Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Podsumowanie

Opisujemy prostą i szybką eksperymentalną procedurę generowania pierwotnych fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Procedura nie wymaga specjalnego szkolenia zwierząt i może być stosowana do generowania kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni.

Streszczenie

Komórki pierwotne pochodzą bezpośrednio z tkanki i są uważane za bardziej reprezentatywne dla fizjologicznego stanu komórek in vivo niż ustalone linie komórkowe. Jednak pierwotne hodowle komórkowe mają zwykle skończoną długość życia i muszą być często odtwarzane. Fibroblasty są łatwo dostępnym źródłem komórek pierwotnych. Tutaj omawiamy prostą i szybką procedurę eksperymentalną mającą na celu ustanowienie pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Protokół może być stosowany do tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni. Jeśli protokół jest dokładnie przestrzegany, w niektórych przypadkach jest mało prawdopodobne, aby doszło do skażenia, pomimo użycia niesterylnej tkanki przechowywanej przez dłuższy czas. Fibroblasty szybko namnażają się w kulturze i mogą zostać rozszerzone do znacznych liczb przed ulegnięciem starzeniu replikacyjnemu.

Wprowadzenie

Pierwotne komórki pochodzą z żywej tkanki i są hodowane w warunkach in vitro. Na ogół przyjmuje się, że komórki pierwotne bardziej przypominają stan fizjologiczny i tło genetyczne tkanki, z której pochodzą, niż unieśmiertelnione lub nowotworowe linie komórkowe¹. Z tego powodu komórki pierwotne stanowią użyteczny model do badania zagadnień biologicznych^2,3. Jednak w przeciwieństwie do ustalonych linii komórkowych, które rosną w nieskończoność, komórki pierwotne ostatecznie ulegają starzeniu w hodowli i muszą być często odtwarzane.

Powszechnie używane komórki pierwotne obejmują fibroblasty, komórki nabłonkowe, komórki śródbłonka, limfocyty T, limfocyty B, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) i komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BMDC). Fibroblasty są często wykorzystywane jako podstawowy model hodowli komórek. Oferują one kluczowe zalety w porównaniu z innymi ogniwami pierwotnymi. Hodowle komórkowe są łatwe do założenia, łatwe w utrzymaniu i nie wymagają oczyszczania komórek przed hodowlą. Charakteryzują się szybką początkową proliferacją i nie wymagają specjalistycznych pożywek ani protokołów aktywacji. Fibroblasty mogą być skutecznie transfekowane przy użyciu protokołów biologicznych, chemicznych i fizycznych^4,5. Istnieje możliwość przechowywania uszu do 10 dni w RT przed założeniem hodowli komórkowych. Hodowle fibroblastów sprzyjają wizualizacji procesów cytoplazmatycznych i nadają się do przeprogramowania w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS)⁶.

Fibroblasty są ważnymi komórkami tkanki łącznej, które wydzielają białka kolagenu i macierz zewnątrzkomórkową⁷. Stanowią one szkielet strukturalny w wielu tkankach⁸ i odgrywają zasadniczą rolę w gojeniu się ran i naprawie tkanek^9,10.

Tutaj opisujemy prosty i szybki (<4 godziny) protokół tworzenia kultur fibroblastów z uszu i ogona myszy¹¹. Protokół wymaga minimalnego doświadczenia myszy w pobieraniu tkanek (w przeciwieństwie do innych protokołów^12,13) i może być stosowany do tworzenia kultur z uszu przechowywanych w pożywce w temperaturze RT przez okres do 10 dni.

Protokół

Myszy były trzymane w warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi do czasu eutanazji (wytyczne Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Narodowym Uniwersytecie Singapuru oraz wytyczne Krajowego Komitetu Doradczego ds. Badań na Zwierzętach Laboratoryjnych (NACLAR)).

1. Myszy

1. Zamów jedną mysz o odpowiednim tle genetycznym. Protokół ten opiera się na tkance pochodzącej z jednej myszy C57BL/6.

2. Przygotowanie kompletnego podłoża

1. Przygotuj kompletną pożywkę, dodając następujące składniki do pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: 10% płodowa surowica cielęca (FCS), 50 μM 2-merkaptoetanolu, 100 μM asparagina, 2 mM glutamina, 1% roztwór penicyliny i streptomycyny.

