Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53566

⸱

4 lutego 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.

Streszczenie

Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI) poprawiły się do tego stopnia, że zaczynają być użyteczne w nagraniach in vivo. Chociaż ostatecznym celem jest zobrazowanie aktywności neuronalnej in vivo, aby zapewnić skuteczne przygotowanie in vivo, konieczne jest zobrazowanie aktywności pojedynczej komórki. Ta procedura opisze, w jaki sposób obrazować potencjał błonowy w pojedynczej komórce, aby zapewnić podstawę do ostatecznego obrazowania in vivo. W tym miejscu opisujemy metody obrazowania GEVI składających się z domeny wykrywającej napięcie połączonej z pojedynczym białkiem fluorescencyjnym (FP) lub dwoma białkami fluorescencyjnymi zdolnymi do transferu energii rezonansu Förstera (FRET) in vitro. Korzystanie z rozdzielacza obrazu umożliwia jednoczesne rzutowanie obrazów utworzonych przez dwie różne długości fal na tę samą kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Rozdzielacz obrazu umieszcza drugi sześcian filtra na ścieżce światła. Ten drugi sześcian filtracyjny składa się z filtra dichroicznego i dwóch filtrów emisyjnych do oddzielania długości fal fluorescencyjnych donorowych i akceptorowych w zależności od FP GEVI. Taka konfiguracja umożliwia jednoczesne rejestrowanie zarówno akceptora, jak i dawcy partnerów fluorescencyjnych, podczas gdy potencjał błony jest manipulowany za pomocą konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. W przypadku korzystania z GEVI składającego się z pojedynczego FP, drugą kostkę filtrującą można wyjąć, co pozwala lusterkom w rozdzielaczu obrazu na wyświetlanie pojedynczego obrazu na kamerę CCD.

Wprowadzenie

Głównym celem niniejszej pracy jest zaprezentowanie obrazowania optycznego zmian potencjałów błonowych in vitro z wykorzystaniem genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych. Obrazowanie zmian potencjału błonowego stwarza ekscytującą możliwość badania aktywności obwodów neuronalnych. Gdy zmiany potencjału błonowego skutkują zmianą intensywności fluorescencji, każdy piksel kamery staje się elektrodą zastępczą, umożliwiając nieinwazyjne pomiary aktywności neuronów. Przez ponad czterdzieści lat organiczne barwniki napięciowo-czułe były użyteczne w obserwacji zmian potencjału błonowego 1-4. Jednakże barwniki te nie wykazują specyficzności komórkowej. Ponadto niektóre typy komórek są trudne do zabarwienia. Genetycznie kodowane wskaźniki napięciowe (GEVIs) pokonują te ograniczenia poprzez specyficzną ekspresję fluorescencyjnej sondy napięciowo-czułej w badanych komórkach.

Wyróżnia się trzy klasy GEVIs. Pierwsza klasa GEVIs wykorzystuje domenę czuciową napięcia z fosfatazy czułej na napięcie wraz z pojedynczym białkiem fluorescencyjnym (FP) 5-9 lub parą do transferu energii przez rezonans Förstera (FRET) 10-12. Druga klasa sensorów wykorzystuje rodopsynę mikrobiologiczną bezpośrednio jako wskaźnik fluorescencyjny 13-15 lub poprzez elektrochromowy FRET 16,17. Trzecia klasa wykorzystuje dwa komponenty: komponent genetyczny w postaci zakotwiczonego w błonie białka FP oraz drugi komponent w postaci związanej z błoną farby gaszącej 18-20. Podczas gdy druga i trzecia klasa są przydatne w eksperymentach in vitro oraz na preparatach skrawkowych19,20, obecnie tylko pierwsza klasa sensorów znajduje zastosowanie w analizach in vivo 6.

