Badanie kompleksacji rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania

Podsumowanie

Przedstawiono charakterystykę kompleksów powstałych w różnych względnych proporcjach tetrapeptydów rtęci(II) do tetrapeptydów dicysteinylu za pomocą spektrometrii mas orbitrap z jonizacją elektrorozpylającą.

Streszczenie

W tym badaniu oceniliśmy metodę charakterystyki kompleksów, powstałych w różnych względnych proporcjach rtęci(II) do tetrapeptydu dicysteinylu, za pomocą spektrometrii mas z jonizacją electrorozpylaną. Strategia ta opiera się na wcześniejszej udanej charakterystyce kompleksów rtęć-dicysteinyl z udziałem tripeptydów z wykorzystaniem spektrometrii mas i innych technik. Chlorek rtęci(II) i tetrapeptyd dicysteinylu inkubowano w odgazowanym, buforowanym podłożu w różnych proporcjach stechiometrycznych. Powstałe kompleksy były następnie analizowane na spektrometrze mas z elektrorozpylaczem, składającym się z hybrydowego liniowego analizatora mas z jonami i pułapkami. Widma spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) uzyskano w trybie dodatnim, a obserwowane piki przeanalizowano następnie pod kątem wyraźnych wzorców dystrybucji izotopów rtęci i związanych z nimi pików monoizotopowych. Praca ta pokazuje, że dokładna stechiometria rtęci i peptydu w kompleksach powstałych w określonych warunkach jonizacji elektronrozpylania może być wyznaczona przy użyciu wysokiej rozdzielczości ESI MS w oparciu o różne wzorce rozkładu izotopów rtęci.

Wprowadzenie

Obecne kliniczne leki przepisywane do terapii chelatacyjnej zatrucia rtęcią¹ zawierają grupę tiolową, która jest/są odpowiedzialne za wiązanie i sekwestrację jonów rtęci^2,3. Jednak badania wykazały, że te małe związki tiolowe [kwas dimerkaptobursztynowy (DMSA) i kwas dimerkaptopropanosulfonowy (DMPS)] nie są optymalne dla terapii chelatującej rtęć^4-6. W związku z tym istnieje potrzeba zrozumienia powiązań i tendencji do tworzenia kompleksów rtęci z tiolami, aby poprawić racjonalne projektowanie leków na związki tiolowe do chelatacji rtęci. Niedawno informowaliśmy, że tripeptydy n-alkilowe i arylowe dicysteinylowe z grupami ditiolowymi mogą służyć jako skuteczne "podwójne kotwice" do akomodacji miejsc koordynacyjnych rtęci(II) w celu utworzenia kompleksów 1:1 rtęć(II):p eptyd i 1:2 rtęć(II):(peptyd)₂ ⁷. Dodatkowo badano wpływ zwiększania reszt cysteinylowych na formacje typu złożonego⁸. W tym badaniu badamy związek rtęci(II) z dwoma tetrapeptydami dicysteinylu, w których reszty cysteinylowe są oddzielone dwiema resztami aminokwasowymi. W celu oceny wpływu pomocniczych grup wiążących dla rtęci, aminokwasami pośrednimi są albo dwie reszty glicyny (niepodstawionej), albo dwie reszty kwasu glutaminowego (gamma-karboksylowane).

Reakcja peptydu cysteinylowego z rtęcią(II) wymaga warunków, które zapobiegną utlenianiu grup cysteinylotiolowych do tworzenia wiązań dwusiarczkowych⁹. Ponadto asocjacja rtęci(II) z peptydami cysteinylowymi w celu utworzenia różnych typów kompleksów rtęć-peptyd zależy od początkowego stosunku rtęci(II) do peptydu w mieszaninie reakcyjnej^7,8. Rodzaje kompleksów rtęć-peptyd powstających w tych mieszaninach reakcyjnych można analizować za pomocą spektroskopii mas z miękką jonizacją, która jest czułym narzędziem analitycznym do określania interakcji między pierwiastkami między jonami metali a peptydami^10-14. W związku z tym zapewni profil różnych typów adduktów peptydowych rtęci, które powstają w określonych warunkach jonizacji elektronrozpylania. Tutaj pokażemy, w jaki sposób peptydy cysteinylowe i roztwory chlorku rtęci(II) można przygotować w odgazowanym roztworze buforowym mrówczanu amonu pokrytym argonem w celu zminimalizowania utleniania. Reagując różne ekwiwalenty molowe rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylu, pokażemy, jak początkowy stosunek rtęci(II):p eptydu wpływa na rodzaje powstających kompleksów. Pokażemy również, w jaki sposób spektrometria mas z jonizacją elektronrozpylaną (ESI) może być wykorzystana jako narzędzie do charakteryzacji w celu zapewnienia dokładnej stechiometrii rtęci do peptydu w powstałych kompleksach. Powiązany protokół wideo zademonstruje warunki eksperymentalne przygotowania kompleksów rtęci, procedurę analizy mieszanin reakcyjnych w określonych warunkach jonizacji elektronrozpylania oraz charakterystykę stechiometrii kompleksów rtęć(II)-dicysteinylotetrapeptyd, w oparciu o odrębne wzorce rozkładu izotopów rtęci, przy użyciu programu ChemCal¹⁵. Ma on na celu pomóc tym, którzy są zainteresowani wykorzystaniem spektrometrii mas ESI orbitrap do analizy różnych kompleksów utworzonych przez jony metali, które występują w różnych formach izotopowych.

