Artykuł metodologiczny

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

DOI:

10.3791/53559

⸱

21 lutego 2016

1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach, pierwotne rzęski stały się kluczowymi regulatorami rozwoju i choroby, wpływając na liczne szlaki sygnałowe. Jednym z najwcześniejszych szlaków sygnałowych, które okazały się związane z funkcją rzęsek, był niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt, określany również jako sygnalizacja o płaskiej polaryzacji komórek (PCP). Jednym z najlepszych miejsc do badania wpływu sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP) podczas rozwoju kręgowców jest ślimak ssaków. Zakłócenie sygnalizacji PCP w ślimaku myszy zaburza rozrost ślimaka, wzorzec komórkowy i orientację komórek rzęsatych, z których wszystkie są dotknięte dysfunkcją rzęsek. Celem tego protokołu jest opisanie analizy sygnalizacji PCP w rozwijającym się ślimaku ssaków za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej. Wady konwergencji i wydłużenia objawiają się skróceniem przewodu ślimakowego i/lub zmianami we wzorcach komórkowych, które można określić ilościowo po rozbiorze z rozwijających się mutantów myszy. Zmiany w orientacji pęczka stereorzęskowego i długości lub położeniu kinocilii można obserwować i oznaczać ilościowo za pomocą immunofluorescencji lub skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Głębszy wgląd w rolę białek rzęskowych w komórkowych szlakach sygnałowych i innych zjawiskach biologicznych ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia biologii komórkowej i rozwojowej, a także dla opracowania ukierunkowanych strategii leczenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne rzęski to długie, oparte na mikrotubulach wyrostki, które wystają z powierzchni większości komórek ssaków. Rzęski pierwotne są często mylone z rzęskami ruchliwymi, których zawsze jest wiele na komórkę i których celem jest przemieszczanie płynu po powierzchniach błony. Z kolei rzęski pierwotne przyjmują role sensoryczne i w związku z tym są również określane jako rzęski czuciowe. Niegdyś dawno zapomniane, organelle te zostały niedawno "ponownie odkryte" w wyniku ich związku z wieloma chorobami genetycznymi człowieka1. Wykazano, że pierwotna rzęska, idealnie umieszczona jako organella sygnałowa, reguluje liczne szlaki sygnałowe, z których wiele jest ważnych nie tylko w homeostazie tkanek i chorobie, ale także podczas rozwoju2.

Jednym z pierwszych szlaków sygnałowych, które okazały się być związane z dysfunkcją rzęsek, był niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt, znany również jako szlak biegunowości komórek planarnych (PCP)3. Ta kaskada sygnalizacyjna początkowo zidentyfikowana u Drosophila ma kluczowe znaczenie dla embriogenezy; W szczególności dla procesów konwergencji i wydłużenia oraz dla prawidłowej orientacji komórek w płaszczyźnie nabłonka4. Sekwencyjna sygnalizacja rdzeniowego zestawu białek regulatorowych tłumaczy sygnały kierunkowe, które ostatecznie prowadzą do przegrupowań cytoszkieletu i skutkują skoordynowaną polaryzacją komórek nabłonka w płaszczyźnie5. Proces konwergencji i wydłużania jest absolutnie konieczny do wydłużenia przewodu ślimakowego i prawidłowego wzorca komórkowego6. Ponieważ jest to regulowane poprzez aktywację szlaku PCP, jednym z najbardziej uderzających fenotypów mutantów PCP ślimaka jest skrócony przewód ślimakowy ze zdezorganizowanym nabłonkiem czuciowym7. Podobnie mutanty myszy, które nie mają rzęsek, również wykazują taki fenotyp konwergencji i rozszerzenia8,9, chociaż dokładnie, w jaki sposób jest to regulowane, pozostaje do wyjaśnienia.