W niniejszym raporcie przedstawimy obrazowanie potencjału błonowego przy użyciu pierwszej klasy GEVIs (Rysunek 1) in vitro. Ta pierwsza klasa czujników napięcia jest najłatwiejsza do przeniesienia do obrazowania in vivo. Ponieważ GEVIs wykorzystujące domenę wyczuwającą napięcie połączoną z białkiem fluorescencyjnym (FP) są około 50-krotnie jaśniejsze niż czujniki klasy rhodopsyn, można je obrazować przy użyciu oświetlenia lampą łukową, zamiast wymagać niezwykle mocnego lasera. Inną konsekwencją różnicy w jasności jest to, że pierwsza klasa GEVIs może łatwo przekroczyć poziom autofluorescencji mózgu. Sondy oparte na rhodopsynach nie potrafią tego zrobić. Trzecia klasa czujników jest tak samo jasna jak pierwsza, ale wymaga dodania chemicznego wygaszacza, który jest trudny do podania in vivo.

Przedstawimy zatem proces pozyskiwania sondy z pojedynczym białkiem FP (Bongwoori) 8 oraz sondy składającej się z pary FRET (Nabi 2) 12. Konstrukcje FRET opisane w niniejszym raporcie są wersjami „motylimi” VSFP-CR (voltage-sensitive fluorescent proteins - Clover-mRuby2) 11, składającymi się z zielonego fluorescencyjnego donora, Clover, oraz czerwonego fluorescencyjnego akceptora, mRuby2, nazwanymi Nabi 2.242 oraz Nabi 2.244 12. Wprowadzenie do tego rodzaju pomiarów powinno zapewnić badaczom lepsze zrozumienie rodzaju informacji, jakie mogą dostarczyć GEVIs.

Schemat domeny wyczuwającej napięcie z układem donora-akceptora FRET do analizy fluorescencyjnej.
Rysunek 1. Dwa rodzaje genetycznie kodowanych wskaźników napięcia (GEVI) obrazowanych w niniejszym raporcie (A) GEVI oparty na pojedynczym białku fluorescencyjnym (FP), posiadający transbłonową domenę wyczuwającą napięcie i białko fluorescencyjne. (B) GEVI oparty na FRET, składający się z transbłonowej domeny wyczuwającej napięcie, donora i akceptora FRET. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Protokół eksperymentów na zwierzętach został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w KIST, protokół zwierzęcy 2014-001.

