Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53572

⸱

19 stycznia 2016

 ,  , 
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

W tym artykule

Podsumowanie

Aby uzyskać podstawowe informacje na temat sorpcji i recyklingu złota z układów wodnych, zbadano oddziaływanie nanocząstek Au(III) i Au(0) na białka warstwy S. Absorpcję polimerów białkowych badano za pomocą ICP-MS, a monowarstw białkowych za pomocą QCM-D. Późniejsze AFM umożliwia obrazowanie nanostruktur.

Streszczenie

W tej publikacji opisano zachowanie sorpcji złota białek warstwy powierzchniowej (warstwy S) (Slp1) Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Te biomolekuły układają się w parakrystaliczne dwuwymiarowe układy na powierzchniach, wiążą metale, a zatem są interesujące dla kilku zastosowań biotechnicznych, takich jak materiały biosorpcyjne do usuwania lub odzyskiwania różnych pierwiastków ze środowiska i procesów przemysłowych. Osadzanie nanocząstek Au(0) na warstwach S, zarówno poprzez syntezę ukierunkowaną warstwy S1, jak i adsorpcję nanocząstek, otwiera nowe możliwości dla różnorodnych zastosowań sensorycznych. Chociaż liczne badania opisały właściwości biosorpcyjne warstw S 2-5, głębsze zrozumienie interakcji białko-białko i białko-metal nadal pozostaje wyzwaniem. W poniższym badaniu zastosowano spektrometrię mas sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) do wykrywania sorpcji metali przez zawieszone warstwy S. Zostało to skorelowane z pomiarami mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem rozpraszania (QCM-D), która umożliwia wykrywanie online tworzenia się monowarstw białkowych i osadzania metali, a tym samym bardziej szczegółowe zrozumienie wiązania metali.

Wyniki ICP-MS wskazują, że wiązanie Au(III) z zawieszonymi polimerami warstwy S jest zależne od pH. Maksymalne wiązanie Au(III) uzyskano przy pH 4,0. Badania QCM-D umożliwiły wykrycie sorpcji Au(III), a także osadzanie Au(0)-NPs w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów in situ. Co więcej, metoda ta pozwoliła na zbadanie wpływu wiązania metali na stabilność sieci białkowej Slp1. Właściwości strukturalne i stabilność warstwy białkowej można było zobrazować bezpośrednio po eksperymencie QCM-D przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM). Podsumowując, połączenie tych różnych metod zapewnia głębsze zrozumienie wiązania metali przez bakteryjne białka warstwy S w zawiesinie lub w postaci monowarstw na komórkach bakteryjnych lub zrekrystalizowanych powierzchniach.

Wprowadzenie

Ze względu na rosnące wykorzystanie złota do wielu zastosowań, takich jak elektronika, katalizatory, biosensory czy instrumenty medyczne, popyt na ten cenny metal wzrósł w ciągu ostatnich kilku lat o 6-9. Złoto, podobnie jak wiele innych metali szlachetnych i ciężkich, jest uwalniane do środowiska poprzez ścieki przemysłowe w rozcieńczonych stężeniach, poprzez działalność wydobywczą i utylizację odpadów 7,8,10, chociaż większość zanieczyszczeń środowiska metalami ciężkimi lub szlachetnymi jest procesem ciągłym, spowodowanym głównie działalnością technologiczną. Prowadzi to do znacznej ingerencji w naturalne ekosystemy i może potencjalnie zagrozić zdrowiu ludzi 9 . Wiedza o tych negatywnych skutkach sprzyja poszukiwaniu nowych technik usuwania metali z zanieczyszczonych ekosystemów i poprawie recyklingu metali ze ścieków przemysłowych. Dobrze znane metody fizykochemiczne, takie jak wytrącanie lub wymiana jonowa, nie są tak skuteczne, zwłaszcza w mocno rozcieńczonych roztworach 7,8,11. Biosorpcja, zarówno z żywą, jak i martwą biomasą, jest atrakcyjną alternatywą dla oczyszczania ścieków 10,12. Stosowanie takich materiałów biologicznych może zmniejszyć zużycie toksycznych chemikaliów. Opisano wiele mikroorganizmów, które gromadzą lub unieruchamiają metale. Na przykład komórki Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 wykazały wysoką zdolność wiązania metali szlachetnych, np. Pd(II), Pt(II), Au(III) i innych metali toksycznych, takich jak Pb(II) lub U(VI) 4,13, komórki Bacillus megaterium dla Cr(VI) 14, komórki Saccharomyces cerevisiae dla Pt(II) i Pd(II) 15 oraz Chlorella vulgar dla Au(III) i U(VI) 16,17. Wiązanie poprzednich metali, takich jak Au(III), Pd(II) i Pt(II) zostało również zgłoszone dla Desulfovibrio desulfuricans18 i dla L. sphaericus JG-B53 19,20. Niemniej jednak nie wszystkie drobnoustroje wiążą duże ilości metali, a ich zastosowanie jako materiału sorpcyjnego jest ograniczone 12,21. Ponadto zdolność wiązania metali zależy od różnych parametrów, np. składu komórki, zastosowanego biokomponentu, czy warunków środowiskowych i doświadczalnych (pH, siła jonowa, temperatura itp.). Badanie izolowanych fragmentów ściany komórkowej 22,23, takich jak lipidy błonowe, peptydoglikan, białka lub inne składniki, pomaga zrozumieć procesy wiązania metali w złożonych zbudowanych całych komórkach 8,21.

