Stadia embrionalne są najbardziej podatne na ksenobiotyki. Chociaż toksyczność chemiczna zależy od zasolenia, nie istnieje żadna metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. W tym miejscu opisujemy nową i wysokoprzepustową metodę określania zależności toksyczności zasolenia dla zarodków wodnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zasolenie jest ważną cechą środowiska wodnego. W przypadku organizmów wodnych określa siedliska wody słodkiej, słonawej i morskiej. Badania toksyczności chemikaliów i oceny ich zagrożeń ekologicznych dla organizmów wodnych są często przeprowadzane w wodach słodkich, ale toksyczność chemikaliów dla organizmów wodnych zależy od pH, temperatury i zasolenia. Nie istnieje jednak metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. Tutaj użyliśmy medaka (Oryzias latipes), ponieważ potrafią przystosować się do wody słodkiej, słonawej i morskiej. Różne stężenia pożywki do hodowli zarodków (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x i 30x) zastosowano do zbadania toksyczności cząstek nanokoloidalnych srebra (SNC) dla jaj medaka (1x ERM i 30x ERM mają ciśnienie osmotyczne równoważne odpowiednio wodzie słodkiej i morskiej). W sześciodołkowych płytkach z tworzywa sztucznego 15 jaj medaka w trzech egzemplarzach wystawiono na działanie SNC w dawce 10 mg/L−1 w różnych stężeniach ERM przy pH 7 i 25 °C w ciemności.
Użyliśmy mikroskopu preparacyjnego i mikrometru do pomiaru częstości akcji serca na 15 sekund i średnicy oka w dniu 6 oraz pełnej długości ciała larw w dniu wyklucia (sekcja 4). Zarodki obserwowano do wyklucia lub 14 dnia; Następnie liczyliśmy wskaźnik wylęgu codziennie przez 14 dni (sekcja 4). Aby zobaczyć akumulację srebra w zarodkach, zastosowaliśmy spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie do pomiaru stężenia srebra w roztworach testowych (sekcja 5) i zarodkach z odwążówką (sekcja 6). Toksyczność SNC dla embrionów medaka oczywiście wzrastała wraz ze wzrostem zasolenia. Ta nowa metoda pozwala nam badać toksyczność substancji chemicznych o różnym zasoleniu.
Wprowadzenie
Od czasu ustanowienia Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) wytycznych dotyczących testowania substancji chemicznych w 1979 roku, w sekcji 2 wytycznych, Wpływ na systemy biotyczne1, opublikowano 38 wytycznych dotyczących testów. Wszystkie badane organizmy wodne pochodziły z siedlisk słodkowodnych, a mianowicie z roślin słodkowodnych; glony; bezkręgowce, takie jak rozwielitki i chironomidy; oraz ryby takie jak medaka, danio pręgowany i pstrąg tęczowy. W porównaniu ze środowiskami słonowodnymi, na środowiska słodkowodne bardziej bezpośredni wpływ ma działalność gospodarcza i przemysłowa człowieka. W związku z tym środowiska słodkowodne zostały potraktowane priorytetowo do testów, ponieważ są one bardziej narażone na zanieczyszczenie.
Na obszarach przybrzeżnych, w tym ujścia rzek, zasolenie waha się między słonawą wodą a wodą morską, a obszary te są często zanieczyszczone przez działalność przemysłową2. Obszary przybrzeżne i związane z nimi tereny podmokłe charakteryzują się wysoką ekologiczną różnorodnością biologiczną i produktywnością. Ekosystemy przybrzeżne muszą być zatem chronione przed zanieczyszczeniem chemicznym. Przeprowadzono jednak ograniczone badania ekotoksykologiczne w siedliskach wód słonawych i morskich.
Sakaizumi3 badał toksyczne interakcje między metylortęcią a zasoleniem w japońskich jajach medaka i odkrył, że zwiększenie ciśnienia osmotycznego roztworu testowego zwiększa toksyczność metylortęci. Sumitani i wsp. 4 wykorzystano jaja medaka do zbadania toksyczności odcieków ze składowisk odpadów; Odkryli, że osmotyczna równoważność odcieku z jaj była kluczem do wywołania nieprawidłowości podczas embriogenezy. Ponadto Kashiwada5 poinformowała, że nanocząstki plastiku (o średnicy 39,4 nm) łatwo przenikają przez kosmówkę jaja medaka w słonawych warunkach (15x pożywka do hodowli zarodków (ERM)).
Typowy model małej ryby, japońska medaka (Oryzias latipes) była używana w podstawowej biologii i ekotoksykologii6. Japońska medaka może żyć w warunkach od słodkiej do morskiej ze względu na wysoko rozwinięte komórki chlorkowe7. W związku z tym mogą być przydatne do testowania w warunkach o szerokim zakresie zasolenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Japońska medaka użyta w tym badaniu była traktowana humanitarnie, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Toyo, z należytym uwzględnieniem łagodzenia stresu i dyskomfortu.