1. Konfiguracja sprzętu

  1. Konfiguracja obrazowania
    1. Umieść odwrócony mikroskop fluorescencyjny na stole wibroizolacyjnym. Użyj obiektywu o dużym powiększeniu (obiektyw imersyjny 60X z aperturą numeryczną 1,35) oraz kostki filtracyjnej wyposażonej w lustro dichroiczne i filtry odpowiednie dla białek fluorescencyjnych użytych do obrazowania napięcia.
      Uwaga: Ta konfiguracja wykorzystuje mikroskop odwrócony, aby umożliwić zastosowanie obiektywów o wyższej aperturze numerycznej (NA), jednak można również używać mikroskopów prostych. W rzeczywistości mikroskop odwrócony służy jedynie do opracowywania sond, ponieważ obiektyw o wyższej aperturze numerycznej (NA) zbiera więcej światła niż obiektyw o niskiej NA, co poprawia stosunek sygnału do szumu (SNR; można go opisać jako szczytowy sygnał optyczny podzielony przez odchylenie standardowe fluorescencji tła) rejestracji. W przypadku osób nieopracowujących sond, rekomendujemy mikroskop prosty do zastosowań takich jak rejestracje z przekrojów tkankowych lub in vivo.
    2. Przygotuj źródło światła, np. lampę łukową ksenonową, wyposażoną w mechaniczną migawkę dla wydajnego obrazowania szerokopolowego w epifluorescencji. Skieruj światło do mikroskopu za pomocą uchwytu światłowodu. Światło przejdzie przez filtr wzbudzenia i zostanie odbite przez pierwsze lustro dichroiczne w kostce filtracyjnej. Wyreguluj światło tak, aby równomiernie oświetlało preparat przy maksymalnej intensywności światła w całym polu widzenia 21.
      Uwaga: Tradycyjnie stosowano lampę łukową o mocy 75 W, ponieważ żarówki o wyższej mocy tworzą większe, ale nie jaśniejsze pola oświetlenia. Można stosować lasery, ale są one ograniczone do jednej długości fali. Diody LED stają się coraz jaśniejsze i mogą być rzeczywiście preferowanym źródłem światła, oferując wiele długości fal i nie wymagając mechanicznej migawki.
    3. Zamontuj dwie kamery CCD do mikroskopu fluorescencyjnego, jak pokazano na Rysunku 2D.
      Uwaga: Pierwsza kamera CCD posiada wysoką rozdzielczość przestrzenną i służy do identyfikacji komórki wykazującej ekspresję GEVI w błonie komórkowej do testów. Do obrazowania zmian potencjału błonowego upewnij się, że druga kamera CCD ma wysoką częstotliwość odświeżania, np. 1000 klatek na sekundę (fps). Użyj dwuportowego adaptera kamery (Rysunek 2D-(3)), aby przełączać ścieżkę obrazowania między dwiema kamerami CCD. W tej konfiguracji używa się reduktora obrazu, aby dopasować obraz z obiektywu do matrycy CCD w drugiej kamerze CCD.
    4. Zainstaluj rozdzielacz obrazu między pierwszą (wolną) a drugą (szybką) kamerą CCD dla obrazowania GEVI opartych na FRET. W rozdzielaczu obrazu umieść kostkę filtracyjną posiadającą lustro dichroiczne (560 nm) i dwa filtry emisyjne (520 nm/40 i 645 nm/75). Zarepultuje to w dwóch polach widzenia, jedno dla fluorescencji donora, a drugie reprezentujące fluorescencję akceptora. Usuń tę drugą kostkę filtracyjną podczas obrazowania GEVI z pojedynczym białkiem FP.
      Uwaga: GEVI oparte na pojedynczym FP testowane w tej metodzie to Bongwoori, który wykorzystuje białko FP super ecliptic pHluorin A227D (SE A227D). Filtr wzbudzenia (472 nm/30), filtr emisji (497 nm/długoprzepustowy) oraz lustro dichroiczne (495 nm) zostały wybrane na podstawie jego widm wzbudzenia i emisji 5. Generalnie filtry wzbudzenia i emisji powinny mieć największą zgodność z każdym widmem fluoroforu, aby uzyskać jasny obraz, podczas gdy lustro dichroiczne blokuje wszelkie światło wzbudzenia przenikające przez filtr emisji. Dobór filtrów i luster dichroicznych dla rejestracji GEVI opartych na parze FRET 11 opiera się na tej samej zasadzie, z wyjątkiem tego, że wymaga ona drugiej kostki filtracyjnej w rozdzielaczu obrazu do jednoczesnej obserwacji fluorescencji donora i akceptora. Pierwsza kostka filtracyjna umieszczona w bloku filtrów mikroskopu musi posiadać filtr wzbudzenia (475 nm/23) dla Clover. Następnie fluorescencja emitowana przez oba białka FP zostanie przesłana do drugiej kostki filtracyjnej poprzez pierwsze lustro dichroiczne (495 nm). Druga kostka filtracyjna posiada lustro dichroiczne (560 nm) i dwa filtry emisyjne (520 nm/40 dla Clover i 645 nm/75 dla mRuby2) dla każdego białka FP, co pozwala na rozdzielenie fluorescencji z dwóch różnych białek FP.
GEVI oparty na pojedynczym białku fluorescencyjnym (FP)
(Bongwoori)		GEVI oparty na parze FRET
(Nabi 2.42 & Nabi 2.44)
Pierwszy kostnik filtracyjny umieszczony w mikroskopiefiltr wzbudzenia472 nm/30475 nm/23
lustro dichroiczne495 nm495 nm
filtr emisji497 nm/długoprzepustowy-
Drugi kostnik filtracyjny umieszczony w dzielniku wiązkilustro dichroiczne-560 nm
filtr emisji 1-520 nm/40
filtr emisji 2-645 nm/75

Tabela 1. Dwa różne zestawy filtrów użyte do rejestracji sygnałów GEVI opartych na pojedynczym FP oraz GEVI opartych na FRET

