właściwości fałdowania i rozpoznawania lipidów, gdy są wyrażane oddzielnie od całego białka. W ten sposób powstały sondy PtdInsP polegające na fuzji specyficznej domeny białka wiążącego PtdInsP z białkiem fluorescencyjnym (FP), takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP), w celu subkomórkowego wykrywania PtdInsP za pomocą mikroskopii. Rzeczywiście, w wielu badaniach wykorzystano moduły białkowe wiążące PtdInsP z fuzją FP w celu identyfikacji lokalizacji i dynamiki określonych gatunków PtdInsP za pomocą obrazowania żywych komórek1,10. Na przykład domena homologii Pleckstrin (PH) fosfolipazy C δ1 (PLCδ1) połączonej z GFP specyficznie rozpoznaje fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan [PtdIns(4,5)P2] na błonie plazmatycznej, podczas gdy tandemowe kopie domeny FYVE wczesnego antygenu endosomowego 1 (EEA1) zostały wykorzystane do śledzenia fosfatydyloinozytolu-3-fosforanu (PtdIns3P) na endosomach10-13. Ogólnie rzecz biorąc, techniki oparte na mikroskopii doskonale nadają się do wizualizacji lokalizacji i dynamiki PtdInsP, ale istnieje kilka zastrzeżeń, w tym to, że domeny wiążące PtdInsP mogą również wchodzić w interakcje z dodatkowymi czynnikami innymi niż docelowe gatunki PtdInsP i że nie mogą wykryć zmian poniżej cytozolowej fluorescencji sond FP.

Techniki biochemiczne, w tym chromatografia cienkowarstwowa, spektrometria mas i znakowanie radioizotopowe, mogą być również używane do charakteryzowania i ilościowego określania poziomów każdego PtdInsP14-16. Metody te wymagają izolacji lipidów w celu wykrycia poziomów komórkowych PtdInsP. Spektrometria mas może być stosowana do charakteryzowania fosfolipidów z ekstraktów lipidowych i jest nieoceniona w określaniu składu łańcucha acylowego PtdInsPs14,17. Jednak spektrometria mas jest w większości półilościowa i nadal trudno jest wyodrębnić i jednocześnie określić ilościowo gatunki PtdInsP o tej samej masie cząsteczkowej14,17. Dla porównania, znakowanie radioizotopowe PtdInsP, a następnie wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) sprzężona ze scyntylacją przepływową jest przydatne do separacji i jednoczesnej kwantyfikacji wszystkich siedmiu gatunków PtdInsPs18. Zastosowanie HPLC z kolumną silnej wymiany anionowej (SAX) pozwala na separację na podstawie masy cząsteczkowej, ładunku i kształtu, frakcjonując w ten sposób deacylowane PtdInsP (Gro-InsPs) nawet o tej samej masie cząsteczkowej i ładunku. Sprzężenie eluentu HPLC ze scyntylatorem przepływowym generuje następnie piki sygnału na bazie radioaktywnej dla każdego gatunku Gro-InsPs w stosunku do pierwotnego macierzystego glicerolu-inozytolu (Gro-Ins)18. Ostatecznie odpowiada to względnym poziomom PtdInsP w komórkach.

