Artykuł metodologiczny

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

DOI:

10.3791/53547

⸱

18 lutego 2016

 ,  ,  , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) otrzymują pobudzające dane glutaminergiczne z komórek dwubiegunowych. Wzbudzenie synaptyczne RGC odbywa się postsynaptycznie przez receptory NMDA (NMDAR) i receptory AMPA (AMPAR). Dane fizjologiczne wskazują, że receptory glutaminianu w RGC ulegają ekspresji nie tylko w postsynaptycznych, ale także w perysynaptycznych lub pozasynaptycznych przedziałach błonowych. Nie ustalono jednak dokładnych lokalizacji anatomicznych receptorów glutaminianu w synapsach RGC. Chociaż szeroko stosowana jest analiza ilościowa receptorów glutaminianu w centralnych synapsach o wysokiej rozdzielczości, podejście to odniosło jedynie ograniczony sukces w siatkówce. Opracowaliśmy metodę postembedding immunogold do analizy receptorów błonowych, dzięki której możliwe jest oszacowanie liczby, gęstości i zmienności tych receptorów w synapsach wstęgowych siatkówki. Poniżej opisujemy narzędzia, odczynniki i praktyczne kroki, które są potrzebne do: 1) skutecznego przygotowania utrwalenia siatkówki, 2) substytucji przez zamrożenie, 3) immunocytochemii po zatopieniu immunogold electron mikroskop (EM) oraz 4) ilościowej wizualizacji receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glutaminian jest głównym neuroprzekaźnikiem pobudzającym w siatkówce1. Komórki zwojowe siatkówki (RGC), otrzymujące glutaminergiczny wkład synaptyczny z komórek dwubiegunowych2, są neuronami wyjściowymi siatkówki, które wysyłają informacje wizualne do mózgu. Badania fizjologiczne wykazały, że pobudzenie synaptyczne RGC odbywa się postsynaptycznie przez receptory NMDA (NMDAR) i receptory AMPA (AMPAR) 3,4,5. Chociaż pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC) w RGC są mediowane przez AMPAR i NMDAR3,5,6,7,8 , spontaniczne miniaturowe EPSC (mEPSC) na RGC wykazują tylko składnik 4,5,9, w którym pośredniczy AMPAR. Jednak zmniejszenie wychwytu glutaminianu ujawniło składnik NMDAR w spontanicznych EPSC5, co sugeruje, że NMDAR na dendrytach RGC mogą znajdować się poza synapsami pobudzającymi. Kinazy guanylanowe związane z błoną (MAGUK), takie jak PSD-95, które grupują receptory neuroprzekaźników, w tym receptory glutaminianu i kanały jonowe w miejscach synaptycznych, również wykazują wyraźne subsynaptyczne wzorce ekspresji 10,11,12,13,14.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, immunohistochemia konfokalna i immunohistochemia z użyciem wstępnego mikroskopu elektronowego (EM) były wykorzystywane do badania ekspresji receptorów błonowych. Chociaż konfokalne barwienie immunologiczne ujawnia szerokie wzorce ekspresji receptorów, jego niższa rozdzielczość uniemożliwia użycie go do rozróżnienia lokalizacji subkomórkowej. Wstępne wbudowanie badań EM w siatkówce ssaków wskazuje, że podjednostki NMDAR są obecne w elementach postsynaptycznych w stożkowych synapsach wstęgowych komórek dwubiegunowych 15,16,17. Jest to wyraźny kontrast z dowodami fizjologicznymi. Jednak dyfuzja produktu reakcji jest dobrze znanym artefaktem w metodzie wstępnego zatapiania immunoperoksydazy. W związku z tym podejście to zwykle nie daje statystycznie wiarygodnych danych i może wykluczać rozróżnienie między lokalizacją na błonie synaptycznej a błoną pozasynaptyczną 18,19,20,21. Z drugiej strony, dane fizjologiczne i anatomiczne są zgodne z synaptyczną lokalizacją AMPAR na RGC 3,5,7,9,22. Tak więc receptory glutaminianu i MAGUK w synapsie wstęgowej siatkówki są zlokalizowane nie tylko w postsynaptycznych, ale także w perysynaptycznych lub zewnątrzsynaptycznych przedziałach błony. Jednak nadal potrzebna jest analiza ilościowa tych białek błonowych w synapsie wstęgowej siatkówki o wysokiej rozdzielczości.