  1. Izolacja od wibracji
    1. Nie należy montować żadnego urządzenia z ruchomymi elementami na stole izolującym od wibracji. Należy upewnić się, że kable podłączone do urządzeń nieizolowanych są luźne, aby uniknąć przenoszenia wibracji na próbkę.
  2. Komora do patch clamp
    1. Dno komory do patch clamp należy uszczelnić cienkim szkiełkiem przedmiotowym nr 0, ponieważ odległość robocza obiektywu jest stosunkowo niewielka. Jest to wada konfiguracji mikroskopu odwróconego.
      Uwaga: Ceną za zastosowanie obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (NA) jest zmniejszenie odległości roboczej. Aby umieścić preparat w tak krótkiej odległości roboczej, szkiełko przedmiotowe oraz szkiełko nakrywkowe (krok 2) muszą być jak najcieńsze.
  3. Kontrola temperatury
    1. Należy upewnić się, że roztwór kąpielowy przepływa przez kontroler temperatury, aby utrzymać komórki w technice patch clamp w temperaturze około 33 oC przez cały czas trwania eksperymentu.
  4. Połączenia sprzętowe
    1. Należy podłączyć wzmacniacz do patch clamp oraz mechaniczną migawkę źródła światła do skrzynki sterującej z złączami Bayonet Neill-Concelman (BNC) kamery CCD o wysokiej prędkości. Umożliwi to oprogramowaniu do obrazowania jednoczesne sterowanie wzmacniaczem, kamerą i źródłem światła.
      Uwaga: Komponenty elektryczne i obrazujące muszą być zsynchronizowane, aby zapewnić jednoczesne rejestracje elektryczne i optyczne aktywności elektrycznej.

Układ do rejestracji patch-clamp z kamerami CCD; schemat obrazowania fluorescencyjnego do analizy napięcia.
Rysunek 2. Konfiguracja sprzętowa do obrazowania napięcia z użyciem GEVIs Schemat przepływu wzdłuż drogi światła: (A) lampa ksenonowa 75W, (B) światło wzbudzenia z lampy jest filtrowane przez filtr wzbudzenia, a następnie odbijane przez pierwsze lustro dichroiczne, zanim dotrze do stolika z preparatem; wstawka w prawym górnym rogu przedstawia konfigurację whole-cell, (C) kamera CCD o niskiej prędkości służy do wspomagania zarówno wyboru komórki, jak i patch-clampu, (D) część systemu akwizycji obrazu: (1) kamera CCD o wysokiej prędkości, (2) rozdzielacz obrazu dla par FRET i mono FP GEVIs, (3) reduktor do dopasowania obrazu do układu CCD w kamerze CCD o wysokiej prędkości, (4) dwuportowy adapter kamery do przełączania ścieżki obrazowania oraz (5) kamera CCD o niskiej prędkości i wysokiej rozdzielczości przestrzennej do identyfikacji komórki do patchowania, (E&F) akwizycja obrazu z użyciem GEVI opartego na pojedynczym FP (E) oraz GEVI opartego na FRET (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Ekspresja GEVIs

