Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia

Summary

Opisano metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.

Abstract

Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI) poprawiły się do tego stopnia, że zaczynają być użyteczne w nagraniach in vivo. Chociaż ostatecznym celem jest zobrazowanie aktywności neuronalnej in vivo, aby zapewnić skuteczne przygotowanie in vivo, konieczne jest zobrazowanie aktywności pojedynczej komórki. Ta procedura opisze, w jaki sposób obrazować potencjał błonowy w pojedynczej komórce, aby zapewnić podstawę do ostatecznego obrazowania in vivo. W tym miejscu opisujemy metody obrazowania GEVI składających się z domeny wykrywającej napięcie połączonej z pojedynczym białkiem fluorescencyjnym (FP) lub dwoma białkami fluorescencyjnymi zdolnymi do transferu energii rezonansu Förstera (FRET) in vitro. Korzystanie z rozdzielacza obrazu umożliwia jednoczesne rzutowanie obrazów utworzonych przez dwie różne długości fal na tę samą kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Rozdzielacz obrazu umieszcza drugi sześcian filtra na ścieżce światła. Ten drugi sześcian filtracyjny składa się z filtra dichroicznego i dwóch filtrów emisyjnych do oddzielania długości fal fluorescencyjnych donorowych i akceptorowych w zależności od FP GEVI. Taka konfiguracja umożliwia jednoczesne rejestrowanie zarówno akceptora, jak i dawcy partnerów fluorescencyjnych, podczas gdy potencjał błony jest manipulowany za pomocą konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. W przypadku korzystania z GEVI składającego się z pojedynczego FP, drugą kostkę filtrującą można wyjąć, co pozwala lusterkom w rozdzielaczu obrazu na wyświetlanie pojedynczego obrazu na kamerę CCD.

Introduction

Głównym celem tego artykułu jest pokazanie optycznego obrazowania zmian potencjałów błonowych in vitro przy użyciu genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych. Obrazowanie zmian potencjału błonowego daje ekscytującą możliwość badania aktywności obwodów neuronalnych. Gdy zmiany potencjału błonowego powodują zmianę intensywności fluorescencji, każdy piksel kamery staje się elektrodą zastępczą, umożliwiając nieinwazyjne pomiary aktywności neuronalnej. Przez ponad czterdzieści lat organiczne barwniki wrażliwe na napięcie były przydatne do obserwacji zmian potencjału błonowego ^1-4. Jednak barwnikom tym brakuje specyficzności komórkowej. Ponadto niektóre typy komórek są trudne do barwienia. Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI) przezwyciężają te ograniczenia dzięki specyficznej ekspresji badanych komórek w fluorescencyjnej sondzie wrażliwej na napięcie.

Istnieją trzy klasy GEVI. Pierwsza klasa GEVI wykorzystuje domenę wykrywania napięcia z fosfatazy wykrywającej napięcie z pojedynczym białkiem fluorescencyjnym (FP) ^5-9 lub parą rezonansowego transferu energii rezonansu Förstera (FRET) ^10-12. Druga klasa czujników wykorzystuje rodopsynę mikrobiologiczną jako wskaźnik fluorescencyjny bezpośrednio ^13-15 lub za pośrednictwem elektrochromowego FRET ^16,17. Trzecia klasa wykorzystuje dwa składniki, składnik genetyczny to FP zakotwiczony w błonie, a drugi składnik to barwnik hartowniczy związany z błoną ^18-20. Podczas gdy druga i trzecia klasa są użyteczne w eksperymentach in vitro i slice^19,20, tylko pierwsza klasa czujników jest obecnie przydatna w analizach in vivo ⁶.