Radioznakowanie PtdInsP i scyntylacja przepływowa sprzężona z HPLC jest użytecznym narzędziem do badania regulacji i funkcji 3,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu [PtdIns(3,5)P2], PtdInsP, który stanowi tylko ~0,1-0,3% PtdIns16,19,20. Syntezę PtdIns(3,5)P2 przeprowadza kinaza 5-PtdIns3P zwana Fab1 u drożdży i PIKfyve u ssaków21. Reakcji tej przeciwdziała 5-fosfataza PtdIns(3,5)P2 zwana Fig4 u drożdży lub mFig4 / Sac3 u ssaków22-24. Co ciekawe, zarówno PIKfyve/Fab1, jak i mFig4/Fig4/Sac3 występują w jednym kompleksie i są regulowane przez białko adaptora rusztowania, Vac14 u drożdży lub mVac14/ArPIKfyve u ssaków25,26. W komórkach drożdży z delecją VAC14 Fab1 nie działa wydajnie, co prowadzi do 90% spadku poziomu PtdIns(3,5)P2 27,28. Z drugiej strony, Atg18 jest białkiem efektorowym PtdIns(3,5)P2, które może kontrolować rozszczepienie wakuolarne 29. Atg18 jest również negatywnym regulatorem PtdIns(3,5)P2, ponieważ delecja jego genu, ATG18, powoduje 10 do 20-krotny wzrost poziomu PtdIns(3,5)P2 29,30. Ogólnie rzecz biorąc, zmiany poziomów PtdIns(3,5)P2 poważnie wpływają na funkcję wakuoli drożdży i lizosomów ssaków, w konsekwencji wpływając na procesy takie jak transport błonowy, dojrzewanie fagosomów, autofagia i transport jonów 6,19,21,31.

Ten artykuł opisuje proces znakowania radioizotopowego PtdInsP za pomocą 3H-mio-inozytolu w drożdżach w celu wykrycia względnych poziomów PtdIns(3,5)P2 w szczepach drożdży typu dzikiego, vac14Δ i atg18Δ. Na tym przykładzie przedstawiono możliwości rozdzielcze HPLC w zakresie separacji poszczególnych PtdInsP, a także czułość scyntylacji przepływowej do wykrywania śladowych ilości 3H-mio-inozytolu. Wyjaśniamy również, w jaki sposób można zoptymalizować metodologię znakowania i oddzielania 3PtdInsP znakowanych H od komórek ssaków, których próbki są zwykle bardziej złożone, ponieważ komórki te posiadają wszystkie siedem gatunków PtdInsP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Poniższy tekst szczegółowo opisuje metodę pomiaru PtdInsP w drożdżach. Dostarcza szczegółów eksperymentalnych dotyczących znakowania komórek drożdży za pomocą 3 H-mio-inozytolu, ekstrakcji i deacylacji lipidów oraz protokołu elucji HPLC w celu frakcjonowania i ilościowego oznaczania zdeacylowanych PtdInsP. Należy pamiętać, że znakowanie, deacylacja, rozdzielczość i kwantyfikacja PtdInsP w komórkach ssaków wymagają optymalizacji i dłuższych profili elucji HPLC. Szczegóły te można znaleźć w innym miejscu, choć niektóre aspekty omawiamy w Dyskusji. Ogólnie rzecz biorąc, podano metodologię ekstrakcji lipidów, deacylatu i ekstrakcji rozpuszczalnych w wodzie Gro-InsP z drożdży i zilustrowano ją na rysunku 1.

1. Protokół etykietowania i analizy PtdInsP w drożdżach

  1. Hodowla komórkowa i znakowanie radioizotopem
    1. Wyhodować 20 ml płynnej kultury szczepu drożdży SEY6210 w temperaturze 30 °C z ciągłym wytrząsaniem w kompletnych pożywkach syntetycznych do fazy środkowej logarytmu lub do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) około 0,6-0,7,
      Uwaga: Nie należy używać pożywek YPD, ponieważ może to wpłynąć na włączenie 3H-mio-inozytolu. Taka wielkość hodowli powinna zapewnić wystarczającą ilość materiału na 2-3 serie HPLC.
    2. Osadzać w sumie 10-14 OD komórek drożdży (należy zauważyć, że 1 ml kultury o OD600 = 1 zawiera ~1x107 komórek) przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w 12 ml probówce okrągłodennej. Zawiesić w 2 ml pożywki wolnej od inozytolu (IFM) (patrz Tabela 1 dla składu IFM).
    3. Powtórzyć wirowanie i odessać pożywkę. Zawiesić osad w 440 μl IFM i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    4. Dodać 60 μl 3 H-mio-inozytolu (1 μl = 1 μCi) do każdej próbki i inkubować w temperaturze wzrostu 30 °C przez 1 do 3 godzin, stale wstrząsając.