  1. W komórkach ludzkiej embrionalnej nerki 293
    1. Hodować komórki ludzkiej embrionalnej nerki 293 (HEK 293) w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 oC w inkubatorze CO2 (5% CO2). Użyć naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i wysokości 20 mm. Rozpocząć hodowlę z gęstością 2 x 103 - 6 x 103 komórek/cm2 i inkubować do momentu osiągnięcia 80-90% konfluencji przed kolejnym etapem transfekcji.
    2. W dniu transfekcji odessać pożywkę komórkową i delikatnie wypłukać raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco. Rozproszyć komórki HEK 293 za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA przez 1-2 min, odessać roztwór i delikatnie opukać bok naczynia, aby odczepić komórki. Dodać świeżą pożywkę DMEM (10% FBS) i rozbić skupiska komórek poprzez pipetowanie. Określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
    3. Umieścić szkiełka nakrywkowe o grubości 0,08 - 0,13 mm i średnicy 10 mm, uprzednio pokryte poli-L-lizyną, w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Wysiać komórki HEK 293 na szkiełkach nakrywkowych z gęstością 1 x 105 komórek / cm2.
      Uwaga: Ponieważ komórki HEK 293 są zdolne do tworzenia połączeń szczelinowych między sobą, liczba wysianych komórek musi być dobrana tak, aby uzyskać odizolowane komórki.
    4. Wykonać przejściową transfekcję komórek odpowiednim konstruktem genu kodującym GEVI, używając odczynnika do lipofekcji zgodnie z instrukcją producenta.
      Uwaga: Konstrukty genowe użyte w tym kroku wykorzystywały wektory szkieletowe pcDNA3.1 (Bongwoori) i pUB2.1 (Nabi 2.242). Ilość użytego DNA wynosiła 100 ng na każde szkiełko nakrywkowe; jednak warunki transfekcji muszą zostać określone empirycznie dla każdego testowanego GEVI.
  2. W rozproszonych pierwotnych neuronach hipokampa myszy
    1. Wyizolować hipokampy z myszy C57BL6/N w 17. dniu embrionalnym, a następnie rozproszyć neurony hipokampa zgodnie z wcześniejszym opisem 22,23.
    2. Wysiać rozproszone neurony na pokryte poli-D-lizyną szkiełka nakrywkowe o grubości 0,08-0,13 mm i średnicy 10 mm z gęstością 1 x 105 komórek/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 oC w inkubatorze CO2 (5% CO2).
    3. Wykonać przejściową transfekcję rozproszonych neuronów w 6 - 7 dniu in vitro (DIV) konstruktem genu kodującym GEVI, używając odczynnika do transfekcji fosforanem wapnia zgodnie z wcześniejszym opisem 24.
      Uwaga: Konstrukty genowe użyte w tym kroku wykorzystywały wektory szkieletowe pcDNA3.1 (Bongwoori) i pUB2.1 (Nabi 2.244). Ilość użytego DNA wynosiła 1 µg na każde szkiełko nakrywkowe. Ponownie, warunki transfekcji muszą zostać określone empirycznie dla każdego testowanego GEVI.
  3. Sprawdzenie poziomu ekspresji przed obrazowaniem napięcia
    1. Wyjąć płytkę do hodowli tkankowej z inkubatora CO2 i zaobserwować fluorescencję w transfektowanych komórkach pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
    2. Po potwierdzeniu fluorescencji w błonie, przenieść szkiełko nakrywkowe do komory do patchowania w celu obrazowania napięcia opisanego w sekcji 3.
      Uwaga: Obrazowanie napięcia przeprowadza się 16 - 24 h po transfekcji. Jednak ze względu na to, że różne białka fluorescencyjne mają różny czas dojrzewania, niektóre GEVIs wymagają więcej czasu po transfekcji. Na przykład pary FRET zawierające mRuby2 w tym protokole mogą wymagać dłuższego czasu na ekspresję, ponieważ dojrzewanie mRuby2 trwa znacznie dłużej niż w przypadku Clover11. Należy sprawdzić fluorescencję zarówno donora, jak i akceptora.