W tym raporcie zademonstrujemy obrazowanie potencjału błonowego przy użyciu pierwszej klasy GEVI (Rysunek 1) in vitro. Ta pierwsza klasa czujników napięcia jest najłatwiejsza do przejścia na obrazowanie in vivo. Ponieważ czujniki GEVI wykorzystujące domenę wykrywania napięcia połączoną z FP są około 50 razy jaśniejsze niż czujniki klasy rodopsyn, można je obrazować za pomocą oświetlenia lampą łukową, bez konieczności stosowania niezwykle silnego lasera. Inną konsekwencją rozbieżności w jasności jest to, że pierwsza klasa GEVI może z łatwością przekroczyć autofluorescencję mózgu. Sondy oparte na rodopsynach nie mogą. Trzecia klasa czujnika jest tak samo jasna jak pierwsza klasa, ale wymaga dodania chemicznego środka wygaszającego, który jest trudny do zastosowania in vivo.

Dlatego zademonstrujemy nabycie sondy za pomocą pojedynczego FP (Bongwoori) ⁸ i sondy składającej się z pary FRET (Nabi 2) ¹². Konstrukty FRET w tym raporcie są motylkowymi wersjami VSFP-CR (wrażliwe na napięcie białka fluorescencyjne - Clover-mRuby2) ¹¹ składającymi się z zielonego donora fluorescencyjnego, Clover, i czerwonego akceptora fluorescencyjnego, mRuby2, o nazwach Nabi 2.242 i Nabi 2.244 ¹². Wprowadzenie do tego typu nagrań powinno dać naukowcom lepsze zrozumienie rodzaju informacji, które mogą dostarczyć GEVI.

Rysunek 1. Dwa typy genetycznie kodowanych wskaźników napięcia (GEVI) zobrazowanych w tym raporcie: (A) GEVI oparty na mono FP z transbłonową domeną wykrywania napięcia i białkiem fluorescencyjnym. (B) GEVI oparty na FRET składający się z transmembranowej domeny wykrywania napięcia, donora i akceptora FRET. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Protokół eksperymentu na zwierzętach został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w KIST Animal Protocol 2014-001.