Tutaj opracowaliśmy technikę postemagonalnego immunogolda EM, aby zbadać subsynaptyczną lokalizację podjednostek NMDAR, podjednostek AMPAR i PSD-95, a następnie oszacować liczbę, gęstość i zmienność tych białek w synapsach na szczurzych RGC znakowanych za pomocą metod śledzenia wstecznego podjednostki B (CTB) toksyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka i obchodzenie się ze zwierzętami były zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania NIH. Szczury Sprague-Dawley 15-21 po urodzeniu (P), którym wstrzyknięto 1-1,2% CTB obustronnie przez wzgórek górny, utrzymywano w 12:12-godzinnym cyklu światło: ciemność.

1. Utrwalenie tkanki siatkówki

  1. Zbierz następujące materiały i narzędzia: mikroskop preparacyjny, 2 kleszcze z bardzo cienkimi końcówkami, nożyczki, celulozową bibułę filtracyjną, plastikową pipetę i szkiełko mikroskopowe.
  2. Znieczulić szczura w zamkniętej komorze za pomocą 2,0 ml halotanu (wziewny środek znieczulający). Określ odpowiednie znieczulenie tymi metodami: brak wycofania tylnej łapy po uszczypnięciu palca lub brak odruchu mrugania. Następnie natychmiast odciąć głowę gilotyną. Usuń oczy nożyczkami do tęczówki i umieść w szklanym naczyniu zawierającym 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) o pH 7,4.
  3. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego usuń rogówkę, odcinając przednią część gałki ocznej. Usuń soczewkę i ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy.
  4. Oderwij twardówkę dwoma kleszkami, aż siatkówka zostanie odizolowana od muszli ocznej.
  5. Natychmiast pokrój siatkówkę na paski o grubości 100 - 200 μm za pomocą brzytwy i poddaj utrwaleniu pH.
  6. Utrwal paski siatkówki w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PB przy pH 6,0 przez 20 - 30 minut, a następnie w 4% paraformaldehydzie plus 0,01% aldehydu glutarowego o pH 10,5 przez 10 - 20 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Po kilku płukaniach w PB z 0,15 mM CaCl2 (pH 7,4 w 4°C), przed substytucją przez zamrożenie należy kriochronić paski siatkówki glicerolem (60 minut każdy w 10%, 20%, 30%, a następnie O/N w 30%) w 0,1 M PB.

2. Zamiana zamrożenia

UWAGA: Ta metoda zamrożenia i podstawiania jest zmodyfikowana w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu 19,20. Ważne jest również, aby instrumenty były bardzo zimne (nosić rękawiczki); W przeciwnym razie tkanka może częściowo rozmrozić się po dotknięciu narzędziami. Wszystkie te czynności są wykonywane w komorze AFS i instrumenty nigdy nie mogą poruszać się ponad krawędź komory. Podobnie, konieczne jest odpowiednie chłodzenie wszystkich chemikaliów stosowanych w AFS.