      Uwaga: 3H-mio-inozytol jest materiałem radioaktywnym, z którym należy obchodzić się po odpowiednim przeszkoleniu. Ponadto wszystkie materiały eksploatacyjne, które mają kontakt z materiałem zawierającym 3H, powinny być odpowiednio zutylizowane i oznaczone jako odpady radioaktywne.
      Uwaga: Temperaturę wzrostu można zmienić w zależności od potrzeb, o ile wszystkie porównywane szczepy są uprawiane w tej samej temperaturze.
    5. Przenieść zawiesinę komórek (500 μl) do probówki mikrowirówki zawierającej 500 μl 9% kwasu nadchlorowego i 200 μl szklanych kulek przemytych kwasem. Wymieszać przez odwrócenie i inkubować na lodzie przez 5 minut.
    6. Wirować próbkę z maksymalną prędkością przez 10 minut i przenieść lizaty do nowej probówki do mikrowirówki za pomocą końcówki z żelem, aby uniknąć szklanych kulek.
    7. Osadzać próbkę w objętości 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odsysać supernatant.
    8. Zawiesić osad przez sonikację kąpieli w 1 ml lodowatego 100 mM EDTA. Pellet ponownie jak poprzednio.
  2. Deacylacja i ekstrakcja
    1. Świeżo przygotować 5,0 ml odczynnika deacylacyjnego, łącząc 2,3 ml metanolu, 1,3 ml 40% metyloaminy, 0,55 ml 1-butanolu i 0,80 ml wody. Odwróć, aby wymieszać.
    2. Odessać EDTA i poddać sonikacji osad w 50 μl wody.
    3. Dodać 500 μl odczynnika deacylacyjnego i dokonać sonikacji do wymieszania. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    4. Podgrzewaj lipidy przez 50 minut w temperaturze 53 °C w bloku grzewczym. Próbki należy całkowicie wysuszyć przez wirowanie próżniowe przez 3 godziny lub O/N.
      1. Upewnij się, że między wirówką próżniową a pompą próżniową zainstalowana jest pułapka chemiczna, aby zapobiec przedostawaniu się oparów do powietrza.
    5. Zawiesić osad w 300 μl wody metodą sonikacji w kąpieli i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Suszyć próbki przez wirowanie próżniowe przez 3 godziny lub O/N. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
    6. Sonikować osad za pomocą 450 μl wody. Jest to faza wodna podczas ekstrakcji.
    7. Świeżo przygotować 10 ml odczynnika ekstrakcyjnego, dodając 8,0 ml 1-butanolu, 1,6 ml eteru etylowego i 0,40 ml mrówczanu etylu. Odwróć, aby wymieszać.
    8. Dodać 300 μl odczynnika ekstrakcyjnego do fazy wodnej. Wirować mieszaninę na najwyższych obrotach przez 5 minut i oddzielać warstwy przez odwirowywanie na najwyższych obrotach (18 000 x g) przez 2 minuty.
    9. Zbierz dolną warstwę wodną do nowej probówki do mikrofuge, unikając górnej warstwy organicznej, granicy faz i osadu. Powtórzyć ekstrakcję fazy wodnej jeszcze dwa razy świeżym odczynnikiem ekstrakcyjnym.
    10. Całkowicie wysuszyć zebraną warstwę wodną przez wirowanie próżniowe. Rozproszyć osad w 50 μl wody metodą sonikacji w kąpieli.
    11. Dodać 2 μl każdej próbki do 4 ml płynu scyntylacyjnego w 6 ml fiolki scyntylacyjnej z polietylenu. Określić liczbę zliczeń (w CPM) w każdej próbce za pomocą scyntylacji cieczy przy użyciu otwartego okna.
    12. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą gotowe do HPLC.
  3. Rozdzielanie 3H-glicero-inozytydów metodą HPLC
    1. Przygotować bufor A, filtrując 1 l ultraczystej wody za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm od góry butelki, a następnie odgazowując.
    2. Przygotować bufor B, sporządzając 1 l roztworu 1 M dwuzasadowego fosforanu amonu (APS, MW 132.06) w wodzie i dostosować pH do 3,8 kwasem fosforowym. Przefiltrować fosforan amonu za pomocą górnego filtra próżniowego 0,22 μm, a następnie odgazować.