1. Ustawienia sprzętu

1. Konfiguracja obrazowania
   1. Umieść odwrócony mikroskop fluorescencyjny na stole do izolacji drgań. Użyj soczewki obiektywowej o dużym powiększeniu (60-krotna soczewka olejkowa z aperturą numeryczną 1,35) i kostki filtrującej wyposażonej w lustro dichroiczne i filtry odpowiednie dla białek fluorescencyjnych używanych do obrazowania napięciowego.
      Uwaga: Ta konfiguracja wykorzystuje mikroskop odwrócony w celu zastosowania obiektywów o wyższym NA, ale można również używać mikroskopów pionowych. Rzeczywiście, mikroskop odwrócony służy tylko do opracowywania sondy, ponieważ soczewka obiektywu o wyższej aperturze numerycznej (NA) zbiera więcej światła niż soczewka o niskim NA, poprawiając w ten sposób stosunek sygnału do szumu (SNR; można go opisać jako szczytowy sygnał optyczny podzielony przez odchylenie standardowe podstawowej fluorescencji) nagrania. Dla osób, które nie są programistami, polecamy mikroskop pionowy do zastosowań takich jak nagrywanie w warstwach lub in vivo.
   2. Przygotuj źródło światła, np. ksenonową lampę łukową, wyposażoną w mechaniczną przesłonę do wydajnego obrazowania epifluorescencyjnego w szerokim polu. Skieruj światło do mikroskopu za pomocą uchwytu światłowodu. Światło przejdzie przez filtr wzbudzenia i zostanie odbite przez pierwsze zwierciadło dichroiczne w kostce filtra. Ustaw światło, aby równomiernie oświetlić próbkę z maksymalnym natężeniem światła w polu view ²¹.
      Uwaga: Tradycyjnie stosowano lampę łukową o mocy 75 W, ponieważ żarówki o większej mocy tworzą większe, ale nie jaśniejsze pola oświetleniowe. Lasery mogą być używane, ale są ograniczone do jednej długości fali. Diody LED stają się coraz jaśniejsze i rzeczywiście mogą być preferowanym źródłem światła oferującym wiele długości fal i niewymagającym mechanicznej migawki.
   3. Zamontuj dwie kamery CCD do mikroskopu fluorescencyjnego, jak pokazano na rysunku 2D.
      Uwaga: Pierwsza kamera CCD ma wysoką rozdzielczość przestrzenną i służy do identyfikacji komórki wyrażającej GEVI w błonie plazmatycznej, która ma być testowana. W przypadku obrazowania zmian potencjału błonowego należy upewnić się, że druga kamera CCD ma wysoką liczbę klatek na sekundę, taką jak 1 000 klatek na sekundę (fps). Użyj dwuportowego adaptera aparatu (Rysunek 2D-(3)), aby przełączyć ścieżkę obrazowania między dwiema kamerami CCD. W tej konfiguracji służy demagnifier do dopasowania obrazu z obiektywu do układu CCD w drugiej kamerze CCD.
   4. Zainstaluj rozdzielacz obrazu między pierwszą (wolną) i drugą (szybką) kamerą CCD, aby obrazować GEVI oparte na FRET. Włóż kostkę filtracyjną z lustrem dichroicznym (560 nm) i dwoma filtrami emisyjnymi (520 nm/40 i 645 nm/75) do rozdzielacza obrazu. Spowoduje to powstanie dwóch pól widzenia, jednego dla fluorescencji dawcy, a drugiego reprezentującego fluorescencję akceptorową. Usuń tę drugą kostkę filtra podczas obrazowania GEVI za pomocą pojedynczego FP.
      Uwaga: Pojedynczy GEVI oparty na FP testowany w tej metodzie to Bongwoori, który wykorzystuje FP, super ekliptykę pHluorin A227D (SE A227D). Filtr wzbudzenia (472 nm/30), filtr emisyjny (497 nm/długi przepust) i zwierciadło dichroiczne (495 nm) zostały wybrane na podstawie jego widm wzbudzenia i emisji ⁵. Ogólnie rzecz biorąc, filtry wzbudzenia i emisji powinny w największym stopniu pokrywać się z każdym widmem fluoroforu, aby uzyskać jasny obraz, podczas gdy zwierciadło dichroiczne blokuje wszelkie światło wzbudzenia przekazywane przez filtr emisyjny. Wybór filtrów i zwierciadeł dichroicznych do zapisu GEVI opartego na parze FRET ¹¹ opiera się na tej samej zasadzie, z tą różnicą, że wymaga to drugiej kostki filtrującej w rozdzielaczu obrazu do jednoczesnej obserwacji fluorescencji donorowej i akceptorowej. Pierwsza kostka filtracyjna umieszczona w pudełku filtra mikroskopowego musi mieć filtr wzbudzenia (475 nm/23) dla Clover. Następnie wyemitowana fluorescencja z obu FP zostanie przekazana do drugiej kostki filtracyjnej przez pierwsze zwierciadło dichroiczne (495 nm). Drugi sześcian filtracyjny ma zwierciadło dichroiczne (560 nm) i dwa filtry emisyjne (520 nm/40 dla Clover i 645 nm/75 dla mRuby2) dla każdego FP, oddzielając w ten sposób fluorescencję od dwóch różnych FP.

Pojedynczy FP GEVI
(Bongwoori) GEVI
na bazie par FRET (Nabi 2.42 i Nabi 2.44) Pierwsza kostka filtra umieszczona w mikroskopie Filtr wzbudzenia 472 nm/30 475 nm/23 Lustro dichroiczne 495 nm 495 nm Filtr emisji spalin 497 nm/długie przejście - Drugi sześcian filtrujący umieszczony w rozdzielaczu wiązki Lustro dichroiczne - 560 nm Filtr emisji spalin 1 - 520 nm/40 mm Filtr emisji spalin 2 - 645 nm/75 mm

Tabela 1. Dwa różne zestawy filtrów używane do pojedynczych nagrań GEVI opartych na FP i GEVI opartych na FRET

