Artykuł metodologiczny

Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka

DOI:

10.3791/53550

⸱

18 marca 2016

 , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University, 2Research Center for Life and Environmental Sciences, Toyo University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stadia embrionalne są najbardziej podatne na ksenobiotyki. Chociaż toksyczność chemiczna zależy od zasolenia, nie istnieje żadna metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. W tym miejscu opisujemy nową i wysokoprzepustową metodę określania zależności toksyczności zasolenia dla zarodków wodnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zasolenie jest ważną cechą środowiska wodnego. W przypadku organizmów wodnych określa siedliska wody słodkiej, słonawej i morskiej. Badania toksyczności chemikaliów i oceny ich zagrożeń ekologicznych dla organizmów wodnych są często przeprowadzane w wodach słodkich, ale toksyczność chemikaliów dla organizmów wodnych zależy od pH, temperatury i zasolenia. Nie istnieje jednak metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. Tutaj użyliśmy medaka (Oryzias latipes), ponieważ potrafią przystosować się do wody słodkiej, słonawej i morskiej. Różne stężenia pożywki do hodowli zarodków (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x i 30x) zastosowano do zbadania toksyczności cząstek nanokoloidalnych srebra (SNC) dla jaj medaka (1x ERM i 30x ERM mają ciśnienie osmotyczne równoważne odpowiednio wodzie słodkiej i morskiej). W sześciodołkowych płytkach z tworzywa sztucznego 15 jaj medaka w trzech egzemplarzach wystawiono na działanie SNC w dawce 10 mg/L−1 w różnych stężeniach ERM przy pH 7 i 25 °C w ciemności.

Użyliśmy mikroskopu preparacyjnego i mikrometru do pomiaru częstości akcji serca na 15 sekund i średnicy oka w dniu 6 oraz pełnej długości ciała larw w dniu wyklucia (sekcja 4). Zarodki obserwowano do wyklucia lub 14 dnia; Następnie liczyliśmy wskaźnik wylęgu codziennie przez 14 dni (sekcja 4). Aby zobaczyć akumulację srebra w zarodkach, zastosowaliśmy spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie do pomiaru stężenia srebra w roztworach testowych (sekcja 5) i zarodkach z odwążówką (sekcja 6). Toksyczność SNC dla embrionów medaka oczywiście wzrastała wraz ze wzrostem zasolenia. Ta nowa metoda pozwala nam badać toksyczność substancji chemicznych o różnym zasoleniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu ustanowienia Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) wytycznych dotyczących testowania substancji chemicznych w 1979 roku, w sekcji 2 wytycznych, Wpływ na systemy biotyczne1, opublikowano 38 wytycznych dotyczących testów. Wszystkie badane organizmy wodne pochodziły z siedlisk słodkowodnych, a mianowicie z roślin słodkowodnych; glony; bezkręgowce, takie jak rozwielitki i chironomidy; oraz ryby takie jak medaka, danio pręgowany i pstrąg tęczowy. W porównaniu ze środowiskami słonowodnymi, na środowiska słodkowodne bardziej bezpośredni wpływ ma działalność gospodarcza i przemysłowa człowieka. W związku z tym środowiska słodkowodne zostały potraktowane priorytetowo do testów, ponieważ są one bardziej narażone na zanieczyszczenie.

Na obszarach przybrzeżnych, w tym ujścia rzek, zasolenie waha się między słonawą wodą a wodą morską, a obszary te są często zanieczyszczone przez działalność przemysłową2. Obszary przybrzeżne i związane z nimi tereny podmokłe charakteryzują się wysoką ekologiczną różnorodnością biologiczną i produktywnością. Ekosystemy przybrzeżne muszą być zatem chronione przed zanieczyszczeniem chemicznym. Przeprowadzono jednak ograniczone badania ekotoksykologiczne w siedliskach wód słonawych i morskich.