1. Nanokoloidy srebra (SNC)
- Zakup oczyszczonych SNC (20 mg/L−1, czystość 99,99%, średnia średnica cząstek około 28,4 ± 8,5 nm zawieszone w wodzie destylowanej).
- Zatwierdzić czystość i stężenie srebra za pomocą analiz spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) zgodnie z instrukcją obsługi8. Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.
2. Przygotowanie roztworów SNC (mieszaniny koloidów srebra i Ag+) o różnym zasoleniu
- Przygotować 60× ERM składający się z 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl2·2H2O i 9,78 g MgSO4·7H2O w 1 l ultraczystej wody; dostosować pH do 7,0 za pomocą 1,25%NaHCO3 w wodzie ultraczystej.
- Roztwór ERM mieszać w temperaturze 25 °C przez noc.
- Wymieszaj SNC z rozcieńczonym ERM. Przygotować 40 ml każdego zmieszanego roztworu SNC-ERM. Końcowe stężenie wynosi 10 mg/L−1 SNC w różnych stężeniach ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x).
- Doprowadzić pH zmieszanego roztworu SNC-ERM do 7,0 z 0,625%NaHCO3 w ultraczystej wodzie. Dostosowanie pH jest bardzo ważne przy przygotowywaniu roztworu SNC, ponieważ uwalnianie Ag+ jest ułatwione w kwaśnych warunkach9.
- Stosować AgNO3 jako związek odniesienia dla SNC.
- Zmieszać AgNO3 z rozcieńczonym ERM. Przygotować 40 ml mieszaniny AgNO3-ERM o stężeniu AgNO3 15,7 mg/L-1 (10 mg/L−1 srebra) w różnych stężeniach ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x).
Uwaga: Aby zbadać toksyczność koloidów srebra, roztwór AgNO3, który jest źródłem rozpuszczalnego srebra, jest stosowany jako związek odniesienia dla SNC, które są mieszaniną koloidów srebra i rozpuszczalnego srebra.
- Zmieszać AgNO3 z rozcieńczonym ERM. Przygotować 40 ml mieszaniny AgNO3-ERM o stężeniu AgNO3 15,7 mg/L-1 (10 mg/L−1 srebra) w różnych stężeniach ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x).
3. Hodowla Medaka i zbieranie jaj
- Zdobądź medaka (O. latipes) (szczep pomarańczowo-czerwony) (60 samców i 60 samic).
- Hodowla medaka w grupach (20 samców i 20 samic w jednej grupie) w 1x ERM w zbiornikach o pojemności 3 litrów przy użyciu przepływowego systemu hodowli medaka.
- Hodowla w następujących warunkach:
Zakres pH pożywki: 6,2 do 6,5
Światło: Ciemny cykl: 16:8 godz
temperatura pożywki: 24 ± 0,5 °C
ciśnienie osmotyczne pożywki hodowlanej: 257 mOsm
- Hodowla w następujących warunkach:
- Nakarm medakę naupliami Artemia salina o 10:00 (raz dziennie) i karm sztuczną dietą suchych ryb o 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 i 17:00 (pięć razy dziennie).
- Otrzymaj nauplii A. salina.
- Przygotuj 5 l 3,0% roztworu soli w plastikowej zlewce.
- Dodaj 30 g jaj krewetek solankowych do roztworu soli w zlewce.
- Inkubować jaja w temperaturze 25 °C przez 48 godzin z bulgotaniem (4 l/min-1) za pomocą pompy napowietrzającej.
- Po 48 godzinach przestań bulgotać.
- Pozostawić roztwór na 5 do 10 minut, aby oddzielić wyklute nauplia A. salina (dolna część roztworu) od niewyklutych jaj i skorupek jaj (górna część roztworu).
- Usunąć górną warstwę roztworu przez dekantację.
- Przefiltrować dolną część roztworu przez sito z otworami o średnicy 283 μm i zebrać nauplia, które przez nie przechodzą, na siatce z otworami o średnicy 198 μm.
- Nakarm nauplii medaka w ciągu 6 godzin.
- Po tarle samic medaka delikatnie usuń zewnętrzne skupiska jaj z ciał samic lub zbierz jaja z dna akwarium za pomocą małej siatki (rozmiar siatki 5 cm x 5 cm, rozmiar otworu 0,2 mm x 0,2 mm).
- Opłucz kiść jaj pod bieżącą wodą z kranu przez 5 sekund.
- Dodaj wszystkie opłukane kiście jaj do 30-krotnego roztworu ERM.