2. Izolacja drgań
   1. Nie montuj żadnych urządzeń z ruchomymi elementami na stole wibroizolacyjnym. Upewnij się, że podłączone do nieizolowanego sprzętu są luźne, aby uniknąć wibracji próbki.
3. Komora zacisku krosowego
   1. Uszczelnij dno komory zacisku krosowego cienką szklanką osłonową #0, ponieważ odległość robocza obiektywu jest stosunkowo niewielka. Jest to wada zestawu mikroskopu odwróconego.
      Uwaga: W zamian za posiadanie soczewki obiektywowej o wysokim NA, odległość robocza zmniejsza się. Aby umieścić próbkę w bardzo krótkiej odległości roboczej, szkło nakrywkowe i szkiełko nakrywkowe (krok 2) muszą być jak najcieńsze.
4. Regulacja temperatury
   1. Upewnij się, że roztwór kąpieli przepływa przez regulator temperatury, aby utrzymać połatane komórki w temperaturze około 33 ^oC przez cały czas trwania eksperymentu.
5. Połączenia sprzętowe
   1. Podłącz patch clamp amplifier i mechaniczna migawka źródła światła do skrzynki poleceń Bayonet Neill-Concelman (BNC) szybkiej kamery CCD. Umożliwi to oprogramowaniu do obrazowania jednoczesne sterowanie wzmacniaczem, kamerą i źródłem światła.
      Uwaga: Elementy elektryczne i obrazowania muszą być zsynchronizowane, aby zapewnić jednoczesne elektryczne i optyczne zapisy aktywności elektrycznej.

Rysunek 2. Konfiguracja sprzętu do obrazowania napięcia za pomocą GEVI Przepływ pracy podążający za ścieżką światła, (A) ksenonowa lampa łukowa o mocy 75 W, (B) światło wzbudzenia z lampy łukowej jest filtrowane przez filtr wzbudzenia, a następnie odbijane przez pierwsze zwierciadło dichroiczne, zanim dotrze do etapu próbki, wstawka w prawym górnym rogu pokazuje całą konfigurację ogniwa, (C) wolnoobrotowa kamera CCD służy do pomocy zarówno w wyborze ogniwa, jak i patch clamp, (D) części do akwizycji obrazu; (1) szybka kamera CCD, (2) rozdzielacz obrazu zarówno dla pary FRET, jak i mono FP GEVI, (3) powiększacz do dopasowania obrazu do układu CCD w szybkiej kamerze CCD, (4) dwuportowy adapter kamery do przełączania ścieżki obrazowania i (5) wolnoobrotowa kamera CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej do identyfikacji komórki do łatania, (E&F) akwizycja obrazu za pomocą GEVI (E) opartego na pojedynczym FP i GEVI (F) opartego na FRET. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wyrażenie GEVIs