Protokół

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Chlorek rtęci jest toksyczną substancją chemiczną. Podczas przekazywania środków ochrony osobistej (rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny) należy nosić przy jego przekazywaniu oraz wszystkich związanych z nim roztworów. Roztwory należy utylizować w wyraźnie oznaczonych butelkach na odpady chemiczne przeznaczonych do metali ciężkich.

1. Przygotowanie 5 mM odgazowanego buforu mrówczanu amonu, pH 7,5

1. Rozpuścić 0,1576 g buforu mrówczanu amonu w 450 ml wody o czystości HPLC. Dostosować pH powyższego roztworu za pomocą 1 M kwasu mrówkowego i 1 M wodorotlenku amonu do 7,5. Przenieść ten roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml i dodać wodę HPLC do linii kalibracyjnej, aby uzyskać 5 mM roztwór mrówczanu amonu.
2. Odgazować 5 mM bufor mrówczanu amonu w systemie próżniowym przez 10 minut i przedmuchnąć argonem. Powtórz dwa razy i przechowuj roztwór pod argonem. W dniu użycia przed użyciem przefiltrować roztwór buforowy przez filtr 0,2 mikrona.

2. Przygotowanie roztworów chlorku rtęci(II)

1. Odważyć 0,2375 g chlorku rtęci(II). Rozpuścić go w 25 ml 5 mM buforu mrówczanu amonu w celu wytworzenia 0,035 M roztworu chlorku rtęci(II).
2. Dodać 0,214 ml 0,035 M roztworu chlorku rtęci(II) do 9,785 ml 5 mM buforu mrówczanu amonu, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7,5 x ^10-4 M. Pokryj 7,5 x ^10-4 M roztwór rtęci(II) argonem.

3. Przygotowanie roztworu podstawowego CGGC

1. Rozpuścić 2,0 mg tetrapeptydu dicysteinylu, CGGC, w 0,118 ml acetonitrylu o czystości HPLC, a następnie dodać 1,0647 ml 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5, buforu odgazowanego w argonie w celu uzyskania 5 mM roztworu podstawowego CGGC.
2. Dodać 225 μl 5 mM roztworu podstawowego CGGC do 1,275 μl 5 mM buforu do tworzenia amonu o pH 7,5, aby otrzymać roztwór CGGC o stężeniu 7,5 x ^10-4 M.

4. Przygotowanie różnych mieszanin reakcyjnych rtęci(II) i CGGC

1. Przygotowanie roztworu rtęci(II) w stosunku 1:0,5
   1. Umieścić 255 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 ^x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.
   2. Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 15 μl 7,5 x ^10-4 M roztworu CGGC do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować roztwór przez 10 sekund. Pozostawić roztwór na 10 minut przed wstrzyknięciem do spektrometru masowego.
2. Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CGGC w stosunku 1:1
   1. Umieścić 240 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 ^x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.
   2. Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 30 μl 7,5 x 10 ^-4 M roztworu CGGC do 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.
3. Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CGGC w stosunku 1:2
   1. Umieścić 210 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 ^x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.
   2. Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 60 μl 7,5 x ^10-4 M roztworu CGGC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.