    3. Skompletować fiolkę do wstrzykiwań, wyposażając fiolkę o pojemności 2 ml w sprężynową wkładkę o małej objętości 250 μl. Załaduj 10 milionów CPM i dodaj wodę, aby uzyskać całkowitą objętość 55 μl. Przygotować ślepą fiolkę z 55 μl wody.
    4. Zakręcić fiolki nakrętkami wyposażonymi w przegrodę z PTFE/silikonu (czerwona strona skierowana do wnętrza fiolki). Umieścić każdą fiolkę w tacce do automatycznego pobierania próbek HPLC, zaczynając od fiolki ślepej.
    5. Użyj HPLC i powiązanego oprogramowania, które kontroluje przepływ bufora, odgazowuje i kontroluje wstrzykiwanie próbki. Użyj scyntylatora przepływu online i powiązanego z nim oprogramowania, aby regulować natężenie przepływu scyntylacji i monitorować sygnał zaniku 3H.
      1. Użyć kolumny do chromatografii cieczowej SAX o wymiarach 250 mm x 4,6 mm i zawierającej w HPLC żywicę krzemionkową o wielkości 5 μm. Wyposaż kolumnę w osłonę kolumny, aby zapobiec wstrzykiwaniu zanieczyszczeń.
      2. Zainstaluj w scyntylatorze przepływowym 3 komory przepływowej o pojemności 500 μl kompatybilnej z 3H.
        UWAGA: Frakcjonowanie można przeprowadzić za pomocą systemu HPLC Agilent 1200 serii infinity sterowanego przez oprogramowanie Chemstation lub za pomocą innych dostępnych na rynku systemów HPLC. Scyntylację przepływową eluentu HPLC można przeprowadzić za pomocą scyntylatora przepływowego β-RAM sterowanego przez oprogramowanie Laura lub innego dostępnego na rynku scyntylatora przepływowego lub kompatybilnego oprogramowania.
    6. Zainicjuj pompę czwartorzędową przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min ze 100% buforem A.
    7. Ustaw profil równowagi w HPLC, aby kontrolować gradient A i B (nazwij to "równowagą protokołu A"): 1% bufor B przez 5 minut, 1-100% B przez 5 minut, 100% B przez 5 minut, 100-1% B przez 5 minut, 1% B przez 20 minut. Ustaw limit ciśnienia na 400 bar, Natężenie przepływu 1,0 ml/min i czas pracy 30 minut.
    8. Ustawić profil elucji (rysunek 2) na HPLC, aby kontrolować gradient A i B (nazwij to "Protokołem A"): 1% B przez 5 minut, 1-20% B przez 40 minut, 20-100% B przez 10 minut, 100% B przez 5 minut, 100-1% B przez 20 minut, 1% B przez 10 minut. Ustaw limit ciśnienia na 400 bar, Natężenie przepływu 1,0 ml/min i czas pracy 90 minut.
    9. Skonfiguruj protokół detekcji w scyntylatorze przepływowym (nazwij go "detekcją protokołu A"), który będzie działał przez 60 minut, z natężeniem przepływu płynu scyntylacyjnego 2,5 ml/min i czasem przebywania 8,57 sekundy.
    10. Zaprogramować automatyczną sekwencję wstrzykiwania na HPLC tak, aby rozpoczynała się od ślepej próby wodnej w "Protokole A", a następnie każdej próbki znakowanej radioizotopem w "Protokole A". Zainicjuj sekwencję, gdy będzie gotowa.
    11. Podczas gdy przebieg jest nadal w protokole równoważenia, utwórz partię na scyntylatorze przepływowym, aby zmierzyć wszystkie próbki z "detekcją protokołu A". Wstrzyknięcie każdej nowej próbki zainicjuje "Protokół A" w HPLC, jednocześnie uruchamiając scyntylator przepływowy, aby rozpocząć "wykrywanie protokołu A".