3. Przygotowanie roztworów enzymatycznych

1. Przygotować roztwór kolagenazy D w probówce o stożkowym dnie o pojemności 15 ml.
   1. Odważyć 10 mg kolagenazy D. Kolagenazę D rozpuścić w 4 ml kompletnej pożywki.
2. Przygotować roztwór pronazy w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
   1. Odważyć 10 mg pronazy.
   2. Dodać 5 μl 1 M buforu Tris (pH 8,0). Dodać 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0).
   3. Uzupełnij 494 μl sterylnej wody.
   4. Inkubować roztwór pronazy w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.

4. Przygotowanie mieszanki D-pronazy kolagenowej (≤2 ogonki)

Uwaga: Wykonaj kolejne kroki w sterylnym kapturze do hodowli komórek.

1. Dodać 250 μl roztworu pronazy do 4 ml roztworu kolagenazy D.
2. Przepuścić mieszaninę D-pronazy kolagenazy przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do sterylnej probówki o stożkowym dnie o pojemności 15 ml.

5. Ekstrakcja fibroblastów z tkanek uszu i ogona

1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Umieść autoklawowane narzędzia chirurgiczne (nożyczki i kleszcze) w kapturze do hodowli komórkowych.
3. Dodaj 10 ml kompletnej pożywki do dwóch naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm każda.
4. Odetnij nożyczkami uszy (promień ~1 cm) i 5 cm ogona (od czubka ogona) myszy i inkubuj przez 5 minut w 40 ml 70% etanolu w sterylnej probówce ze stożkowym dnem o pojemności 50 ml.
5. Wysuszyć uszy i ogon na powietrzu, umieszczając je w otwartym 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych w kapturze na 5 minut. Po wysuszeniu przenieść kawałki uszu i ogona do dwóch szalek hodowlanych oznaczonych jako "uszy" i "ogon", zawierających 10 ml kompletnej pożywki, jak opisano w kroku 5.3.
6. Usuń włosy z uszu i ogona za pomocą nożyczek.
7. Pokrój uszy i ogon na kawałki o wielkości mniejszej niż 3 mm za pomocą nożyczek.
8. Przenieść pocięte tkanki do fiolek z krioprobówką o pojemności 1,8 ml oznaczonych jako "uszy" i "ogonek" i dodać tyle roztworu D-pronazy kolagenazy, aby objętość osiągnęła oznaczenie 1,8 ml na fiolce.
9. Umieścić fiolki z krioprobówkami poziomo na wytrząsarce i wstrząsać próbkami z prędkością 200 obr./min przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
10. Po 90 minutach inkubacji wyjąć fiolki z krioprobówką z wytrząsarki i umieścić fiolki w kapturze.
11. Dodać 10 ml kompletnej pożywki do dwóch 10 cm naczyń do hodowli komórkowych, z których każde są oznaczone jako "uszy" i "ogon", a następnie umieścić w każdym naczyniu sitko do komórek o średnicy 70 μm.
12. Umieścić strawione tkanki ucha i ogona w sitku do komórek o wielkości 70 μm w odpowiednio oznakowanych naczyniach przygotowanych w kroku 5.11 i mocno rozdrabniać tkanki za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 10 ml przez >5 minuty. Od czasu do czasu wstrząsać sitkiem do komórek w pożywce, aby wypłukać komórki z sitka do komórek.
13. Zawiesinę komórek z każdej płytki należy pobrać pipetą do dwóch probówek o stożkowym dnie o pojemności 15 ml oznaczonych jako "uszy" i "ogon". Umyj naczynie i sitko dodatkowymi 10 ml kompletnego podłoża i dodaj pożywkę do odpowiednich probówek ze stożkowym dnem o pojemności 15 ml.
14. Wirować zawiesinę komórkową przez 7 minut w temperaturze ~580 x g i 4 °C za pomocą wirówki komórkowej z chłodzeniem.
15. Usunąć sklarowany osad, dodać 10 ml kompletnego podłoża do osadu komórkowego w stożkowej probówce dolnej o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić komórki.
16. Powtórz kroki 5.14 i 5.15.

6. Hodowla mieszaniny komórek

1. Usunąć supernatant. Upewnij się, że osad komórkowy pozostaje nienaruszony.
2. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnej pożywki i dodać odpowiednią mieszaninę do dwóch 10-centymetrowych szalek do hodowli komórkowych oznaczonych "uszy" i "ogon".
3. Dodać 10 μl roztworu amfoterycyny B (roztwór podstawowy: 250 μg/ml) do hodowli.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
5. Trzeciego dnia zastąpić pożywkę 10 ml świeżej, kompletnej pożywki zawierającej 10 μl amfoterycyny B w celu usunięcia zanieczyszczeń (ryc. 1 i 2).