- Wyjmij kiście z roztworu po 1 minucie i umieść je między suchymi ręcznikami papierowymi i delikatnie zwiń.
- Włóż jajka z powrotem do 30x ERM.
- Wybierz zapłodnione jaja pod mikroskopem preparacyjnym.
- Umieść wybrane 810 jaj w 1x ERM na sześciodołkowych plastikowych płytkach za pomocą kleszczy.
- Jaja inkubować w temperaturze 25 ± 0,1 °C w inkubatorze do stadium rozwojowego 21. (Stadia rozwojowe embrionów medaka zostały zdefiniowane na podstawie pracy Iwamatsu10.)
- Wybierz inkubowane jaja w stadium rozwojowym 21 pod mikroskopem preparacyjnym.
- Opłucz wybrane jajka za pomocą 1x ERM.
- Poddane płukanym jajom poddać eksperymentom związanym z narażeniem (sekcja 4).
4. Badanie toksyczności SNC lub AgNO3 przy różnych zasoleniach ERM
- Opłucz jaja medaka (etap 21) trzykrotnie roztworem badanym [SNC (10 mg/L−1) lub AgNO3 (15,7 mg/L−1 jako 10 mg/L−1 srebra) przy każdym stężeniu ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x) przy pH 7]. Jako kontrolę należy użyć jaj w 1× do 30× ERM o pH 7.
- Dodać 15 opłukanych jaj do 5 ml każdego roztworu badanego na sześciodołkowych płytkach z tworzywa sztucznego. (Przeprowadzić doświadczenia narażenia trzy razy w celu zbadania toksyczności SNC lubAgNO3 przy użyciu każdego roztworu badanego.)
- Zawiń talerze w folię aluminiową.
- Inkubować owinięte płytki w temperaturze 25 °C w ciemności do momentu wylęgu lub przez 14 dni.
- Obserwuj odsłonięte jaja co 24 godziny pod kątem zmian biologicznych i martwych jaj (ryc. 1 i 2).
- Wymieniaj roztwory testowe co 24 godziny.
- Wykonaj obserwacje w następujący sposób.
- W 6 dniu ekspozycji należy policzyć tętno (na 15 sekund) zarodków medaka pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą stopera (ryc. 3a).
- W 6 dniu ekspozycji zmierz rozmiar (średnicę) oczu zarodków medaka pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrometru (ryc. 3b).
- W dniu wylęgu należy zmierzyć całą długość ciała larw pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrometru (ryc. 3c).
- Policz całkowitą liczbę odsłoniętych jaj, które wykluwają się w ciągu 14 dni (ryc. 3d).
5. Izolacja rozpuszczalnego srebra z roztworu SNC i analiza srebra
- Wyizolować rozpuszczalne srebro z każdego roztworu SNC (mieszaniny koloidów srebra i rozpuszczalnego srebra) poprzez filtrowanie przez filtr membranowy o mocy 3 kDa przy 14 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 min. Użyć filtra membranowego o mocy 3 kDa do wyizolowania rozpuszczalnego srebra od SNC, ponieważ podana średnia średnica zagregowanych SNC w 1x ERM wynosi 67,8 nm11, a Ag+ wynosi 0,162 nm12; membrana 3 kDa nie obejmuje cząstki o średnicy 2 nm lub większej13.
- Zmierzyć stężenie srebra w 50 μl przefiltrowanego roztworu (= stężenie rozpuszczalnego srebra) za pomocą analizy ICP-MS (rysunek 3e) zgodnie z instrukcją obsługi ICP-MS8. Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.
6. Pomiar bioakumulacji srebra w zarodkach Medaka
- Wystawić jaja medaka (etap 21) na działanie SNC lub AgNO3, jak opisano w punkcie 4.
- W 6 dniu ekspozycji usuń kosmówkę z komórki jajowej (tj. dechorion) za pomocą enzymu wylęgowego medaka zgodnie z protokołem opisanym w Księdze Medaka14.
- Zmierz stężenie srebra w jajach z odkorówką za pomocą analizy ICP-MS zgodnie z instrukcją obsługi ICP-MS8 (rysunek 3f). Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.
7. Pomiar stężenia srebra za pomocą analizy ICP-MS
- Dodać próbki [50 μl roztworu srebra (w celu sprawdzenia stężenia srebra; sekcja 1); trzy zarodki z odkorówką (sekcja 5); lub 50 μl przefiltrowanego roztworu (sekcja 5)] do zlewki teflonowej o pojemności 50 ml.
- Dodać 2,0 ml ultraczystego kwasu azotowego do zlewki o pojemności 50 ml.
- Podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej w temperaturze 110 °C, aż do momentu tuż przed wyschnięciem (około 3 godziny).
- Aby całkowicie rozpuścić materię organiczną, dodaj do zlewki 2,0 ml ultraczystego kwasu azotowego i 0,5 ml nadtlenku wodoru.