    12. Po zakończeniu wszystkich przebiegów przepłukać HPLC, kolumnę i scyntylator przepływowy 100% buforem A przez 30 minut przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min.
  4. analiza danych
    1. Użyj oprogramowania Laura lub dowolnego innego oprogramowania, które może określić ilościowo widma chromatograficzne. Kroki opisane w tej sekcji przedstawiono na rysunku 3.
    2. Otwórz pliki, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierz plik nieprzetworzonych danych dla każdej próbki.
    3. W zakładce "chromatogramy" powiększ, aby rozciągnąć każdy z mniejszych pików (około 1000 zliczeń [oś y]) przy zachowaniu rozdzielczości czasowej. W razie potrzeby powiększ każdy pojedynczy szczyt.
    4. Zaznacz każdy ze szczytów do analizy za pomocą narzędzia "Dodaj ROI". Zidentyfikuj piki według czasu elucji: Parental Gro-Ins po 10 min, Gro-Ins3P po 18 min, Gro-Ins4P po 20 min, Gro-Ins(3,5)P2 po 29 min i Gro-Ins(4,5)P2 po 32 min.
    5. W zakładce "tabele regionów" zapisz "obszar (liczby)" każdego szczytu. Zwróć uwagę na czas "rozpoczęcia (mm:ss)" i czasu "zakończenia (mm:ss)" każdego szczytu.
    6. Aby odjąć tło, podświetl obszar przylegający do szczytu obejmujący ten sam czas. Odejmij liczbę zliczeń od odpowiedniego szczytu.
    7. Znormalizuj obszar każdego piku w stosunku do rodzicielskich Gro-Ins (wyrażony jako "% całkowitych PtdIns"). Następnie znormalizuj każdy z pików w każdym warunku eksperymentalnym w stosunku do warunku kontrolnego (wyrażonego jako "n-krotny wzrost w porównaniu z kontrolą").
      UWAGA: Normalizację każdego piku można również przeprowadzić w stosunku do całkowitej liczby, ale ponieważ rodzicielskie Gro-Ins są znacznie liczniejsze niż wszystkie inne PtdInsP, wyniki wydają się być podobne.
    8. Wyeksportuj dane do chromatografów, naciskając "Plik", "Zapisz jako..." i wybierz format pliku "CSV (oddzielony przecinkami)". Wykreśl dane w arkuszu kalkulacyjnym i przedstaw je w razie potrzeby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej metody, drożdżowe PtdInsP zostały metabolicznie znakowane 3 H-mio-inozytolem. Po znakowaniu fosfolipidy wytrącono kwasem nadchlorowym, a następnie przeprowadzono deacylację fosfolipidów i ekstrakcję rozpuszczalnych w wodzie Gro-InsP (ryc. 1). Na tym etapie ważne jest ilościowe określenie całkowitego sygnału promieniotwórczego związanego z wydobytymi Gro-InsP za pomocą scyntylacji cieczy, aby zapewnić wystarczający stosunek sygnału do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół eksperymentalny wymagany do ilościowego określenia poziomów komórkowych PtdnsP za pomocą scyntylacji przepływowej sprzężonej z HPLC z drożdży. Metodologia umożliwia metaboliczne znakowanie PtdInsP za pomocą 3H-mio-inozytolu, a następnie przetwarzanie lipidów i ekstrakcję rozpuszczalnych w wodzie 3H-Gro-InsP, frakcjonowanie i analizę HPLC. Za pomocą tej metody można określić ilościowo względne poziomy PtdInsP w komórkach w różnych warunkach, jak pokaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H. był wspierany przez Ontario Graduate Scholarship od rządu Ontario. Ten artykuł był możliwy dzięki finansowaniu posiadanemu przez R.J.B. z Rady Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii, Canada Research Chairs Program i Ryerson University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-ButanolBiobasicBC1800Odczynnik klasy