Ponieważ procesy konwergencji i rozszerzania są kluczowe dla rozwoju przewodu ślimakowego i komórkowego wzorca nabłonka czuciowego w przewodzie ślimakowym, rozwijający się ślimak jest idealnym organem do badania sygnalizacji PCP podczas rozwoju kręgowców. Narząd Cortiego, termin nadany wyspecjalizowanemu nabłonkowi czuciowemu wyściełającemu przewód ślimakowy, składa się z nieczuciowych komórek podporowych i mechanosensorycznych komórek rzęsatych, które muszą być równomiernie zorientowane, aby ślimak mógł funkcjonować10. Mechanosensoryczne komórki rzęsate są tak nazywane ze względu na stereorzęskowe wiązki, które rozciągają się od płytki naskórkowej (powierzchni wierzchołkowej) każdej czuciowej komórki rzęsatej11. Działają one jako główne przetworniki mechanosensacji i pomimo ich nomenklatury jako stereocilia, w rzeczywistości składają się ze zmodyfikowanych mikrokosmków opartych na włóknach aktynowych. Wewnątrz każdej wiązki włosów w kształcie szewronu, trzy rzędy stereocilii są zorganizowane w wysoce uporządkowany i regularny wzór w sposób przypominający schody. Prawdziwe rzęski oparte na mikrotubulach, zwane kinociliami, są wymagane do rozwoju i orientacji wiązek stereorzęskowych12. Na każdej komórce rzęsatej jedno pojedyncze kinocilium jest fizycznie przymocowane do wiązki stereocilia, znajdującej się centralnie w sąsiedztwie najwyższego rzędu stereocilii. Dokładna funkcja kinocilium jest niejasna, a jedna z hipotez mówi, że kinocilium "przyciąga" stereocilia do kształtu, gdy dojrzewają z mikrokosmków12. U kręgowców kinorzęski w ślimaku są obecne tylko przejściowo i wycofują się z komórek rzęsatych u myszy przed pojawieniem się słuchu11,13,14.

Całkowita utrata rzęsek w rozwijającym się ślimaku skutkuje znacznie skróconymi przewodami ślimakowymi, nieprawidłowo uformowanymi i źle zorientowanymi wiązkami stereorzęskowymi, a także nieprawidłowo ustawionymi ciałami podstawnymi8,9. Funkcjonalna rzęska składa się nie tylko z aksonemu rzęskowego. Wiele białek związanych z funkcją rzęsek występuje w kompleksach zlokalizowanych w poddomenach związanych z rzęskami, takich jak ciało podstawne, strefa przejściowa lub aksonem rzęskowy15. Ciało podstawne, pochodzące z macierzystej centrioli centrosomu, jest również centrum organizującym mikrotubule dla mikrotubul rozciągających się od rzęski do ciała komórki i może regulować transport wewnątrzkomórkowy, a także transport rzęskowy. Strefa przejściowa rzęsek to kolejny region, w którym funkcja rzęsek jest regulowana pod względem organizacji importu i eksportu związków rzęskowych16.

Wiele badań zidentyfikowało związek między rzęskami a niekanonicznym Wnt (sygnalizacja PCP), chociaż dokładny mechanizm jest niejasny17. Redundancja genów rzęskowych i PCP oraz wrażliwość polaryzacji komórek na uogólnione nieprawidłowości komórkowe utrudniają bezpośrednie powiązanie mutacji z deficytami specyficznymi dla PCP. Jednym z odczytów sygnalizacji PCP jest umiejscowienie ciała podstawnego i rzęski pierwotnej, dlatego oddzielenie wad pierwotnych od wtórnych jest trudne. Niektóre badania na mutantach danio pręgowanego i myszy sugerują brak związku między rzęskami a sygnalizacją Wnt18-20. Rozbieżności w danych mogą odzwierciedlać zależne od gatunku, tkanki lub czasu różnice w udziale rzęsek w sygnalizacji Wnt. Co więcej, normalna reaktywność Wnt może zostać zachowana, jeśli podstawowe ciała pozostają funkcjonalne. Głębszy wgląd w rolę białek rzęskowych w komórkowych szlakach sygnałowych i innych zjawiskach biologicznych ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia biologii komórkowej i rozwojowej, a także dla opracowania ukierunkowanych strategii leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystywać i uśmiercać wszystkie zwierzęta zgodnie z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi i rządowymi, najczęściej poprzez wdychanie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy.

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Przed rozpoczęciem przygotuj wszystkie odczynniki przy użyciu chemikaliów klasy analitycznej. Przygotuj roztwory, używając wody destylowanej i dejonizowanej o jakości molekularnej, chyba że określono inaczej.