1. W ludzkiej nerce embrionalnej 293 komórki
   1. Hodowla komórek ludzkiej embrionalnej nerki 293 (HEK 293) ze zmodyfikowaną pożywką Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 ^oC w inkubatorze CO₂ (5% CO₂ ). Użyj naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i wysokości 20 mm. Rozpocznij hodowlę od 2 x 10³ - 6 x 10³ komórek/cm² i inkubuj, aż osiągną 80-90% zbiegu w celu późniejszej transfekcji.
   2. W dniu transfekcji odessać pożywkę komórkową i delikatnie przemyć raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco. Rozproszyć komórki HEK 293 0,25% roztworem trypsyny-EDTA przez 1-2 minuty, odessać roztwór i delikatnie postukać w bok naczynia, aby oderwać komórki. Dodać świeży DMEM (10% FBS) i oddzielić zbite komórki za pomocą pipetowania. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
   3. Szkiełka nakrywkowe o grubości 0,08 - 0,13 mm i średnicy 10 mm należy umieścić wstępnie pokryte poli-L-lizyną na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Wysiewaj komórki HEK 293 na szkiełkach nakrywkowych w gęstości 1 x 10^{5 komórek /} cm² komórek.
      Uwaga: Ponieważ komórki HEK 293 są zdolne do tworzenia połączeń szczelinowych ze sobą, liczba zarodków musi dać izolowane komórki.
   4. Przejściowo transfekować komórki odpowiednim konstruktem genu kodującym GEVI za pomocą odczynnika do lipofekcji zgodnie z instrukcją producenta.
      Uwaga: Konstrukty genów użyte na tym etapie wykorzystywały pcDNA3.1 (Bongwoori) i pUB2.1 (Nabi 2.242) jako wektory szkieletowe. Ilość użytego DNA wynosiła 100 ng na każde szkiełko nakrywkowe; jednak warunki transfekcji muszą być empirycznie określone dla każdego GEVI, który ma być badany.
2. W zdysocjowanych pierwotnych neuronach hipokampa myszy
   1. Wypreparuj hipokampy od embrionalnych myszy C57BL6 / N w dniu 17, a następnie dysocjuj neurony hipokampa, jak opisano wcześniej ^22,23.
   2. Umieść zdysocjowane neurony na poli-D-lizynie pokrytych szkiełkami nakrywkowymi o grubości 0,08-0,13 mm i średnicy 10 mm przy gęstości komórek 1 x 10⁵ komórek/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 ^oC w inkubatorze CO₂ (5 % CO₂ ).
   3. Transfekcja zdysocjowanych neuronów przejściowo po 6 - 7 dniach in vitro (DIV) za pomocą konstruktu genu kodującego GEVI przy użyciu odczynnika do transfekcji fosforanu wapnia, jak opisano ^{wcześniej 24}.
      Uwaga: Konstrukty genów użyte w tym kroku wykorzystywały pcDNA3.1 (Bongwoori) i pUB2.1 (Nabi 2.244) jako wektory szkieletowe. Ilość użytego DNA wynosiła 1 μg na każde szkiełko nakrywkowe. Ponownie, warunki transfekcji muszą być empirycznie określone dla każdego testowanego GEVI.
3. Sprawdź poziom ekspresji przed obrazowaniem napięcia
   1. Pobrać płytkę do hodowli tkankowej z inkubatora CO₂ i obserwować fluorescencję transfekowanych komórek pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
   2. Po potwierdzeniu fluorescencji z membrany, przenieść szkiełko nakrywkowe do komory łatania w celu obrazowania napięciowego w sekcji 3.
      Uwaga: Obrazowanie napięcia przeprowadza się 16 - 24 godziny po transfekcji. Ponieważ jednak różne białka fluorescencyjne mają różny czas dojrzewania, niektóre GEVI potrzebują więcej czasu po transfekcji. Na przykład pary FRET zawierające mRuby2 w tym protokole mogą potrzebować więcej czasu na ekspresję, ponieważ dojrzewanie mRuby2 trwa znacznie dłużej niż Clover¹¹. Należy sprawdzić fluorescencję zarówno dawcy, jak i akceptora.