3. Protokół obrazowania napięcia

  1. Wybierz zdrową komórkę z dobrą ekspresją błonową
    1. Za pomocą mikroskopii znajdź zdrową komórkę (Rysunek 4B), która wykazuje silną fluorescencję zlokalizowaną w błonie w porównaniu z fluorescencją wewnątrzkomórkową. Unikaj aplikacji patch-clamp do komórek zaokrąglonych. Komórki okrągłe albo się dzielą, albo obumierają i są trudne do zapięcia. W celu ułatwienia późniejszych eksperymentów patch-clamp zastosuj impuls testowy o amplitudzie 5,0 mV i czasie trwania 5,0 msec.
  2. Przygotuj komórkę do obrazowania napięcia
    1. Po wybraniu komórki do zapięcia, umieść pipetę patch-clamp nad komórką. Obniżaj pipetę, aż delikatnie dotknie błony komórkowej. Na tym etapie w oprogramowaniu patch-clamp obserwuj wzrost oporności błony o 1 MΩ - 2 MΩ 25.
      UWAGA: Czasami dobre uszczelnienie gigaomowe (giga-ohm seal) może powstać samym dotknięciem błony komórkowej. Jeśli uszczelnienie gigaomowe jest stabilne, jest to dopuszczalne.
    2. Ustanów uszczelnienie gigaomowe, delikatnie przykładając podciśnienie przez pipetę. Ustaw potencjał pipety na pożądany potencjał podtrzymujący.
    3. Zachowując uszczelnienie gigaomowe, wykonaj obraz komórki za pomocą szybkiej kamery CCD i ustaw ostrość na obszar błony.
    4. Przerwij ciągłość błony komórkowej, stosując impulsy ssania ustami lub strzykawką, delikatnie, aby uzyskać konfigurację whole cell 26.
    5. Wykonaj obrazowanie komórki w konfiguracji whole cell clamp zgodnie z planem eksperymentalnym, używając oprogramowania do obrazowania
      1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Kliknij menu [ACQUIRE] - [SciMeasure Camera], aby otworzyć stronę „CCD ACQUIRE”.
      2. Utwórz nowy plik danych w celu zapisu obrazów.
      3. Kliknij [ANALOGUE OUTPUT], a następnie [Read an ASCII], aby otworzyć plik protokołu impulsów do przeprowadzenia obrazowania. Kliknij „Average the internal repetitions”, jeśli dane wymagają uśrednienia. Następnie zamknij stronę „ANALOGUE OUTPUT”.
        Uwaga: Ten protokół impulsów musi zostać zaprojektowany i zapisany jako plik „.txt” zgodnie z celem każdego eksperymentu przed wykonaniem tego kroku.
      4. Ustaw specyficzne parametry akwizycji na stronie „CCD ACQUIRE”. Wprowadź konkretne wartości dla „Number of frames for acquisition” oraz „Number of trials”.
        Uwaga: Liczba klatek jest określona przez prędkość akwizycji i czas trwania protokołu impulsów. Na przykład, przy obrazowaniu z częstotliwością 1 kHz, 1000 klatek odpowiada 1 sec czasu rejestracji.
      5. Kliknij przycisk [TAKE DATA (Optics + BNC)], aby rozpocząć rejestrację. Podczas obrazowania napięcia obserwuj okno oscyloskopu w oprogramowaniu patch-clamp, aby zapewnić stabilną konfigurację whole cell przez cały czas rejestracji.
        Uwaga: Aby przetestować zakres odpowiedzi napięciowej GEVI, wielkość sygnału w wartości ΔF/F lub rozdzielczość czasową w całym fizjologicznym zakresie napięć, przeprowadź eksperyment voltage clamp w konfiguracji whole cell z protokołem impulsów zawierającym skokowe impulsy napięciowe w zakresie od -170 mV do 130 mV. Aby określić wydajność GEVI w rozdzielczości potencjałów czynnościowych wywołanych w hodowanych pierwotnych neuronach, wykonaj obrazowanie komórki w konfiguracji current clamp whole cell.

4. Pozyskiwanie danych

  1. Obliczanie ΔF/F
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Kliknij [FILE] - [Read Data File], aby otworzyć plik danych do analizy. Przejrzyj obraz komórki w jej spoczynkowym natężeniu światła (RLI) po prawej stronie
      Uwaga: Oprogramowanie uśrednia pierwsze 5 klatek, aby określić RLI dla rejestracji.
    2. Kliknij „Show BNCs”, aby wyświetlić na ekranie zmierzone wartości prądu i napięcia.
    3. Zmień tryb strony z „RLI frame” na „Frame subtraction”, aby wykorzystać funkcję odejmowania klatek do zidentyfikowania pikseli z responsywnymi sygnałami optycznymi. Jest to główna zaleta obrazowania, ponieważ każdy piksel może zostać zbadany pod kątem potencjalnych zmian fluorescencji.
    4. Wybierz dwa punkty czasowe (F0 i F1) do odejmowania. Zidentyfikuj obszar komórki, który wykazuje sygnały reagujące na zmianę potencjału błony.
      Uwaga: Stosunek sygnału do szumu (SNR) dla obrazów powstałych przez odejmowanie klatek może zostać poprawiony poprzez wybranie wielu klatek dla każdego punktu czasowego w celu czasowego uśrednienia sygnału. Oprogramowanie odejmuje średnie natężenie światła pobrane z wybranych klatek i oblicza wartości F1-F0 (ΔF). Zazwyczaj wybiera się punkt czasowy uzyskany przy potencjale podtrzymującym oraz inny punkt czasowy z okresu stymulacji.
    5. Wskaż piksele wymagające analizy, przeciągając kursor lub klikając każdy piksel myszką. Obserwuj graficzną reprezentację średniej intensywności fluorescencji z wybranych pikseli po lewej stronie okna oprogramowania. Rysunki 4B i 5B przedstawiają reprezentatywne obrazy z analizy odejmowania klatek.
    6. Podziel wartości z odjętych pikseli przez RLI (F0). Kliknij [Divide by RLIs], aby uzyskać wartości ΔF/F
  2. Eksport danych
    1. Oblicz wartości ΔF/F dla każdego stopnia napięcia, aby dalej analizować właściwości czułości GEVI na napięcie. Wykorzystaj te wartości do sporządzenia wykresów, takich jak ΔF/F w funkcji napięcia, do późniejszej analizy danych.
    2. Usuń wykresy prądu i napięcia, odznaczając opcję w menu „Show BNCs”. Przejdź do [OUTPUT] -[Save Traces As Displayed (ASCII)], aby wyeksportować zapis fluorescencji w formacie pliku ASCII do analizy dopasowania krzywych za pomocą standardowego oprogramowania do tworzenia wykresów.