  1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS): Przygotować 1 l 1x PBS, rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 1 L H2O. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl. PBS nie musi być sterylny i może być przechowywany w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że ten bufor jest wykonany bez CaCl2 lub MgCl2.
  2. Paraformaldehyd (4% PFA): Przygotować 4% roztwór PFA w 1x PBS w wentylowanym dygestorium. Dodaj 40 g proszku paraformaldehydu do 1 l 1x PBS. Aby rozpuścić, wymieszaj i podgrzej do około 60 °C, a następnie powoli dodawaj kroplami NaOH, aby podnieść pH. Po rozpuszczeniu proszku ponownie dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl. Przefiltruj przez filtr 0,45 μM i zamroź podwielokrotności. Rozmrażaj świeżą porcję dla każdego eksperymentu.
  3. Bufor Triton: Przygotować 0,1 M roztwór Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100, rozpuszczając 8,77 g NaCl w 1 l 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Dodać 1 ml Triton X-100. Mieszaj do rozpuszczenia. Przechowuj bufor Triton w temperaturze pokojowej.
  4. Blok Triton: Przygotuj 10% koziej surowicy w buforze Triton, dodając 1 ml koziej surowicy do 9 ml buforu Triton. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Jeśli używasz przeciwciał pierwszorzędowych podniesionych u myszy, dodaj kozie fragmenty anty-mysie IgG Fab w rozcieńczeniu 1 do 200 do bloku Triton na etapie blokowania.
    UWAGA: Jeśli planujesz użyć próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), przygotuj dodatkowe odczynniki, jak podano poniżej.
  5. Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) z wapniem i magnezem: Przygotować 1x roztwór HBSS, rozcieńczając z roztworu podstawowego w sterylnym destylowanym H2O. Ponieważ bufor HBSS jest skomplikowany do wykonania i wiąże się z ryzykiem, zaleca się zamówienie gotowego roztworu podstawowego 10x. Końcowe stężenie rutynowo stosowanego buforu HBBS jest następujące: 1,26 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl 2-6H2O, 0,41 mM MgSO4-7H2O, 5,33 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 4,17 mM NaHCO3, 137,93 mM NaCl, 0,34 mM Na2 HPO4, 5,56 mM Dekstroza.
  6. Bufor Hepes: Przygotować 0,1 M roztwór Hepes w 1x HBSS, rozpuszczając 23,8 g HEPES w 1 L 1x bufor HBSS.
  7. Utrwalacz skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM Fix): Przygotuj utrwalacz do SEM, rozcieńczając aldehyd glutarowy (2,5%) i paraformaldehyd (4%) w buforze Hepes. Dodać CaCl2 do końcowego stężenia 10 mM.
  8. 1% tetratlenek osmu (OsO4) w buforze Hepes; 1% tetratlenek osmu w wodzie: Rozcieńczyć podstawowy roztwór tetratlenku osmu w buforze Hepes i oddzielnie w sterylnym destylowanymH2O, do końcowego stężenia 1%. Tetroksynek osmu jest wysoce toksyczny i jest najczęściej sprzedawany jako 4% roztwór.
  9. 1% (w/v) Kwas garbnikowy: Rozpuść 0,5 g kwasu garbnikowego w 50 ml sterylnego destylowanegoH2O. Filtruj sterylizować, filtrując przez filtr o wielkości porów 0,45.
  10. Seria stopniowanych roztworów etanolu: Rozcieńczyć 200-procentowy etanol sterylnym destylowanymH2O, aby uzyskać 30, 50, 70, 90 i 95% roztwory etanolu. Do końcowego płukania etanolem wymagane jest 100% etanolu 200 proof. Do końcowego płukania użyj świeżo otwartej butelki z 200-procentowym etanolem.

2. Wybór tkanki

  1. Najlepiej badać zarodki lub młode młode w wieku od 16,5 dnia zarodka (E16,5) do 3 dnia po urodzeniu (P3).
    UWAGA: Kostnienie błędnika kostnego i kości skroniowych sprawia, że sekcja staje się coraz trudniejsza w miarę dojrzewania myszy. Również kinocilia, jedyna prawdziwa rzęska oparta na mikrotubulach znajdująca się na komórkach rzęsatych ślimaka, cofa się podczas rozwoju i nie jest już obecna u dorosłych myszy.
  2. Po utrwaleniu odwapnić ślimaki dorosłe. Wypreparowane (patrz sekcja 3) błędniki kostne umieścić w 2 ml EDTA (4,13% w PBS), pH 7,3, w probówce do mikrowirówek na 3 - 4 dni z rotacją. Uzupełniaj EDTA codziennie. Po zmiękczeniu tkanek spłukać 1,5 ml lub więcej PBS 3 razy przez 5 minut na nutatorze ze zwiększonym mieszaniem.