Sakaizumi3 badał toksyczne interakcje między metylortęcią a zasoleniem w japońskich jajach medaka i odkrył, że zwiększenie ciśnienia osmotycznego roztworu testowego zwiększa toksyczność metylortęci. Sumitani i wsp. 4 wykorzystano jaja medaka do zbadania toksyczności odcieków ze składowisk odpadów; Odkryli, że osmotyczna równoważność odcieku z jaj była kluczem do wywołania nieprawidłowości podczas embriogenezy. Ponadto Kashiwada5 poinformowała, że nanocząstki plastiku (o średnicy 39,4 nm) łatwo przenikają przez kosmówkę jaja medaka w słonawych warunkach (15x pożywka do hodowli zarodków (ERM)).

Typowy model małej ryby, japońska medaka (Oryzias latipes) była używana w podstawowej biologii i ekotoksykologii6. Japońska medaka może żyć w warunkach od słodkiej do morskiej ze względu na wysoko rozwinięte komórki chlorkowe7. W związku z tym mogą być przydatne do testowania w warunkach o szerokim zakresie zasolenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Japońska medaka użyta w tym badaniu była traktowana humanitarnie, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Toyo, z należytym uwzględnieniem łagodzenia stresu i dyskomfortu.

1. Nanokoloidy srebra (SNC)

  1. Zakup oczyszczonych SNC (20 mg/L−1, czystość 99,99%, średnia średnica cząstek około 28,4 ± 8,5 nm zawieszone w wodzie destylowanej).
  2. Zatwierdzić czystość i stężenie srebra za pomocą analiz spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) zgodnie z instrukcją obsługi8. Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.

2. Przygotowanie roztworów SNC (mieszaniny koloidów srebra i Ag+) o różnym zasoleniu

  1. Przygotować 60× ERM składający się z 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl2·2H2O i 9,78 g MgSO4·7H2O w 1 l ultraczystej wody; dostosować pH do 7,0 za pomocą 1,25%NaHCO3 w wodzie ultraczystej.
  2. Roztwór ERM mieszać w temperaturze 25 °C przez noc.
  3. Wymieszaj SNC z rozcieńczonym ERM. Przygotować 40 ml każdego zmieszanego roztworu SNC-ERM. Końcowe stężenie wynosi 10 mg/L−1 SNC w różnych stężeniach ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x).
  4. Doprowadzić pH zmieszanego roztworu SNC-ERM do 7,0 z 0,625%NaHCO3 w ultraczystej wodzie. Dostosowanie pH jest bardzo ważne przy przygotowywaniu roztworu SNC, ponieważ uwalnianie Ag+ jest ułatwione w kwaśnych warunkach9.
  5. Stosować AgNO3 jako związek odniesienia dla SNC.
    1. Zmieszać AgNO3 z rozcieńczonym ERM. Przygotować 40 ml mieszaniny AgNO3-ERM o stężeniu AgNO3 15,7 mg/L-1 (10 mg/L−1 srebra) w różnych stężeniach ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x).
      Uwaga: Aby zbadać toksyczność koloidów srebra, roztwór AgNO3, który jest źródłem rozpuszczalnego srebra, jest stosowany jako związek odniesienia dla SNC, które są mieszaniną koloidów srebra i rozpuszczalnego srebra.