5. Analiza danych

  1. Właściwości detekcji napięcia GEVI
    1. Narysuj wykres zmian fluorescencji w funkcji napięcia (F-V), nanosząc wartości ΔF/F względem napięcia w programie do analizy danych. Dopasuj krzywą do funkcji Boltzmanna (Tabela 2), aby określić zakres napięcia sygnału optycznego, klikając [Analysis] - [Fitting] - [Sigmoidal fit] - [Open dialog], a następnie wybierając funkcję Boltzmanna.
      Uwaga: Dopasowanie do funkcji umożliwia charakterystykę właściwości detekcji napięcia różnych sond napięciowych lub porównanie ich wydajności w różnych komórkach. Funkcję Boltzmanna można zastosować dla sond testowanych w niniejszej pracy, ponieważ krzywe F-V dla tych sond wykazują charakter sygmoidalny.
    2. Znormalizuj każdą wartość ΔF/F, korzystając z wartości początkowej i końcowej (A1 oraz A2) obliczonych przez funkcję.
      Uwaga: W równaniu Boltzmanna minimum to A1, a maksimum to A2. Do normalizacji użyj arkusza kalkulacyjnego, aby dostosować wartości ΔF/F, definiując A1 jako zero, a A2 jako jeden. Oblicz średnią z znormalizowanych wartości ΔF/F oraz błąd standardowy do analizy statystycznej.
    3. Ponownie narysuj znormalizowane wartości ΔF/F w funkcji napięcia, zgodnie z opisem w sekcji 5.1.1).
  2. Szybkość odpowiedzi optycznej
    1. Otwórz plik ASCII uzyskany w kroku 4.2.2) w programie do analizy danych i narysuj przebieg ΔF/F w funkcji czasu.
    2. Kliknij „Data selector” w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz jeden punkt czasowy odpowiadający początkowi skokowego impulsu napięcia oraz drugi punkt czasowy, w którym sygnał optyczny osiągnął stan stacjonarny. Dopasuj ten zakres zarówno do pojedynczej, jak i podwójnej funkcji wykładniczego zaniku, klikając [Analysis] - [Fitting] - [Exponential fit] - [Open dialog], a następnie wybierz funkcję wykładniczego zaniku. Podaj wynik lepszego dopasowania.
      Uwaga: Poprzez dopasowanie do funkcji pojedynczego lub podwójnego wykładniczego zaniku można uzyskać ilościowe stałe czasowe reprezentowane przez τ. Pomoże to badaczom porównać kinetykę pomiarów wykonanych za pomocą różnych wskaźników napięcia. Przebieg fluorescencji może wykazywać komponenty szybkie i wolne, które można opisać funkcją podwójnego wykładniczego zaniku. W takim przypadku obliczenia dadzą dwie stałe czasowe o różnych amplitudach.
    3. Oblicz ważone stałe τ, aby porównać kinetykę sond wykazujących dwie komponenty czasowe z sondami o pojedynczej komponencie.
      Uwaga: Ważone tau oblicza się jako sumę τ1 pomnożonej przez amplitudę względną A1 oraz τ2 pomnożonej przez amplitudę względną A2, zgodnie z następującym wzorem;Równanie średniego ważonego czasu życia, wzór w eksperymencie fotonicznym, analiza przejściowego pochłaniania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki poddane transfekcji przejściowej mogą wykazywać znaczne zróżnicowanie w intensywności fluorescencji oraz stopniu ekspresji w błonie plazmatycznej. Nawet na tym samym szkiełku przedmiotowym niektóre komórki będą miały różny poziom fluorescencji wewnętrznej. Wynika to najprawdopodobniej z ilości czynnika transfekcyjnego wchłoniętego przez komórkę. Sporadycznie zbyt silna ekspresja powoduje wystąpienie w komórce odpowiedzi na nieprawidłowo sfałdowane białka (unfolded protein response...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Układ nerwowy wykorzystuje napięcie na kilka różnych sposobów, hamowanie powoduje lekką hiperpolaryzację, wejście synaptyczne powoduje lekką depolaryzację, a potencjał czynnościowy powoduje stosunkowo dużą zmianę napięcia. Możliwość pomiaru zmian potencjału błonowego przez GEVI oferuje obiecujący potencjał jednoczesnej analizy kilku składników obwodów neuronalnych. W niniejszym raporcie przedstawiono podstawową metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą GEVI.