3. Rozwarstwienie ślimaka

  1. Po eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO2 (100% CO2 ) należy usunąć głowę. Użyj ostrza skalpela lub małej pary nożyczek, w zależności od wielkości zwierzęcia, aby wyciąć głowę wzdłuż strzałkowej linii środkowej, zaczynając od nosa i rozciągając się doogonowo. Usuń mózg z każdej połowy czaszki za pomocą kleszczy. Zidentyfikuj kości skroniowe, które zawierają rozwijające się błędniki kostne ucha wewnętrznego (patrz strzałka na rysunku 1A).
  2. Użyj kleszczy, aby ostrożnie odizolować kostne labirynty od czaszki (kości skroniowe). Zrób to pod mikroskopem preparacyjnym. Oderwij tkankę kostną od czaszki, delikatnie przesuwając kleszcze pod kostnymi labiryntami. U zwierząt do P4 labirynty kostne są nadal chrzęstne i można je łatwo usunąć bez pękania.
  3. Po rozbiorze użyj końcówki kleszczy preparacyjnych, aby oczyścić owalne i okrągłe okna i zrobić mały otwór w wierzchołku spirali ślimakowej. Napraw błędne kostne przed dalszą sekcją przewodu ślimakowego. Aby umożliwić łatwe usunięcie membrany tektorialnej (patrz 3.7), należy zamocować labirynty kostne w 1,5 ml 4% PFA na 5 minut na lodzie.
    UWAGA: Jeśli usunięcie membrany tektorialnej nie jest wymagane, zaleca się dłuższe mocowanie (patrz 4.1 - 4.3). Krótkie unieruchomienie kości skroniowych przed rozwarstwieniem przewodu ślimakowego wspomaga proces rozwarstwiania i usuwania błony ślizgowej. Po rozwarstwieniu i odsłonięciu narządu Cortiego wymagane jest dalsze utrwalenie.
  4. Następnie należy rozciąć błędne błędy kostne, aby odsłonić nabłonek czuciowy ślimaka w następujący sposób. Umieść kostne labirynty w czarnym naczyniu preparacyjnym pokrytym elastomerem silikonowym, zawierającym PBS, aby ułatwić preparację. W razie potrzeby użyj maleńkich szpilek, aby unieruchomić tkankę. Aby użyć szpilek minutien, umieść je w przedsionkowej części błędników kostnych z brzuszną częścią spirali ślimakowej skierowaną do góry.
    UWAGA: Naczynie z czarnego elastomeru silikonowego: Wymieszaj składnik bazowy z elastomeru silikonowego ze sproszkowanym węglem drzewnym, aby uzyskać nieprzezroczysty kolor. Dodaj utwardzacz i wlej do jednej lub więcej szalek Petriego (szklanej lub plastikowej). Suszyć w próżni, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza. Całkowicie wysuszyć naczynia przed użyciem.
  5. Użyj cienkich kleszczyków (#4), aby usunąć zewnętrzną chrząstkę odsłaniającą przewód ślimakowy. Zacznij od owalnego okna; Włóż dolną końcówkę kleszczyków do owalnego okienka i delikatnie podważ chrząstkę, powoli przesuwając się w górę w kierunku wierzchołka.
  6. Po odsłonięciu przewodu ślimakowego należy usunąć powierzchnię brzuszną, błonę Reissnera. Użyj cienkiej pary kleszczy, aby uszczypnąć błonę Reissnera u podstawy przewodu ślimakowego i oderwij ją ruchem do góry. Wizualizuj grzbietowy aspekt przewodu ślimakowego, w tym nabłonek czuciowy.
  7. Usuń membranę tektorialną zgodnie z poniższym opisem (opcjonalnie). W przypadku SEM lub immunohistochemii kinocilium lub wiązek stereorzęskowych usuń błonę tektorialną.
  8. Użyj bardzo cienkiej pary kleszczyków (#55 lub drobniejszych), aby ścisnąć błonę tektorialną u podstawy ślimaka i oderwać w górę w kierunku wierzchołka.
    UWAGA: Membrana tektorialna jest optycznie przezroczysta, co utrudnia jej identyfikację. Najczęściej błona odpada w jednym kawałku i chociaż nie jest to łatwe do uwidocznienia, można poczuć opór, gdy jest ściągana z odsłoniętego narządu Cortiego.
  9. Po odsłonięciu narządu Cortiego dalej utrwalaj tkankę, jak opisano poniżej. Zachowaj obszar przedsionkowy, aby wspomóc dalsze przygotowanie tkanek.

4. Fiksacja

  1. W celu uzyskania regularnej immunohistochemii utrwalić wypreparowane błędniki kostne w 1,5 ml 4% PFA w temperaturze 4 °C na nutatorze przez 2 godz.
    UWAGA: Ze względu na czułość różnych przeciwciał i antygenów, mogą być wymagane różnice w długości i składzie utrwalenia, które powinny być zoptymalizowane dla każdego przeciwciała.
  2. Po utrwaleniu umyć próbki, przepłukując je w 1,5 ml lub więcej PBS 3 razy przez 5 minut na nutatorze ze zwiększonym mieszaniem. Próbki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni przed przetworzeniem.
  3. W przypadku przygotowywania próbek do SEM, wypreparowane kości skroniowe należy utrwalić w SEM fix (patrz 1.7) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć przez płukanie w 1,5 ml lub więcej buforu Hepes 3 razy przez 5 minut na nutatorze ze zwiększonym mieszaniem. Przechowywać w buforze Hepes w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania. Nie zaleca się przechowywania dłużej niż kilka tygodni.