7. Subkultura fibroblastów

1. Gdy hodowla osiągnie około 70% konfluencji (3-4 dzień hodowli), usuń pożywkę i umyj komórki 5 ml sterylnego 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).
2. Usuń PBS i dodaj 2 ml sterylnego 1x roztworu trypsyny-EDTA do komórek.
3. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
4. Po 5 minutach delikatnie postukaj w naczynie hodowlane i dodaj 6 ml kompletnej pożywki do komórek.
5. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze ~450 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki komórkowej z chłodzeniem.
6. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnego podłoża
.
7. Wysiewać 2 x 10⁵ komórek w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO_{2 przez} 3-4 dni, a następnie powtórzyć kroki 7.1 do 7.6.

8. Przygotowanie uszu do wysyłki

Uwaga: Wykonaj kolejne kroki w sterylnym kapturze do hodowli komórek.

1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Umieść autoklawowane nożyczki i kleszcze w kapturze do hodowli komórkowych.
3. Dodać 50 ml kompletnej pożywki do probówki ze stożkowym dnem o pojemności 50 ml.
4. Wytnij nożyczkami uszy (promień ~1 cm) myszy.
5. Przenieś uszy do stożkowej probówki dolnej o pojemności 50 ml (przygotowanej w kroku 3) za pomocą kleszczy.
6. Stożkową probówkę o pojemności 50 ml należy zapieczętować parafilmem przed wysyłką w RT w odpowiednim pudełku.

Wyniki

Izolacja fibroblastów z tkanki skutkuje powstaniem znacznej ilości debris tkankowych (Rysunek 1). W przeciwieństwie do debris tkankowych, fibroblasty przylegają do plastikowych powierzchni naczyń hodowlanych między 1. a 3. dniem hodowli. Połziewkę w hodowlach fibroblastów można bezpiecznie wymienić w 3. dniu hodowli, co powinno znacząco zmniejszyć poziom obecnych w kulturze debris (Rysunek 2). Fibroblasty charakteryzują się wydłużoną morfologią i wyraźnie widoczną cytoplazmą (Rys...

Dyskusja

Tutaj zapewniamy prostą, niedrogą i szybką procedurę eksperymentalną do ustalenia pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Ekstrakcja powinna skutkować przylegającymi i szybko dzielącymi się fibroblastami w ciągu 3 dni po wyizolowaniu tkanki. Ważnym ograniczeniem komórek pierwotnych jest starzenie się, trwałe zatrzymanie wzrostu¹⁵. Korzystając z protokołu, kultury fibroblastów mogą być pasażowane od 5 do 6 razy, zanim fibroblasty staną się stare, co wskazuje na spłaszczenie komórek, wzrost rozmia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Surowica płodowa cielęca	HyClone	SV30160.03
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagina	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamina	Sigma-Aldrich	G8540
Hyklon penicyliny/streptomycyny		SV30010
Etanol	Merck Millipore	107017	Absolut do analizy
Kolagenaza D	Roche Diagnostyka	11088866001	Z Clostridium histolyticum, liofilizowana, niesterylna
proteaza pronazy	Merck Millipore	53702	Z Streptomyces griseus  Bufor
Tris (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra czysty
gatunek 0,5M EDTA (pH 8)	1.	BAZA BUF-1053	Klasa biotechnologiczna
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	1. BAZA	BUF-2040-10X4L	Ultra czysty
roztwór trypsyny-EDTA 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0,5% trypsyna, 0,2% EDTA, gamma trypsyny napromieniowana metodą SER-TAIN, bez czerwieni fenolowej, w soli fizjologicznej
Amfoterycyna B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μ g/ml w wodzie dejonizowanej, sterylnie filtrowane
Nożyczki	Aesculap
Kleszcz	Aesculap	AE-BD312R
0,2 μ M filtr strzykawkowy	Sartorius Stedim	16534
70 μ Filtr siatkowy do komórek M	SPL	93070
Tłok strzykawkowy	Terumo	SS+10L
Probówka kriowialna	NUNC	368362
Probówka do mikrowirówek 1,7 ml	Axygen	MCT-175-C
Naczynie do hodowli komórkowych 10 cm	Greiner	664160	Naczynie poddane hodowli komórkowej
Probówka stożkowa 15 ml	Greiner	188271
Probówka stożkowa denna 50 ml	Greiner	227261
Łaźnia wodna	GFL	1002
Wirówka	Eppendorf	5810R
Wytrząsarka inkubacyjna	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Mikroskop świetlny Zeiss Axiovert 25	Carl Zeiss AG