3. Protokół obrazowania napięcia

1. Wybierz zdrową komórkę z dobrą ekspresją błony
   1. Za pomocą mikroskopii znajdź zdrową komórkę (ryc. 4B), która wykazuje silną fluorescencję zlokalizowaną w błonie w porównaniu z fluorescencją wewnętrzną. Staraj się nie łatać zaokrąglonych komórek. Okrągłe komórki albo się dzielą, albo umierają i są trudne do załatania. Zastosuj impuls testowy o amplitudzie 5,0 mV i czasie trwania 5,0 ms, aby wspomóc kolejne eksperymenty z zaciskiem krosowym.
2. Przygotowanie ogniwa do obrazowania napięcia
   1. Po wybraniu celi do załatania, umieść pipetę z zaciskiem krosowym nad celą. Opuść pipetę, aż delikatnie dotknie błony komórkowej. Na tym etapie należy zaobserwować wzrost rezystancji membrany o 1 MΩ - 2 MΩ w oprogramowaniu do zacisków krosowych ²⁵.
      UWAGA: Czasami dobre uszczelnienie giga-omowe może wystąpić po prostu przez dotknięcie błony komórkowej. Dopóki uszczelka giga-ohm jest stabilna, powinno być OK.
   2. Utrwal uszczelnienie giga-omowe, delikatnie przykładając podciśnienie przez pipetę. Ustaw potencjał pipety na żądany potencjał trzymania.
   3. Zachowując uszczelnienie giga-omowe, zobrazuj komórkę za pomocą szybkiej kamery CCD i skoncentruj ją na obszarze membrany.
   4. Rozerwij błonę komórkową, delikatnie stosując impulsy ssania ustami lub strzykawką, aby uzyskać konfigurację całej komórki ²⁶.
   5. Zobrazuj komórkę z zaciśniętą łatką w konfiguracji zacisku całej komórki zgodnie z projektem eksperymentalnym za pomocą oprogramowania do obrazowania
      1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Kliknij menu [ACQUIRE] - [SciMeasure Camera], aby otworzyć stronę "CCD ACQUIRE".
      2. Utwórz nowy plik danych, aby zapisać obrazy.
      3. Kliknij [ANALOGUE OUTPUT], a następnie [Read an ASCII], aby otworzyć plik protokołu impulsowego w celu przeprowadzenia obrazowania. Kliknij "Uśrednij powtórzenia wewnętrzne", jeśli dane wymagają uśrednienia. Następnie zamknij stronę 'WYJŚCIE ANALOGOWE'.
         Uwaga: Ten protokół impulsowy musi zostać zaprojektowany i zapisany jako plik ".txt" zgodnie z celem każdego eksperymentu przed tym krokiem.
      4. Ustaw określone parametry akwizycji na stronie "CCD ACQUIRE". Wprowadź określone wartości w polach "Liczba klatek do akwizycji" i "Liczba prób".
         Uwaga: Liczba ramek zależy od szybkości akwizycji i czasu protokołu impulsowego. Na przykład, jeśli obrazowanie odbywa się z częstotliwością 1 kHz, 1,000 klatek równa się 1 sekundzie czasu nagrywania.
      5. Kliknij przycisk [TAKE DATA (Optics + BNC)], aby rozpocząć nagrywanie. Podczas obrazowania napięcia obserwuj okno oscyloskopu w oprogramowaniu patch clamp, aby zapewnić stabilną konfigurację całych komórek podczas nagrywania.
         Uwaga: Aby przetestować zakres napięcia reagującego GEVI, wielkość sygnału w wartości ΔF/F lub rozdzielczość czasową w całym fizjologicznym zakresie napięcia, należy przeprowadzić eksperyment z cęgami napięcia całego ogniwa z protokołem impulsowym z krokowymi impulsami napięcia w zakresie od -170 mV do 130 mV. Aby określić wydajność GEVI w rozwiązywaniu potencjałów czynnościowych wywoływanych przez hodowane neurony pierwotne, zobrazuj komórkę w konfiguracji cęgów prądu całej komórki.