5. Immunohistochemia

  1. Przeprowadzić immunohistochemię na wypreparowanych próbkach w jednym dołku płaskodennej płytki 96-dołkowej. Alternatywnie użyj probówki do PCR lub mikrowirówki. Wskazane jest zachowanie przedsionkowej części błędnika kostnego, aby ułatwić przetwarzanie.
  2. Przepuszczalność tkanki poprzez inkubację w 1,5 ml buforu Triton przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na nutatorze z delikatnym mieszaniem.
  3. Zablokować tkankę przez inkubację w 0,5 ml bloku Triton przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W przypadku stosowania przeciwciał pierwszorzędowych podniesionych u myszy, dodać do bloku fragmenty anty-mysich IgG Fab w rozcieńczeniu 1 do 200 (patrz punkt 1.4). To znacznie zmniejsza niespecyficzne wiązanie anty-mysiej IgG z tkanką myszy.
  4. Inkubować tkankę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w bloku Trytona O/N w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając. Rozcieńczenie przeciwciał zależy od stosowanych przeciwciał (patrz punkt 6.1). Alternatywnie inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Najlepiej użyć minimalnej objętości 0,5 ml rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych. Jeśli przeciwciała są ograniczone, użyj najmniejszej objętości rozcieńczenia przeciwciała, która całkowicie otacza tkankę.
  5. Umyć chusteczkę, spłukując ją w 1,5 ml lub więcej buforu Triton, co najmniej 3 razy przez 15 minut, na nutatorze ze zwiększonym mieszaniem.
  6. Inkubować tkankę z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikiem, rozcieńczonymi w stężeniu zalecanym przez producenta (zwykle 1:200-1:1,000) w bloku Triton przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na nutatorze. Należy użyć minimalnej objętości 0,5 ml rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych.
    1. Przed użyciem odwirować rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe w stężeniu 13 000 x g przez 3 minuty, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie agregatów przeciwciał drugorzędowych. Na tym etapie należy chronić tkankę przed światłem, aby uniknąć fotowybielania barwników fluorescencyjnych.
  7. Podobnie jak w kroku 5.5, umyj chusteczkę, spłukując ją w 1,5 ml lub więcej buforu Triton, co najmniej 3 razy przez 15 minut, na nutatorze ze zwiększonym mieszaniem. Przechowywać próbki w PBS w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do zamontowania.

6. Selekcja przeciwciał

UWAGA: Źródło zalecanych przeciwciał i ich rozcieńczenia są wymienione w Tabeli Specyficznych Materiałów i Urządzeń. Przeprowadzić inkubację przeciwciał zgodnie z opisem w punkcie 5.

  1. Aby uwidocznić kinocilium oparte na mikrotubulach, użyj markera aksonemu rzęskowego, takiego jak anty-Arl13b (1:1,000) lub anty-acetylowana-tubulina α (1:800). Uwidocznij ciało podstawowe za pomocą przeciwciała przeciwko γ-tubulinie (1:200) lub dowolnemu innemu markerowi centrosomalnemu.
  2. Aby uwidocznić bogate w włókna aktynowe wiązki stereorzęskowe, dodaj falloidynę (1:300 - 1,000) sprzężoną z jednym z kilku różnych fluoroforów do inkubacji przeciwciał wtórnych. Falloidyna znakuje również inne nitkowate struktury aktynowe, w tym korowe włókna aktynowe otaczające obwód każdej nabłonkowej komórki rzęsastej. Jest to pomocne w określeniu konturu każdej komórki rzęsatej. W razie potrzeby należy użyć alternatywnego markera błonowego, takiego jak anty-Zo-1 (1:500).
  3. Oznacz komórki rzęsate ślimaka za pomocą przeciwciał przeciwko miozynie VI (1:1 000) lub miozynie VIIa (1:1 000). Można je wykorzystać do oceny długości ślimaka.

UWAGA: Należy użyć odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym, zoptymalizowanych pod kątem wymagań mikroskopu.