  1. Zamrozić wgłębne paski siatkówki w ciekłym propanu w temperaturze -184°C w przyrządzie do kriokonserwacji EM (CPC). Za pomocą cienkiej szczotki umieść próbki na małych kawałkach podwójnie przyklejonej taśmy przymocowanej do metalowych króćców, które znajdują się na końcu prętów zanurzających (odetnij dodatkowy bufor za pomocą szczotki).
  2. Zanurzyć pręty w ciekłym propanu i trzymać tam przez około 5 sekund, a następnie przenieść do automatycznego przyrządu do zamrażania i substytucji (AFS) za pomocą małej komory transportowej wypełnionej ciekłym azotem ("chłodzony kriowaniem pojemnik do przenoszenia LN2").
  3. Po umieszczeniu zamrożonej próbki i narzędzi (kleszczy i skalpela) w systemie AFS, należy schłodzić narzędzia w komorze przez kilka minut przed dotknięciem tkanki lub schłodzić je, umieszczając końcówki narzędzi na kilka sekund w małej komorze transportowej (wypełnionej ciekłym azotem ("pojemnik do kriotransferu chłodzony LN2")).
  4. Po umieszczeniu w AFS usuń próbkę i taśmę z króćca za pomocą drobnego skalpela. Podczas tych procedur należy również utrzymywać otwarty regulator przepływu azotu gazowego, TF (TF jest opisany jako "regulator dla parownika LN2").
  5. Przed umieszczeniem zamrożonej tkanki w uchwytach do płaskiego zatapiania (tj. przed ustawieniem AFS) należy wyciąć cienkie kółko z przezroczystego arkusza z tworzywa sztucznego i umieścić je na dnie uchwytu tak, aby wyłożyć dno każdego dołka. Pozwala to na stosunkowo łatwiejsze usuwanie spolimeryzowanych bloków próbki po zakończeniu.
    UWAGA: Wcześniej stosowaliśmy metodę alternatywną do płaskich uchwytów do zatapiania i stosowaliśmy podwójne kapsułki Reichert + żelatyna (patrz Petralia i Wenthold, 1999) 20.
  6. Użyj następującej automatycznej sekwencji w AFS (używając terminologii instrumentów): T1 = -90°C przez 32 godziny, S1 = wzrost temperatury o 4°C/h (11,3 h), T2 = -45°C przez 50 godzin, S2 = wzrost temperatury o 5°C/h (9 h), T3 = 0°C przez 40 godzin (łącznie = 142,3 h). Umieszczenie próbek w systemie AFS (w temperaturze -90°C) przed rozpoczęciem sekwencji czasowej może zająć od 2 do 4 godzin.
  7. Zanurz zamrożone skrawki w 1,5% octanie uranylu w metanolu w temperaturze -90°C na >32 godziny w AFS. Umieść dwa kawałki chusteczek (zazwyczaj) w każdym z siedmiu dołków w aluminiowym uchwycie do płaskiego osadzania (trzy pasują do AFS).
    1. Umieść tkankę + taśmę w octanie uranylu/metanolu w studzienkach i usuń taśmę później, tuż przed rozpoczęciem infiltracji pożywki (takiej jak Lowicryl HM20), jeśli usunięcie tkanki z taśmy jest zbyt trudne.
  8. Następnie stopniowo zwiększaj temperaturę do -45°C (+4°C na godzinę; w sekwencji automatycznej).
  9. Umyj próbki trzykrotnie we wstępnie schłodzonym metanolu, używając plastikowej pipety z cienką końcówką w celu usunięcia starego roztworu z każdego płaskiego uchwytu do zatapiania, a następnie używając innej standardowej pipety z tworzywa sztucznego, aby dodać wstępnie schłodzony świeży metanol.
  10. Następnie, stosując tę samą metodę, stopniowo infiltruj próbki żywicami do zatapiania w niskiej temperaturze, takimi jak medium do zatapiania (HM20 / metanol w stosunku 1:1 i 2:1, każda przez 2 godziny, a następnie czysta żywica przez 2 godziny, a następnie zmień żywice i zachowaj O/N).
  11. Następnego dnia ponownie zmień żywicę, dostosowując poziom żywicy tak, aby sięgała tylko do górnej krawędzi studzienek.
  12. Polimeryzować próbki (od -45°C do 0°C w sekwencji automatycznej; +5°C na godzinę) światłem UV przez 40 godzin.
  13. Następnie wyjąć próbki z systemu AFS. Zazwyczaj bloki próbek nadal wykazują pewien różowy kolor. Umieść próbki w pobliżu światła fluorescencyjnego w dygestoriach chemicznych, w temperaturze RT O/N lub dłużej, aż staną się całkowicie przezroczyste.

3. Wprowadzenie immunocytochemii EM Immunogold

UWAGA: Immunocytochemia po osadzeniu jest wykonywana zgodnie z opisem 23,24,25.