Głównym kluczem do ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez program World Class Institute (WCI) Narodowej Fundacji Badawczej Korei, finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii Korei Grant WCI 2009-003 oraz Koreański Instytut Nauki i Technologii Institutional Program Project 2E24210. Sungmoo Lee był wspierany przez Global Ph.D. Fellowship Program (NRF-2013H1A2A1033344) Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) przy Ministerstwie Edukacji (MOE, Korea).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop odwróconyObiektyw OlympusIX71
60X (apertura numeryczna = 1,35)OlympusUPLSAPO 60XO
Filtr wzbudzeniaSemrock  FF02-472/30Do obrazowania napięciowego super ekliptycznej pHluorin w Bongwoori
Lustro dichroiczneSemrockFF495-Di03-25x36
Filtr emisyjnySemrockFF01-497/LP
75W Xenon arcCAIRNOptoSource IlluminatorDiody LED i lasery są również skutecznymi źródłami światła
Wolnoobrotowa kamera CCDHitachiKP-D20BU
Dwuportowy adapter kameryOlympusU-DPCAD
Szybka kamera CCDRedShirtImaging, LLCNeuroCCD-SM
Rozdzielacz obrazuCAIRNOptosplit 2
Filtr wzbudzeniaSemrockFF01-475/23-25Do obrazowania napięciowego GEVI opartego na parze FRET składającego się z Clover i mRuby2)
Lustro dichroiczneSemrockFF495-Di03-25x36
Filtr emisyjnyChromaET520/40
Lustro dichroiczneSemrockFF560-FDi01-25X36
Filtr spalinowyChromaET645/75
System tłumienia drgańSystemy kinetyczne250BM-IC, 5702E-3036-31
Komora krosowaniaPrzyrządy WarnerRC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)Mikroskopia elektronowa Sciences72198-20
Regulator temperaturyWarner instrumentsTC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - szkło nakrywkowe o średnicy 10 mmTed Pella260366
Środek lipofekcyjnyLife Technologies11668-027
Odczynnik fosforanu wapniaClontech - Takara631312
Wzmacniacz zaciskowyHEKAEPC 10 Wzmacniacz
Wielokanałowe oprogramowanie do akwizycji danychHEKAPatchmaster
Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazówRedShirtImagingNeuroplex
Arkusz kalkulacyjny OprogramowanieMicrosoft Excel 2010
Oprogramowaniedo analizy danychLupa OriginLabOriginPro 8.6.0
Qioptiq LINOSOptem standardowy łącznik do aparatu 0,38x SC38 J zacisk
Mikroskop konfokalnyNikonNikon A1R
Odczynnik zapobiegający blaknięciuLife TechnologiesP36930
lamp USB Microsoft

Bibliografia

  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012(2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440(2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585(2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894(2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674(2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625(2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514(2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

genetycznie kodowane wskaźniki napięciaGEVI oparte na FRETpojedyncze białko fluorescencyjnerozdzielacz obrazupatch-clamp całej komórkikomórki HEK293obrazowanie potencjału błonowegoanaliza zmian fluorescencjiakwizycja obrazu kamerą CCD
Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.