5. Przygotowanie roztworu podstawowego CEEC

1. Rozpuścić 3,5 mg tetrapeptydu dicysteinylu, CEEC, w 0,145 ml acetonitrylu klasy HPLC w celu rozpuszczenia peptydu. Następnie dodać 13,067 ml 5 mM mrówczanu amonu, buforu o pH 7,5, który został odgazowany w argonie, aby uzyskać 0,5 mM roztworu CEEC.
2. Wirować roztwór, aż cały peptyd się rozpuści. Dodać 1,125 ml 0,5 mM roztworu CEEC i 0,375 ml 5 mM mrówczanu amonu, buforu o pH 7,5 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać roztwór o stężeniu 7,5 x ^10-5 M CEEC. Wirować, aż się wymieszają.

6. Przygotowanie różnych mieszanin reakcyjnych rtęci(II) i roztworu CEEC

1. Przygotowanie roztworu rtęci(II) w stosunku 1:0,5 do CEEC
   1. Umieścić 255 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 ^x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.
   2. Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 15 μl 7,5 x ^10-4 M roztworu CEEC do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.
2. Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CEEC w stosunku 1:1
   1. Umieścić 240 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 ^x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.
   2. Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 30 μl 7,5 x ^10-4 M roztworu CEEC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.
3. Przygotowanie roztworu rtęci(II) i CEEC w stosunku 1:2
   1. Umieścić 210 μl 5 mM mrówczanu amonu o pH 7,5 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 30 μl 7,5 ^x10-4 M roztworu chlorku rtęci(II) do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej z buforem mrówczanu amonu.
   2. Wirować roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 60 μl 7,5 x ^10-4 M roztworu CEEC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w sekcji 4.1.

7. Analiza mieszanin reakcyjnych próbek rtęci(II) i CGGC za pomocą spektrometrii mas Orbitrap ESI

1. Przygotowanie spektrometru masowego ESI¹⁶
   1. Pobrać 100 μl wzorców kalibracyjnych do szklanej strzykawki o pojemności 500 μl.
   2. Umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy MS, podłączyć rurkę i wstrzyknąć do spektrofotometru masowego.
   3. Skonfiguruj nazwę pliku dla uruchomienia, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.
   4. Wybierz przycisk pobierz dane w module akwizycji danych i zbierz 150 skanów.
   5. Przeanalizuj chromatogram, aby zweryfikować wzorce kalibracji, otwierając moduł przetwarzania danych w oprogramowaniu. Otwórz moduł, przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy piki na chromatogramie są skorelowane ze stosunkami masy do ładunku wzorców.
   6. Oczyścić szklaną strzykawkę o pojemności 500 μl, pobierając 500 μl metanolu klasy HPLC, a następnie dozować metanol do zlewki.
   7. Pobrać 500 μl metanolu klasy HPLC do szklanej strzykawki i przepłukać system zgodnie z krokiem 7.1.2.
   8. Wybierz moduł konfiguracji metody w oprogramowaniu, aby ustawić parametry. Wybierz menu trybu skanowania i zidentyfikuj analizator jako FTMS, a następnie kliknij "OK". Następnie, klikając różne ikony na stronie widma widoku w czasie rzeczywistym, ustaw następujące parametry: Natężenie przepływu gazu w osłonie: 10, Temperatura źródła: 0, Napięcie kapilarne: 37 V, Soczewka rury: 95 V, Napięcie natrysku: 4,20 kV, Natężenie przepływu 10,00 μl/min, Analizator: FTMS, Liczba skanów: 150.
2. Uruchamianie próbek CGGC na spektrometrze masowym ESI
   1. Uruchomić 5 mM bufor mrówczanu amonu o pH 7,5.
      1. Umieścić 500 μl 5 mM buforu mrówczanu amonu w szklanej strzykawce o pojemności 500 μl, umieścić go w kołysce strzykawki pompy MS i podłączyć rurkę.
      2. Przepuść bufor przez rurkę przez 1-2 minuty.
      3. Skonfiguruj nazwę pliku dla uruchomienia, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.
      4. Wybierz przycisk pobierz dane w module i zbierz 150 skanów.
      5. Kliknij przycisk Uruchom, aby zatrzymać zbieranie po zebraniu 150 skanów.
      6. Otwórz moduł przeglądarki danych, a następnie przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy w miejscach 483, 683, 1,163 i 1,363 m/z nie występują piki przypominające peptyd lub kompleksy peptyd rtęć (II).
   2. Uruchomić roztwór stosunku rtęci(II) do CGGC 1:0,5.
      1. Umieścić w strzykawce 250 μl proporcji rtęci(II) do CGGC w stosunku 1:0,5 rtęci(II):CGGC.
      2. Umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy MS, założyć rurkę i zalać aparat.
      3. Wybierz nazwę pliku do uruchomienia, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.
      4. Naciśnij przycisk pobierania danych w module akwizycji danych i zbierz 150 skanów, a następnie kliknij przycisk uruchom, aby zatrzymać zbieranie.
      5. Otwórz moduł, przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy chromatogram zawiera piki, w tym piki samego peptydu CGGC.
      6. Umyć strzykawkę, zasysając 500 μl buforu mrówczanu amonu, a następnie dozując bufor mrówczanu amonu do zlewki.
      7. Wybrać przycisk odpływu na MS i trzykrotnie przepłukać rurkę 500 μl buforem mrówczanu amonu.
      8. Umyć strzykawkę, zasysając ją 500 μl metanolu, a następnie dozując metanol do zlewki.
      9. Przepłucz rurkę jednorazowo 500 μl metanolu.
      10. Wybierz przycisk detektora obciążenia na MS.
      11. Dodać 500 μl buforu mrówczanu amonu do strzykawki.
      12. Umieścić strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy MS, założyć rurkę i zalać aparat.
      13. Wybierz nazwę pliku dla uruchomienia buforu, wybierając ikonę pliku i wpisując nazwę pliku.
      14. Naciśnij przycisk pobierania danych i zbierz 150 skanów, a następnie kliknij przycisk zatrzymania uruchamiania.
      15. Otwórz moduł przeglądarki danych, przejdź do menu plików i wybierz "otwórz", a następnie wybierz plik w oknie dialogowym. Sprawdzić, czy chromatogram jest pozbawiony pików z poprzedniego przebiegu Hg:CGGC.
   3. Uruchom roztwór stosunku rtęci(II) do CGGC 1:1.
      1. Umieścić w strzykawce 250 μl próbki o stosunku rtęci(II) do CGGC w stosunku 1:1.
      2. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w krokach od 7.2.2.2 do 7.2.2.15.
   4. Uruchom rozwiązanie stosunku rtęci(II) do CGGC 1:2
      1. Umieścić w strzykawce 250 μl próbki o stężeniu rtęci(II) w stosunku 1:2
      .
      2. Powtórzyć czynności w podobny sposób, jak opisano w krokach od 7.2.2.2 do 7.2.2.15.