3. Hodowla Medaka i zbieranie jaj

  1. Zdobądź medaka (O. latipes) (szczep pomarańczowo-czerwony) (60 samców i 60 samic).
  2. Hodowla medaka w grupach (20 samców i 20 samic w jednej grupie) w 1x ERM w zbiornikach o pojemności 3 litrów przy użyciu przepływowego systemu hodowli medaka.
    1. Hodowla w następujących warunkach:
      Zakres pH pożywki: 6,2 do 6,5
      Światło: Ciemny cykl: 16:8 godz
      temperatura pożywki: 24 ± 0,5 °C
      ciśnienie osmotyczne pożywki hodowlanej: 257 mOsm
  3. Nakarm medakę naupliami Artemia salina o 10:00 (raz dziennie) i karm sztuczną dietą suchych ryb o 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 i 17:00 (pięć razy dziennie).
    1. Otrzymaj nauplii A. salina.
    2. Przygotuj 5 l 3,0% roztworu soli w plastikowej zlewce.
    3. Dodaj 30 g jaj krewetek solankowych do roztworu soli w zlewce.
    4. Inkubować jaja w temperaturze 25 °C przez 48 godzin z bulgotaniem (4 l/min-1) za pomocą pompy napowietrzającej.
    5. Po 48 godzinach przestań bulgotać.
    6. Pozostawić roztwór na 5 do 10 minut, aby oddzielić wyklute nauplia A. salina (dolna część roztworu) od niewyklutych jaj i skorupek jaj (górna część roztworu).
    7. Usunąć górną warstwę roztworu przez dekantację.
    8. Przefiltrować dolną część roztworu przez sito z otworami o średnicy 283 μm i zebrać nauplia, które przez nie przechodzą, na siatce z otworami o średnicy 198 μm.
    9. Nakarm nauplii medaka w ciągu 6 godzin.
  4. Po tarle samic medaka delikatnie usuń zewnętrzne skupiska jaj z ciał samic lub zbierz jaja z dna akwarium za pomocą małej siatki (rozmiar siatki 5 cm x 5 cm, rozmiar otworu 0,2 mm x 0,2 mm).
  5. Opłucz kiść jaj pod bieżącą wodą z kranu przez 5 sekund.
  6. Dodaj wszystkie opłukane kiście jaj do 30-krotnego roztworu ERM.
  7. Wyjmij kiście z roztworu po 1 minucie i umieść je między suchymi ręcznikami papierowymi i delikatnie zwiń.
  8. Włóż jajka z powrotem do 30x ERM.
  9. Wybierz zapłodnione jaja pod mikroskopem preparacyjnym.
  10. Umieść wybrane 810 jaj w 1x ERM na sześciodołkowych plastikowych płytkach za pomocą kleszczy.
  11. Jaja inkubować w temperaturze 25 ± 0,1 °C w inkubatorze do stadium rozwojowego 21. (Stadia rozwojowe embrionów medaka zostały zdefiniowane na podstawie pracy Iwamatsu10.)
  12. Wybierz inkubowane jaja w stadium rozwojowym 21 pod mikroskopem preparacyjnym.
  13. Opłucz wybrane jajka za pomocą 1x ERM.
  14. Poddane płukanym jajom poddać eksperymentom związanym z narażeniem (sekcja 4).

4. Badanie toksyczności SNC lub AgNO3 przy różnych zasoleniach ERM

  1. Opłucz jaja medaka (etap 21) trzykrotnie roztworem badanym [SNC (10 mg/L−1) lub AgNO3 (15,7 mg/L−1 jako 10 mg/L−1 srebra) przy każdym stężeniu ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x) przy pH 7]. Jako kontrolę należy użyć jaj w 1× do 30× ERM o pH 7.
  2. Dodać 15 opłukanych jaj do 5 ml każdego roztworu badanego na sześciodołkowych płytkach z tworzywa sztucznego. (Przeprowadzić doświadczenia narażenia trzy razy w celu zbadania toksyczności SNC lubAgNO3 przy użyciu każdego roztworu badanego.)
  3. Zawiń talerze w folię aluminiową.
  4. Inkubować owinięte płytki w temperaturze 25 °C w ciemności do momentu wylęgu lub przez 14 dni.
  5. Obserwuj odsłonięte jaja co 24 godziny pod kątem zmian biologicznych i martwych jaj (ryc. 1 i 2).
  6. Wymieniaj roztwory testowe co 24 godziny.
  7. Wykonaj obserwacje w następujący sposób.
    1. W 6 dniu ekspozycji należy policzyć tętno (na 15 sekund) zarodków medaka pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą stopera (ryc. 3a).
    2. W 6 dniu ekspozycji zmierz rozmiar (średnicę) oczu zarodków medaka pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrometru (ryc. 3b).
    3. W dniu wylęgu należy zmierzyć całą długość ciała larw pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrometru (ryc. 3c).
    4. Policz całkowitą liczbę odsłoniętych jaj, które wykluwają się w ciągu 14 dni (ryc. 3d).