  1. Wyciąć skrawki o grubości 1 μm za pomocą ultramikrotomu, wybarwić skrawki 1% błękitem toluidynowym i zbadać je pod kątem orientacji przekroju; ustawić blok tkanki tak, aby uzyskać optymalną płaszczyznę poprzeczną przekroju.
  2. Wytnij ultracienkie sekcje o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu i zbierz je na niklowych kratkach szczelinowych pokrytych węglem Formvar.
  3. Przemyć kratki jeden raz w destylowanymH2O, a następnie trzykrotnie przepłukać solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS, 0,05 M bufor Tris, 0,7% NaCl, pH 7,6).
  4. Inkubować siatki w 20 μl kropli 5% BSA w TBS przez 30 min, a następnie w 20 μl kroplach mieszaniny zawierającej kozi anty-CTB (1:3,000) i przeciwciało przeciwko jednej podjednostce NMDAR (anty-króliczej GluN2A 1:50, GluN2B 1:30) lub anty-króliczej GluA2/3 (1:30) w TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) z 2% BSA i 0,02 M NaN3 O/N w RT.
  5. Myj kratki na trzech oddzielnych kroplach (20 μl) TBS (pH 7,6) przez 10, 10 i 20 minut, a następnie TBS (pH 8,2) przez 5 minut.
  6. Inkubować siatki przez 2 godziny na kroplach (20 μl) mieszaniny zawierającej anty-króliczą IgG (1:20) sprzężoną z cząstkami złota 10 nm i anty-koziołka IgG (1:20) sprzężoną z cząstkami złota 18 nm w TBST (pH 8,2) z 2% BSA i 0,02 M NaN3.
  7. Myj kratki w 20 μl kropli TBS (pH 7,6) przez 5, 5 i 10 minut, a następnie w ultraczystej wodzie, a następnie wysusz.
  8. Siatki przeciwbarwiące z 5% octanem uranylu i 0,3% cytrynianem ołowiu w destylowanymH2Oprzez odpowiednio 8 i 5 minut w ciemnych warunkach.
  9. W przypadku eksperymentów z potrójnym znakowaniem inkubuj siatki O/N w RT z 20 μl kropli mieszaniny anty-koziego CTB (1:3,000), anty-mysiego PSD-95 (1:100) i anty-królika GluN2A (1:50). Następnie inkubować siatki przez 2 godziny na kroplach 20 μl mieszaniny IgG sprzężonej z cząstkami złota o długości 18, 10 i 5 nm w TBST (pH 8,2) z 2% BSA i 0,02 M NaN3. Zachowaj te same procedury, co w przypadku podwójnego etykietowania do mycia i barwienia przeciwstawnego między i po inkubacji przeciwciał.
  10. Przeprowadzono kontrole, w których przeciwciała drugorzędowe stosowano samodzielnie.
  11. Przeglądaj siatki na EM i digitalizuj obrazy. Przetwarzaj ostateczne dane w programie Adobe Photoshop 6.0 tylko pod kątem jasności i kontrastu, jeśli jest to konieczne24.