- Ponownie podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej, aż do momentu wyschnięcia (około 3 godzin).
- Pozostałość rozpuścić w 4 ml 1,0% ultraczystego roztworu kwasu azotowego.
- Przenieść 4 ml roztworu do probówki wirówkowej.
- Powtórz od 7,6 do 7,7 dwa razy (w sumie trzy razy). Ostateczna objętość to 12,0 ml.
- Zmierzyć stężenie srebra w próbce (rozpuszczonej w 1,0% ultraczystym kwasie azotowym) za pomocą analizy ICP-MS zgodnie z instrukcją obsługi8.
- Użyć wewnętrznego i zewnętrznego roztworu wzorcowego (patrz Lista materiałów) w celu ilościowego określenia stężenia srebra. Wewnętrzne i zewnętrzne rozwiązanie wzorcowe jest akredytowane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Akredytacji Laboratoriów (A2LA). Granice wykrywalności srebra wynosiły 0,0018 ng/ml-1 (roztwór) i 0,016 ng mg-wagowo-1 (ciało zarodka).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wpływ zasolenia na toksyczność SNC był bardzo wyraźny: indukcja deformacji lub śmierć były zależne od poziomu zasolenia (Ryc. 1 i 2). Zmierzono biomarkery fenotypowe (częstość akcji serca, wielkość oczu, całkowitą długość ciała oraz odsetek wyklucia) u embrionów eksponowanych na SNC (10 mg/L−1). Biomarkery fenotypowe te ujawniły zależną od zasolenia toksyczność SNC.
Częstość akcji ser...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Medaka to ryba słodkowodna, która jest wysoce tolerancyjna na wodę morską; nie jest powszechnie znane, że pierwotnym naturalnym środowiskiem tej ryby była słona woda u wybrzeży Japonii6. W związku z tym ryby medaka mają dobrze rozwinięte komórki chlorkowe7. Ta unikalna właściwość zapewnia naukowcom nowy sposób testowania toksyczności substancji chemicznych w środowisku w funkcji zasolenia (woda słodka do wody morskiej) przy użyciu tylko jednego gatunku ryb.
Aby uzyskać ja...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Pani Kaori Shimizu i Panu Masaki Takasu z Graduate School of Life Sciences, Toyo University, za ich wsparcie techniczne. Projekt ten został wsparty grantami badawczymi ze Specjalnej Fundacji Badawczej i Centrum Badań Bio-Nanoelektroniki Uniwersytetu Toyo (dla SK); przez Fundusz Promocji Badań Naukowych Korporacji Promocji i Wzajemnej Pomocy dla Szkół Prywatnych w Japonii (na rzecz SK); przez Nowy Fundusz Projektów Oceny Ryzyka z Ministerstwa Gospodarki, Handlu i Przemysłu (dla SK); w ramach programu Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (23651028 przyznany SK); w formie dotacji na badania naukowe (B) i (C) (przyznanie 23310026 i 26340030 SK); oraz w ramach grantu na projekt strategicznej bazy badawczej dla uniwersytetów prywatnych (S1411016 dla SK) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nanokoloidy srebra | Utopia Suplementy | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | Do produkcji ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | Do tworzenia ERM |
| CaCl2· 2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | Do wytwarzania ERM |
| MgSO4· 7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | Do tworzenia ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | Do produkcji ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH-metr | HORIBA, Sp. z o.o. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) pomarańczowo-czerwony szczep | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka przepływowy system hodowli | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii | jaja Japonia pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| pompa napowietrzająca | Japan pet design Co. Ltd | niehałasująca w300 | |
| Larwa Otohime β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Larwa Otohime β-1 Sztuczny | do diety z suszonych ryb |
| Leica microsystems | M165FC | ||
| mikrometr | Fujikogaku, Sp. z o.o. | ||
| 10450023 inkubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| wytrząsarka | ELMI Sp. z o.o. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-dołkowe płytki plastikowe | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| folia aluminiowa | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stoper | DRETEC Co., Ltd. | SW-111YE Filtr membranowy | |
| 3 kDa | EMD Millipore Corporation | 0,5 ml filtr | |
| 50 ml zlewka teflonowa | AS ONE Co. | ||
| Niestandardowy standard claritas | SPEXertificate | ZSTC-538 | Dla wewnętrznego standardu |
| Niestandardowy standard claritas | SPEXertificate | ZSTC-622 | Dla zewnętrznego standardu |
| ultraczystego kwasu azotowego | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| Nadtlenek wodoru | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | do atomowej spektrometrii absorpcyjnej |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| płyta grzewcza | Tiger Co. | Aparat CRC-A300 |
Bibliografia
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
- National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
- Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
- Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
- Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
- Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