5. Izolacja rozpuszczalnego srebra z roztworu SNC i analiza srebra

  1. Wyizolować rozpuszczalne srebro z każdego roztworu SNC (mieszaniny koloidów srebra i rozpuszczalnego srebra) poprzez filtrowanie przez filtr membranowy o mocy 3 kDa przy 14 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 min. Użyć filtra membranowego o mocy 3 kDa do wyizolowania rozpuszczalnego srebra od SNC, ponieważ podana średnia średnica zagregowanych SNC w 1x ERM wynosi 67,8 nm11, a Ag+ wynosi 0,162 nm12; membrana 3 kDa nie obejmuje cząstki o średnicy 2 nm lub większej13.
  2. Zmierzyć stężenie srebra w 50 μl przefiltrowanego roztworu (= stężenie rozpuszczalnego srebra) za pomocą analizy ICP-MS (rysunek 3e) zgodnie z instrukcją obsługi ICP-MS8. Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.

6. Pomiar bioakumulacji srebra w zarodkach Medaka

  1. Wystawić jaja medaka (etap 21) na działanie SNC lub AgNO3, jak opisano w punkcie 4.
  2. W 6 dniu ekspozycji usuń kosmówkę z komórki jajowej (tj. dechorion) za pomocą enzymu wylęgowego medaka zgodnie z protokołem opisanym w Księdze Medaka14.
  3. Zmierz stężenie srebra w jajach z odkorówką za pomocą analizy ICP-MS zgodnie z instrukcją obsługi ICP-MS8 (rysunek 3f). Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.

7. Pomiar stężenia srebra za pomocą analizy ICP-MS

  1. Dodać próbki [50 μl roztworu srebra (w celu sprawdzenia stężenia srebra; sekcja 1); trzy zarodki z odkorówką (sekcja 5); lub 50 μl przefiltrowanego roztworu (sekcja 5)] do zlewki teflonowej o pojemności 50 ml.
  2. Dodać 2,0 ml ultraczystego kwasu azotowego do zlewki o pojemności 50 ml.
  3. Podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej w temperaturze 110 °C, aż do momentu tuż przed wyschnięciem (około 3 godziny).
  4. Aby całkowicie rozpuścić materię organiczną, dodaj do zlewki 2,0 ml ultraczystego kwasu azotowego i 0,5 ml nadtlenku wodoru.
  5. Ponownie podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej, aż do momentu wyschnięcia (około 3 godzin).
  6. Pozostałość rozpuścić w 4 ml 1,0% ultraczystego roztworu kwasu azotowego.
  7. Przenieść 4 ml roztworu do probówki wirówkowej.
  8. Powtórz od 7,6 do 7,7 dwa razy (w sumie trzy razy). Ostateczna objętość to 12,0 ml.
  9. Zmierzyć stężenie srebra w próbce (rozpuszczonej w 1,0% ultraczystym kwasie azotowym) za pomocą analizy ICP-MS zgodnie z instrukcją obsługi8.
    1. Użyć wewnętrznego i zewnętrznego roztworu wzorcowego (patrz Lista materiałów) w celu ilościowego określenia stężenia srebra. Wewnętrzne i zewnętrzne rozwiązanie wzorcowe jest akredytowane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Akredytacji Laboratoriów (A2LA). Granice wykrywalności srebra wynosiły 0,0018 ng/ml-1 (roztwór) i 0,016 ng mg-wagowo-1 (ciało zarodka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ zasolenia na toksyczność SNC był bardzo oczywisty: indukcja deformacji lub śmierci była zależna od zasolenia (Rysunki 1 i 2). Zmierzyliśmy biomarkery fenotypowe (częstość akcji serca, wielkość oczu, długość całego ciała i wskaźnik wylęgu) w zarodkach narażonych na SNC (10 mg / L−1). Te fenotypowe biomarkery wykazały zależną od zasolenia toksyczność SNC.