8. Analiza mieszanin reakcyjnych próbek rtęci i CEEC za pomocą spektrometrii mas Orbitrap ESI

1. Uruchamianie próbek CEEC na spektrometrze masowym ESI
   1. Powtórzyć procedurę analizy (etapy 7.1–7.2) przy użyciu próbek CEEC i mieszanin reakcyjnych rtęci(II) i CEEC w różnych proporcjach stechiometrycznych.

Wyniki

Przeprowadzono badanie mające na celu scharakteryzowanie możliwego składu kompleksu rtęciowo-peptydowego dla dwóch tetrapeptydów, CGGC i CEEC (Rysunek 1) za pomocą spektrometrii mas ESI. Kompleksy rtęci(II) z CGGC lub CEEC badano poprzez reakcję mieszanin roztworów rtęci(II) i peptydów w trzech różnych proporcjach molowych: 1:0,5, 1:1 i 1:2 (rtęć(II): peptyd). Stężenie rtęci(II) wynosiło 7,5 x ^10-6 M, a stężenie peptydów zmieniało się odpowiednio.

Dyskusja

hydrofobowy tetrapeptyd dicysteinylowy CGGC (C₁₀H₁₈N₄O₅S₂; MW = 338) (rysunek 1), tworzy kompleksy z rtęcią(II), jak pokazano na rysunku 2 i tabeli 1. Dodatkowo tworzy dimery i trimery peptydowe stopniowo wraz ze wzrostem ilości peptydu w mieszaninie reakcyjnej. Jak pokazują wartości m / z powiązanych dimerów [(2M + H) ⁺ = 677] i trimerów [(3 M + H) ⁺ = 1015], grupy tiolowe CGGC nie utleniały si...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek rtęci(II)	Sigma-Aldrich	429724	Wysoce toksyczny
mrówczan amonu	Sigma-Aldrich	516961
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich	F0507
Wodorotlenek amonu	Fisher	A512-P500
HPLC woda	Fisher	W5-4
HPLC Acetonitryl	Fisher	BP2405-1
HPLC Metanol	Fisher	A452-4