4. Kwantyfikacja

  1. Ręcznie wybierz obszary wewnętrznej warstwy pleksi (IPL) bez otworów i pęknięć przy powiększeniu 8 000X, a następnie losowo fotomontuj całą głębokość IPL przy powiększeniu 25 000X.
  2. Zidentyfikuj dendryty RGC w dwubiegunowych diadach stożkowych, gdy a) zawierają one transportowany wstecznie sygnał CTB (duże cząstki złota), b) wykazują dobrze zdefiniowane błony, szczeliny i gęstości postsynaptyczne, c) zawierają co najmniej dwie małe cząsteczki złota w PSD lub więcej niż jedną małą cząsteczkę złota wzdłuż pozasynaptycznej błony plazmatycznej.
  3. Zbierz 45 - 55 dendrytów RGC, w oparciu o powyższe kryteria, do analizy ilościowej.
  4. Zmierz długości PSD i pozasynaptycznej błony plazmatycznej poszczególnych dendrytów RGC za pomocą oprogramowania NIH ImageJ. Policz cząstki złota w promieniu 10 nm od błony jako związane z błoną, w oparciu o średnią grubość 7 - 9 nm dla błony plazmatycznej 26.
  5. Oblicz gęstość cząstek jako liczbę cząstek złota na mikrometr liniowy (złoto/μm). Zmierz odległość między środkiem każdej cząsteczki złota a środkiem PSD (dla lokalizacji synaptycznej) lub krawędzią PSD (dla lokalizacji pozasynaptycznej).
  6. Przeprowadzanie analiz statystycznych za pomocą oprogramowania. Użyj dwustronnych testów t, aby porównać średnie. Zakończ istotność, gdy P <0,05. O ile nie wskazano inaczej, należy podać wartości jako średnią ± SEM18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj wyniki pokazują uderzająco różne wzorce lokalizacji subsynaptycznej GluA 2/3 i NMDAR na dendrytach RGC w siatkówce szczura, jak opisano wcześniej 24,25. 77% cząsteczek immunozłota GluA 2/3 w profilach dendrytycznych RGC znajdowało się w PSD (Rysunek 1A), podobnie jak w przypadku większości synaps centralnych. Jednak NMDAR-y były zlokalizowane synaptycznie lub pozasynaptycznie. 83% cząstek immunozłota GluN2A było zlokalizowanych w PSD (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy cztery techniki skutecznego ilościowego barwienia immunogold EM po zatopieniu: 1) krótka i słaba fiksacja, 2) substytucja przez zamrożenie, 3) barwienie immunozłotem po zatopieniu i 4) kwantyfikacja.

EM immunogold pozwala na wykrywanie specyficznych białek w ultracienkich skrawkach tkanek. Przeciwciała znakowane cząstkami złota można bezpośrednio wizualizować za pomocą EM. Chociaż EM immunogold jest skuteczny w wykrywaniu subsynaptycznej lokalizacji receptora błonowego, może być tec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Programy Stacjonarne Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) oraz Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych (NIDCD), Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH). Dziękujemy placówce NINDS EM i rdzeniowi zaawansowanego obrazowania NIDCD (kod # ZIC DC 000081-03) za pomoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ParaformaldehydEMS15710
Aldehyd glutarowyEMS16019
NaH2PO4SigmaS9638
Na2HPO4Sigma7782-85-6
CaCl2SigmaC-8106
BSASigmaA-7030
Triton X-100SigmaT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
GlicerolGibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anty-GluN2AMiliporyAB1555PRozcieńczenie 1/50
Anty-GluN2BMiliporyAB1557PRozcieńczenie 1/30
Anty-GluA2/3MiliporyAB1506Rozcieńczenie 1/30
Anty-PSD-95MiliporyMA1– 046Rozcieńczenie 1/100
Osioł anty-królik IgG-10 nm cząsteczki złotaEMS25704Rozcieńczenie 1/20
Osioł anty-mysie cząstki złota IgG-10 nmEMS25814Rozcieńczenie 1/20
Osioł anty-mysie cząsteczki złota IgG-5 nmEMS25812Rozcieńczenie 1/20
Cząstki złota anty-kozy IgG-18 nm osłaJackson ImmunoResearch705-215-147Rozcieńczenie 1:20
Siatki niklowo-szczelinowe powlekane węglem Formvar.EMSFCF2010-Ni
Octan uranyluEMS22400-1
MetanolEMS67-56-1
Cytrynian ołowiuLeica
Leica EM AFSLeica
Leica CPCLeica
JEOL 1200 EMCiekły azot JEOL
 Roberts Tlen
PropanRoberts Tlen Lista
CTBLaboratoria Biologiczne1041 - 1,2%
anty-CTBLaboratoria biologiczne703Rozcieńczenie 1/4,000
Ultramikrotom Leica Lista

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunogold Electron MicroscopyGlutamate ReceptorsFreeze SubstitutionUltra Thin SectioningPostembedding ImmunogoldQuantitative VisualizationMembrane Protein AnalysisRetinal Ganglion CellsNMDA Receptors

Powiązane artykuły