4. Akwizycja danych

1. Obliczanie ΔF/F
   1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Kliknij [PLIK] - [Odczytaj plik danych], aby otworzyć plik danych do analizy. Obserwuj obraz komórki w natężeniu światła spoczynkowego (RLI) po prawej stronie
      Uwaga: Oprogramowanie uśrednia pierwsze 5 klatek, aby określić RLI nagrania.
   2. Kliknij "Pokaż BNC", aby wyświetlić na ekranie zmierzone wartości prądu i napięcia.
   3. Zmień tryb strony z "Ramka RLI" na "Odejmowanie ramki", aby wykorzystać funkcję odejmowania ramki do identyfikacji pikseli z responsywnymi sygnałami optycznymi. To jest prawdziwa moc obrazowania, ponieważ każdy piksel może być badany pod kątem potencjalnych zmian we fluorescencji.
   4. Wybierz dwa punkty czasowe (F₀ i F₁) do odjęcia. Zidentyfikuj, który obszar komórki wykazuje sygnały reagujące na zmianę potencjału błony.
      Uwaga: Stosunek sygnału do szumu (SNR) dla obrazów odejmowania klatek można poprawić, wybierając wiele klatek dla każdego punktu czasowego, aby czasowo uśrednić sygnał. Oprogramowanie odejmuje średnie natężenie światła pobrane z wybranych kadrów i oblicza wartości F_{1-F 0} (ΔF). Zazwyczaj wybiera się punkt czasowy uzyskany w okresie utrzymywania i inny punkt czasowy przyjęty w okresie stymulacji.
   5. Wyznacz piksele, które mają zostać przeanalizowane, przeciągając lub klikając każdy piksel myszą komputerową. Obserwuj graficzne przedstawienie średniej intensywności fluorescencji z wybranych pikseli po lewej stronie okna oprogramowania. Rysunki 4B i 5B pokazują reprezentatywne obrazy z analizy odejmowania ramek.
   6. Podziel odjęte piksele przez RLI (F₀). Kliknij [Podziel przez RLI], aby uzyskać wartości ΔF/F
2. Eksport danych
   1. Oblicz wartości ΔF/F dla każdego kroku napięcia, aby dokładniej przeanalizować właściwości wykrywania napięcia GEVI. Wartości te służą do rysowania wykresów, takich jak ΔF/F w funkcji napięcia, do późniejszych analiz danych.
   2. Usuń wykresy prądu i napięcia, odznaczając menu "Pokaż BNC". Przejdź do [WYJŚCIE] -[Zapisz ślady jako wyświetlane (ASCII)], aby wyeksportować ślad fluorescencji w formacie pliku ASCII w celu analizy dopasowania krzywej za pomocą standardowego oprogramowania do tworzenia wykresów.

5. Analiza danych

1. Właściwość wykrywania napięcia GEVI
   1. Narysuj wykres zmiany fluorescencji w funkcji napięcia (F-V), wykreślając wartości ΔF/F w funkcji napięcia w programie do analizy danych. Dopasuj krzywą do funkcji Boltzmanna (Tabela 2), aby określić zakres napięcia sygnału optycznego, klikając [Analiza] - [Dopasowanie] - [Dopasowanie] - [Dopasowanie sigmoidalne] - [Otwórz okno dialogowe], a następnie wybierz funkcję Boltzmanna.
      Uwaga: Dopasowanie do funkcji umożliwia scharakteryzowanie właściwości wykrywania napięcia różnych sond napięciowych lub porównanie ich wydajności w różnych ogniwach. Funkcja Boltzmanna może być używana dla sond testowanych w tym artykule, ponieważ krzywe F-V z tych sond wykazują wzorzec sigmoidalny.
   2. Znormalizuj każdą wartość ΔF/F, używając wartości początkowej i końcowej (A₁ i A₂) obliczonych przez funkcję.
      Uwaga: W równaniu Boltzmanna minimum to A₁, a maksimum to A₂. Aby znormalizować, użyj aplikacji arkusza kalkulacyjnego, aby dostosować wartości ΔF/F, definiując A₁ jako zero, a A₂ jako jeden. Uśrednić znormalizowane wartości ΔF/F i obliczyć błąd standardowy do analizy statystycznej.
   3. Powtórzyć znormalizowane wartości ΔF/F w funkcji napięcia, jak opisano wcześniej w sekcji 5.1.1).
2. Szybkość odpowiedzi optycznej
   1. Otwórz plik ASCII uzyskany w kroku 4.2.2) za pomocą programu do analizy danych i wykreśl ślad ΔF/F w funkcji czasu.
   2. Kliknij "Selektor danych" w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz jeden punkt czasowy odpowiadający początkowi krokowego impulsu napięcia i drugi punkt czasowy, w którym sygnał optyczny osiągnął stan ustalony. Dopasuj ten zakres zarówno do pojedynczej, jak i podwójnej funkcji rozkładu wykładniczego, klikając [Analiza] - [Dopasowanie] - [Dopasowanie wykładnicze] - [Otwórz okno dialogowe] i wybierz funkcję rozkładu wykładniczego. Zgłoś lepsze dopasowanie.
      Uwaga: Dopasowując do funkcji pojedynczego lub podwójnego rozkładu wykładniczego, można uzyskać kwantyfikowane stałe czasowe reprezentowane przez τ. Pomoże to eksperymentatorom porównać kinetykę ich pomiarów wykonanych z różnymi wskaźnikami napięcia. Ślad fluorescencji może pokazywać szybkie i wolne składniki, które można opisać za pomocą funkcji podwójnego rozpadu wykładniczego. W takim przypadku wynikiem obliczeń będą dwie stałe czasowe o różnych amplitudach.
   3. Oblicz ważone stałe τ, aby porównać kinetykę sond wykazujących dwie składowe czasowe z sondami z pojedynczym komponentem.
      Uwaga: Ważone tau oblicza się jako sumę τ₁ pomnożoną przez amplitudę względną, A₁, plus τ₂ pomnożoną przez amplitudę względną A₂, zgodnie z następującym wzorem;