Tętno wahało się od 29,6 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Medaka to ryba słodkowodna, która jest wysoce tolerancyjna na wodę morską; nie jest powszechnie znane, że pierwotnym naturalnym środowiskiem tej ryby była słona woda u wybrzeży Japonii6. W związku z tym ryby medaka mają dobrze rozwinięte komórki chlorkowe7. Ta unikalna właściwość zapewnia naukowcom nowy sposób testowania toksyczności substancji chemicznych w środowisku w funkcji zasolenia (woda słodka do wody morskiej) przy użyciu tylko jednego gatunku ryb.

Aby uzyskać ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Pani Kaori Shimizu i Panu Masaki Takasu z Graduate School of Life Sciences, Toyo University, za ich wsparcie techniczne. Projekt ten został wsparty grantami badawczymi ze Specjalnej Fundacji Badawczej i Centrum Badań Bio-Nanoelektroniki Uniwersytetu Toyo (dla SK); przez Fundusz Promocji Badań Naukowych Korporacji Promocji i Wzajemnej Pomocy dla Szkół Prywatnych w Japonii (na rzecz SK); przez Nowy Fundusz Projektów Oceny Ryzyka z Ministerstwa Gospodarki, Handlu i Przemysłu (dla SK); w ramach programu Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (23651028 przyznany SK); w formie dotacji na badania naukowe (B) i (C) (przyznanie 23310026 i 26340030 SK); oraz w ramach grantu na projekt strategicznej bazy badawczej dla uniwersytetów prywatnych (S1411016 dla SK) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nanokoloidy srebraUtopia Suplementy
NaClNacalai Tesque, Inc.31319-45Do produkcji ERM
KClNacalai Tesque, Inc.28513-85Do tworzenia ERM
CaCl2· 2H2ONacalai Tesque, Inc.06730-15Do wytwarzania ERM
MgSO4· 7H2ONacalai Tesque, Inc.21002-85Do tworzenia ERM
NaHCO3 Nacalai Tesque, Inc.31212-25Do produkcji ERM
AgNO3Nacalai Tesque, Inc.31018-72
pH-metrHORIBA, Sp. z o.o.F-51S
BalanceMettler-Toledo International Inc.MS204S
medaka (Oryzias latipes) pomarańczowo-czerwony szczepNational Institute for Environmental Studies
medaka przepływowy system hodowliMeito Suien Co.MEITOsystem
Artemia salina naupliijaja Japonia pet design Co. Ltd4975677033759
pompa napowietrzającaJapan pet design Co. Ltdniehałasująca w300
Larwa Otohime β-1Marubeni Nissin Feed Co. LtdLarwa Otohime β-1 Sztucznydo diety z suszonych ryb
Leica microsystemsM165FC
mikrometrFujikogaku, Sp. z o.o.
10450023 inkubatorNksystemTG-180-5LB
wytrząsarkaELMI Sp. z o.o.Aizkraukles 21-136
6-dołkowe płytki plastikoweGreiner CELLSTARM8562-100EA
folia aluminiowaAS ONE Co.6-713-02
stoperDRETEC Co., Ltd.SW-111YE Filtr membranowy
3 kDaEMD Millipore Corporation0,5 ml filtr
50 ml zlewka teflonowaAS ONE Co.
Niestandardowy standard claritasSPEXertificateZSTC-538Dla wewnętrznego standardu
Niestandardowy standard claritasSPEXertificateZSTC-622Dla zewnętrznego standardu
ultraczystego kwasu azotowegoKanto Chemical Co.28163-5B
Nadtlenek wodoru Kanto Chemical Co.18084-1Bdo atomowej spektrometrii absorpcyjnej
ICP-MSThermo ScientificThermo Scientific X Series 2 
płyta grzewczaTiger Co.Aparat CRC-A300
srebra mikroskop preparacyjny odśrodkowy33431097

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
  2. National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
  3. Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
  4. Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
  5. Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
  6. Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
  7. Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
  8. XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
  9. Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
  10. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
  11. Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
  12. Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
  13. Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
  14. Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test toksyczno ci zasoleniapo ywka do hodowli embrion wpomiar cz sto ci akcji sercapomiar rednicy okapomiar d ugo ci cia aanaliza ICP MSbioakumulacja srebrawska nik wyl gu

Powiązane artykuły