7. Montaż i obrazowanie

  1. Umieścić próbkę w czarnym naczyniu z elastomeru silikonowego zawierającego PBS. Za pomocą cienkich kleszczy usuń obszar przedsionkowy ze spirali ślimakowej.
  2. Bardzo ostrożnie usuń leżącą pod spodem chrząstkę i mezenchymę ze spirali ślimakowej. Pozostała spirala ślimakowa zawiera bruzdę wewnętrzną, narząd Cortiego i bruzdę zewnętrzną.
  3. Przenieś spiralę ślimakową do kropli PBS umieszczonej na szkiełku mikroskopowym. W razie potrzeby podziel spiralę ślimakową na części odpowiadające jednemu obrotowi. Ten krok nie jest jednak konieczny i może prowadzić do utraty tkanki. Powierzchnia wierzchołkowa (strona stereocilii) komórek rzęsatych ślimaka powinna być skierowana do góry w kierunku szkiełka nakrywkowego.
  4. Odchudź PBS za pomocą adsorbującej chusteczki lub kawałka bibuły filtracyjnej i delikatnie zmień położenie spirali ślimakowej, jeśli nabłonek przesunął się i nakłada na siebie.
  5. Dodaj kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na próbkę ślimaka i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Nie są wymagane żadne przekładki; Umieścić szkiełko nakrywkowe bezpośrednio na próbce. Zaleca się stosowanie rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego, półtrwałego podłoża mocującego, które nie wymaga dodatkowych kroków w celu utrzymania szkiełka nakrywkowego na miejscu. Nośniki montażowe i grubość szkiełka nakrywkowego powinny być dopasowane do specyfikacji mikroskopu.
  6. Użyj epifluorescencyjnego lub laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy o dużym powiększeniu (63 - 100X) i dużej aperturze numerycznej (1,2 - 1,4), aby uchwycić obrazy wierzchołkowej powierzchni komórki rzęsatej ślimaka. Użyj dolnych obiektywów (5–20X), aby wykonać nakładające się obrazy spirali ślimakowej w celu ilościowego określenia długości przewodu ślimakowego. Dopasuj lasery wzbudzające i filtry emisyjne do fluoroforów stosowanych do przeciwciał wtórnych.

8. Skaningowa mikroskopia elektronowa

  1. Kontynuuj od sekcji 4.3. Po umyciu próbek utrwalonych SEM w buforze Hepes, należy wykonać następujące czynności pod wentylacją. Poniższy protokół działa dobrze w przypadku tkanki ślimaka i pozwala uniknąć stosowania napylania z przewodzącym metalem.
  2. Post-fix w 1% OsO4 w buforze Hepes przez 1 godzinę, a następnie 3 przemycia 1 ml wody destylowanej przez 5 minut każde. Należy użyć najmniejszej objętości OsO4, która całkowicie otacza tkankę, aby zminimalizować toksyczne odpady. Nie jest wymagane mieszanie.
  3. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej w każdym z następujących roztworów przez 1 godzinę, z 3 płukaniami 1 ml wody destylowanej przez 5 minut każde pomiędzy etapami: 1% kwas garbnikowy świeżo przygotowany w wodzie i przefiltrowany przed użyciem; 1% OsO4 w wodzie,1% Kwas garbnikowy w wodzie,1% OsO4 w wodzie.
  4. Odwodnić próbki za pomocą serii stopniowanych etanolu przez inkubację przez 10 minut w każdym z następujących rozcieńczeń: 30, 50, 70, 90 i 95%. Nie jest wymagane mieszanie.
  5. Przenieść próbki przez trzy zmiany, po 5 minut każda, 100% etanolu (z nowo otwartej butelki z 200-procentowym etanolem).
  6. Przepuść próbki przez suszarkę w punkcie krytycznym, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Zamontuj próbki za pomocą przewodzącego kleju węglowego na górze króćca SEM przed obrazowaniem pod mikroskopem elektronowym. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj cienkich kleszczyków i pędzla, aby delikatnie ustawić próbkę nabłonkiem ślimaka skierowanym do góry. Użyj przedsionkowej części próbki, aby "zakotwiczyć" tkankę w kikutu. Próbki należy przechowywać w eksykatorze do czasu obrazowania. Wykonaj obrazowanie SEM zgodnie z opisem w Jones (2012)21.