Results

Przejściowo transfekowane komórki mogą wykazywać znaczne różnice w intensywności fluorescencji i stopniu ekspresji błony plazmatycznej. Nawet na tym samym szkiełku nakrywkowym niektóre komórki będą miały różne poziomy fluorescencji wewnętrznej. Jest to najprawdopodobniej spowodowane ilością środka transfekcyjnego wchłoniętego przez komórkę. Czasami zbyt duża ekspresja powoduje, że komórka doświadcza niesfałdowanej odpowiedzi białkowej, co prowadzi do apoptozy ²⁷ (jasne, zaokrąg...

Discussion

Układ nerwowy wykorzystuje napięcie na kilka różnych sposobów, hamowanie powoduje lekką hiperpolaryzację, wejście synaptyczne powoduje lekką depolaryzację, a potencjał czynnościowy powoduje stosunkowo dużą zmianę napięcia. Możliwość pomiaru zmian potencjału błonowego przez GEVI oferuje obiecujący potencjał jednoczesnej analizy kilku składników obwodów neuronalnych. W niniejszym raporcie przedstawiono podstawową metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą GEVI.

Głównym kluczem do ob...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop odwrócony	Obiektyw Olympus	IX71
60X (apertura numeryczna = 1,35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Filtr wzbudzenia	Semrock	FF02-472/30	Do obrazowania napięciowego super ekliptycznej pHluorin w Bongwoori
Lustro dichroiczne	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtr emisyjny	Semrock	FF01-497/LP
75W Xenon arc	CAIRN	OptoSource Illuminator	Diody LED i lasery są również skutecznymi źródłami światła
Wolnoobrotowa kamera CCD	Hitachi	KP-D20BU
Dwuportowy adapter kamery	Olympus	U-DPCAD
Szybka kamera CCD	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Rozdzielacz obrazu	CAIRN	Optosplit 2
Filtr wzbudzenia	Semrock	FF01-475/23-25	Do obrazowania napięciowego GEVI opartego na parze FRET składającego się z Clover i mRuby2)
Lustro dichroiczne	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtr emisyjny	Chroma	ET520/40
Lustro dichroiczne	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Filtr spalinowy	Chroma	ET645/75
System tłumienia drgań	Systemy kinetyczne	250BM-IC, 5702E-3036-31
Komora krosowania	Przyrządy Warner	RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)	Mikroskopia elektronowa Sciences	72198-20
Regulator temperatury	Warner instruments	TC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - szkło nakrywkowe o średnicy 10 mm	Ted Pella	260366
Środek lipofekcyjny	Life Technologies	11668-027
Odczynnik fosforanu wapnia	Clontech - Takara	631312
Wzmacniacz zaciskowy	HEKA	EPC 10 Wzmacniacz
Wielokanałowe oprogramowanie do akwizycji danych	HEKA	Patchmaster
Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów	RedShirtImaging	Neuroplex
Arkusz kalkulacyjny Oprogramowanie		Microsoft Excel 2010
Oprogramowanie	do analizy danychLupa OriginLab	OriginPro 8.6.0
	Qioptiq LINOS	Optem standardowy łącznik do aparatu 0,38x SC38 J zacisk
Mikroskop konfokalny	Nikon	Nikon A1R
Odczynnik zapobiegający blaknięciu	Life Technologies	P36930