Fosforan amonu dwuzasadowyBioshopAPD001Klasa ACS
Siarczan amonuBiobasicADB0060Ultra czysty
automatyczny podajnikAgilentG1329BAgilent 1260 seria nieskończoności
BiotynaSigmaB4501
Kwas borowyBiobasicBB0044Klasa biologii molekularnej
Chlorek wapniaBiobasicCT1330Bezwodny, przemysłowy
pantotenian wapniaSigmaC8731
Siarczan miedzi(II)Sigma451657Bezwodny
D-glukozaBiobasicGB0219Bezwodny, biotechnologiczny
modyfikacja Dulbecco Eagle's MediumLife11995-065Z 4,5 g/L glukozy, 110 mg/L pirolanem, L-glutaminą
Modyfikacja biomedyczna Eagle's Medium MP przez Dulbecco0916429 Z 4,5 g/L glukozy, bez L-gluatminy, bez inozytolu
EDTABiobasicEB0107Bezkwasowy, ultra czysty
eter etylowyCaledon labs1/10/4700Bezwodny, odczynnik
klasy Mrówczan etyluSigma112682Klasa odczynnika
Płodowa surowica bydlęcaŻubr080-450Pochodzenie amerykańskie, najwyższej jakości, inaktywowana termicznie
Płodowa surowica bydlęca, DializedLife26400044USA pochodzenie
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Płyn scyntylacyjny do scyntylacji przepływowej 
Kwas foliowyBiobasicFB0466Roztwór
buforowy HEPESŻycie156300801 M
roztwór Inozytol, Myo-[2-3H(N)]PerkinElmerNET114005MC9:1 do wody
Insulina-Transferyna-Selen-EtanoloaminaLife51500056100x roztwór
Chlorek żelaza(III)Sigma157740Odczynnik grade
Laura - Oprogramowanie do zbierania i analizy danych chromatograficznychLabLogic Systems LtdWersja 4.2.1.18Oprogramowanie scyntylatora przepływowego
L-glutaminaSigmaG7513200  mM, roztwór, sterylnie filtrowany, BioXtra, odpowiedni do hodowli komórkowych
Chlorek magnezuSigmaM8266Bezwodny
siarczan manganuBiobasicMB0334Monohydrat, metanol klasy ACS
Caledon labs6701-7-40Klasa HPLC
Roztwór metyloaminySigma42646640% (v/v)
Fosforan monopotasowyBiobasicPB0445Bezwodny, klasy ACS
Kwas nikotynowyBiobasicNB0660Klasa odczynnika
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 Oprogramowanie HPLC
Kwas p-aminobenzoesowy (PABA)BioshopPAB001.100Wolny kwas
Penicylina-StreptomycynaSigmaP4333100X, płynna, stabilizowana, sterylnie filtrowana, badana na hodowli komórkowe
Kwas nadchlorowySigma244252odczynnik ACS, kolumna 70%
PhenoSpher SAXPhenomenex00G-315-E05 &mikro; m, 80 & Aring;, 250 x 4,6 mm
Kwas fosforowyCaledon labs1/29/8425Odczynnik klasy
Chlorek potasuBiobasicPB0440Klasa ACS
Jodek potasuBiobasicPB0443
Chlorowodorek pirydoksynySigmaP9755
Pompa czwartorzędowaAgilentG1311CAgilent 1260 seria nieskończoności
RyboflawinaBioshopRIB333.100Chlorek
soduBiobasicDB0483Klasa biotechnologiczna
Molibdenian soduSigma243655
Termostatowana komora kolumnyAgilentG1316AAgilent 1260 seria nieskończoności
Chlorowodorek tiaminySigmaT4625Klasa odczynnika; Przygotować roztwór 0,02% (w/v), tworzy zawiesinę. mieszać i zamrażać podwielokrotności
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Koktajl scyntylacyjny do zliczania płynów
SiarczanBiobasic ZB2906Siedmiowodny, klasa odczynnika
i beta;-RAM 4systemy IN/USModel 4Scyntylator przepływowy - 500 &mikro; l komórka przepływowa; alternatywny analizator scyntylacyjny przepływu promieniowego firmy Perkin Elmer 
próbek klasy USP etanol klasy ACS klasy USP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

Powiązane artykuły