9. Kwantyfikacja

  1. Po przygotowaniu immunohistochemicznym należy uzyskać obrazy za pomocą epifluorescencyjnego lub skaningowego mikroskopu konfokalnego. Po przygotowaniu do SEM należy użyć skaningowego mikroskopu elektronowego do zobrazowania próbek. Wyobraź sobie wierzchołkową powierzchnię narządu Cortiego z odsłoniętymi komórkami rzęsatymi ślimaka i interkalowanymi komórkami podporowymi.
  2. Zdefiniuj konkretne pozycje wzdłuż przewodu ślimakowego, takie jak 25, 50 i 75% od podstawy, i użyj ich do porównania regionów ślimaka między próbkami zmutowanymi i kontrolnymi. Analizuj i porównuj mutanty rzęsek z kontrolnymi ich rodzeństwem z miotu, ponieważ różnice w tle genetycznym mogą modyfikować fenotyp ślimaka.
    UWAGA: Narząd Cortiego rozwija się w gradiencie, który rozciąga się od środkowej podstawy zarówno w kierunku wierzchołka, jak i podstawy. U myszy rozwój nie jest zakończony do P14, dlatego ważne jest, aby porównać regiony na podobnych etapach rozwoju i pozycjach.
  3. Zdjęcia należy wykonywać za pomocą oprogramowania dołączonego do mikroskopu, które pozwala na ilościowe określenie danego fenotypu zgodnie z wymaganiami (patrz poniżej). Użyj oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J lub oprogramowania dołączonego do mikroskopu, aby zmierzyć długość, policzyć komórki i określić lokalizację białek, jak opisano poniżej. Wykres tych danych jako wykres słupkowy, wykres punktowy, plama pudełkowa lub histogram, porównując mutację i kontrolę.
  4. Całkowita długość przewodu ślimakowego (ryc. 3A):
    1. Za pomocą markera komórek rzęsatych lub falloidyny (która oznacza wiązki stereorzęskowe), określ i zmierz, gdzie zaczyna się i kończy nabłonek czuciowy. Długość przewodu ślimakowego jest często skracana w mutantach rzęsek.
  5. Nieprawidłowości pęczka stereorzęskowego (ryc. 3B, D, E, G):
    1. Zmierz wypukłość wiązki (wysokość) jako najkrótszą odległość między wierzchołkiem wiązki a linią biegnącą przez oba końce "ramion" wiązki, jak pokazano na rysunku 3G po lewej stronie. Alternatywnie, określ ilościowo obszar objęty ramionami zewnętrznego pęczka rzęskowego stereociliary, jak pokazano na rysunku 3G, po prawej. Jeśli można zidentyfikować komórki rzęsate z okrągłymi wiązkami stereorzęskowymi, policz je jako procent wszystkich komórek rzęsatych.
      UWAGA: U wielu mutantów rzęskowych nieprawidłowości pęczka można zaobserwować niezależnie od orientacji pęczka. Trudno jest dokładnie określić ilościowo nieprawidłowości pęczka stereorzęskowego.
  6. Orientacja wiązek stereorzęskowych (ryc. 3B,C,G):
    1. Oceń orientację każdej pojedynczej wiązki w stosunku do linii biegnącej prostopadle do rzędu komórek filarowych, która oddziela wewnętrzne i zewnętrzne komórki rzęsate. Komórki o orientacji normalnej są wyrównywane wzdłuż tej prostopadłej osi, a więc mają obrót o 0°. Kąty obrotu należy określić za pomocą notacji 360° lub jako odchylenia bezwzględne od 0°.
  7. Pozycjonowanie kinocilii lub pozycjonowanie pęczka stereorzęskowego (ryc. 3B, F, H):
    1. Policz procent komórek, w których brakuje kinocilii. Zmierz odległość od kinocilium do "wierzchołka" lub środka wiązki. "Wierzchołek" wiązki może nie być łatwy do zdefiniowania, jeśli wiązki są nieprawidłowe, dlatego zamiast tego można użyć środka wiązki.
  8. Określ ilościowo położenie kinocilii i wiązek stereorzęskowych na wierzchołkowej powierzchni komórki rzęsatej poprzez nałożenie siatki pozycyjnej na każdą komórkę rzęsatą i zaznaczenie lokalizacji podstawy kinocilium lub wierzchołka/środka wiązki stereorzęskowej. Wyświetlaj dane jako procent każdej kategorii, która leży w określonym regionie siatki, nakładając lokalizacje każdego oznaczenia na jedną siatkę pozycyjną.
    UWAGA: W tkankach kontrolnych kinorzęski są zawsze przyczepione do wierzchołka pęczka stereorzęskowego. U mutantów rzęsek często brakuje kinocilii, są one błędnie zlokalizowane, ale nadal przyczepione, a nawet całkowicie oderwane od wiązki stereorzęskowej.
  9. Długość kinocilii (ryc. 3I):
    1. Zmierz długość kinocilium, oznaczając markerem aksonemowym rzęskowym. Mierz tylko kinocilie, które leżą płasko w płaszczyźnie konfokalnej 1,5 μm. Upewnij się, że rzęski leżą płasko, obserwując przekrój poprzeczny zeskanowanej tkanki. Porównaj stare, dopasowane próbki z tego samego regionu ślimaka, ponieważ kinocilium cofa się podczas rozwoju.
  10. Błędna lokalizacja białek polarności:
    1. Po przeprowadzeniu immunohistochemii przy użyciu przeciwciał przeciwko białkom polarności, takim jak Vangl2 i Gαi3, określ lokalizację za pomocą obrazowania.

UWAGA: W niektórych mutantach rzęsek lokalizacja białek polarności jest zaburzona. Należą do nich Vangl2 i Gαi3, które, jak wykazano, są zakłócone w ślimaku z mutacją Ift20, Bbs8 i Bbs6.

UWAGA: Dalsze przykłady ilościowego określania i wyświetlania polaryzacji komórek rzęsatych można znaleźć w poniższych artykułach. Curtin, et al. (2003) Current Biology22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology24, May-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology25, Yin et al (2012) PloS one 26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wycięcie ślimaka i przygotowanie tkanek

Po usunięciu mózgu, po strzałkowym rosekcji głowy myszy P0 w linii środkowej, można zobaczyć błędnik kostny, widziany od tyłu, (Rysunek 1A, biała strzałka) i usunąć. Rycina 1B przedstawia izolowane błędniki kostne z włosami ślimakowymi skierowanymi do góry, brzusznymi (po lewej) i od tyłu grzbietowymi (po prawej). Biała strzałka wskazuje o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowując tkankę ślimaka do analizy, należy pamiętać o kilku kluczowych kwestiach. Po pierwsze, różnice w tle genetycznym mogą modyfikować fenotyp ślimaka, co sprawia, że konieczne jest analizowanie i porównywanie tylko kontroli z miotu. Po drugie, całkowite usunięcie błony tektorialnej jest wymagane w celu uzyskania najlepszych obrazów za pomocą immunohistochemii i jest niezbędne dla SEM. Błona tektorialna jest nieprzezroczystą strukturą i może zasłaniać komórki nabłonka czuciowego bezpośrednio pod nią, co utrudnia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor chciałby podziękować Matthew Kelley, Tizianie Cogliati, Jessice Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivce Levron, Violi Kretschmer i Zoe Mann za ich krytyczną ocenę manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez Sofję Kovalevskaya Award (Fundacja Humbodlt) oraz Uniwersytet Johannesa-Gutenberga w Moguncji w Niemczech.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzia/Sprzęt
Elastomer silikonowy - Sylgard 184Sigma-Aldrich761028-5EAPatrz uwaga 2
Nożyczki do mikro preparacji - proste ostrzeRóżne
Cienkie kleszcze (nr 5 i 55) i kleszczeRóżne
Mikroskop preparacyjny.Różne
Szkiełka mikroskopowe ze szkła niepowlekanegoRóżne
szkiełka nakrywkowe do mikroskopów (22 mm & razy; 40 mm & razy; 0,15 mm)Różne
pipety transferoweRóżne
szpilki Minutien  Fine Science Tools26002-10
Uchwyt na próbki SEMtousimis8762
Szpilki do skaningowej mikroskopii elektronowejTED PELLA16111
PELCO Zakładki: Klej węglowyTED PELLA16084-3
Mikroskop fluorescencyjnyRóżne
Suszarka do punktów krytycznychRóżne
Skaningowy mikroskop elektronowyRóżne
szkiełka mikroskopoweRóżne
szkiełka nakrywkoweRóżne
chusteczki Kimwipe Różne
drobne odczynniki
do pędzli
1 i razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco/Life Technologies10010023
Paraformaldehyd  (PFA) (Klasa EM wymagana dla EM)RóżnePrzygotuj 4% roztwór w 1 i razy; PBS za każdym razem świeży. Klasa EM wymagana dla EM.
2,5% Aldehyd glutarowy Grade1Sigma-AldrichG5882
Tris-HCl (pH 7,5)Różne
NaClRóżne
CaCl 2Różne
Triton X-100Różne
Normalna surowica koziaRóżne
affiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-007-003
Fluoromount-G Media montażoweSouthernBiotech0100-01
10 razy; Hanksa' Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Gibco/Life Technologies14065
HepesGibco/Life Technologies15630-080
Tetroksynek osmu (OsO4 )Sigma-Aldrich/Fluka Analytical75632
Kwas garbnikowySigma-Aldrich403040
Etanol 200 proofRóżne
przeciwciała
anty Arl13bProtein Tech17711-1-APSugerowane stężenie 1:1,000
anty acetylowana tubulina (611-B1)Sigma-AldrichT6793Sugerowane stężenie 1:800
anty gamma tubulina (GTU-88)Sigma-AldrichT6557Sugerowane stężenie 1:200
anty Zo_1 Invitrogen40-2300Sugerowane stężenie 1:500
Myosin VIProteus Biosciences25-6791Sugerowane stężenie 1:1000
Myosin VIIaProteus Biosciences25-6790Sugerowane stężenie 1:1,000
anty Vangl2Merk MilliporeABN373Sugerowane stężenie 1:250
anty Gα i3Sigma-AldrichG4040Sugerowane stężenie 1:250
Alexa Fluor® 488 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12379Sugerowane stężenie 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12380Sugerowane stężenie 1:300 - 1,000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7(2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378(2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7(2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839(2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988(2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925(2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przew d limakaorientacja kom rek rz skowychimmunohistochemiaskaningowa mikroskopia elektronowamikroskopia konfokalnaacetylowana tubulinamiozyna VIIAZO 1falloidyna

Powiązane artykuły