Komponenty komórkowe, na których skupiono się w tym badaniu, to białka warstwy S. Białka warstwy S są częścią zewnętrznej otoczki komórkowej wielu bakterii i archeonów i stanowią około 15 - 20% całkowitej masy białkowej tych organizmów. Jako pierwszy interfejs ze środowiskiem, te związki komórkowe silnie wpływają na właściwości sorpcyjne bakterii 3. Białka warstwy S o masie cząsteczkowej od czterdziestu do setek kDa są wytwarzane w komórce, ale są składane na zewnątrz, gdzie są w stanie tworzyć warstwy na błonach lipidowych lub polimerowych składnikach ściany komórkowej. Po wyizolowaniu prawie wszystkie białka warstwy S mają wewnętrzną właściwość spontanicznego samoorganizowania się w zawiesinie, na granicy faz lub na powierzchniach tworzących płaskie lub rurkowate struktury 3. Grubość monowarstwy białkowej zależy od bakterii i mieści się w zakresie 5 - 25 nm 24. Ogólnie rzecz biorąc, utworzone struktury białkowe warstwy S mogą mieć symetrię ukośną (p1 lub p2), kwadratową (p4) lub sześciokątną (p3 lub p6) ze stałymi sieci od 2,5 do 35 nm 3,24. Tworzenie sieci wydaje się być w wielu przypadkach zależne od kationów dwuwartościowych, a głównie od Ca2 + 25,26, Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)). Niemniej jednak pełna kaskada reakcji fałdowania monomeru, oddziaływania monomer-monomer, tworzenia sieci oraz rola różnych metali, zwłaszcza kationów dwuwartościowych, takich jak Ca2+ i Mg2+, nadal nie są w pełni poznane.

Gram-dodatni szczep L. sphaericus JG-B53 (przemianowany z Bacillus sphaericus po nowej klasyfikacji filogenetycznej) 27 został wyizolowany ze składowiska odpadów wydobywczych uranu "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saksonia, Niemcy) 4,28,29. Jego funkcjonalne białko warstwy S (Slp1) ma kwadratową siatkę, masę cząsteczkową 116 kDa 30 i grubość ≈ 10 nm na żywych komórkach bakteryjnych 31. W poprzednich badaniach tworzenie in vitro zamkniętej i stabilnej warstwy białkowej o grubości około 10 nm osiągnięto w czasie krótszym niż 10 minut19. Pokrewny szczep L. sphaericus JG-A12, również izolat ze stosu "Haberland", ma wysoką zdolność wiązania metali, a jego izolowane białko warstwy S wykazało wysoką stabilność chemiczną i mechaniczną oraz dobre wskaźniki sorpcji dla metali szlachetnych, takich jak Au(III), Pt(II) i Pd(II) 4,32,33. To wiązanie metali szlachetnych jest mniej lub bardziej specyficzne dla niektórych metali i zależy od dostępności grup funkcyjnych na zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni białka polimeru oraz w jego porach, sile jonowej i wartości pH. Istotnymi grupami funkcyjnymi dla interakcji białek z metalami są COOH-, NH2-, OH-, PO4-, SO4- i SO-. Zasadniczo, zdolności wiązania metali otwierają szerokie spektrum zastosowań,Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)).np. jako składniki biosorpcyjne do usuwania lub odzyskiwania rozpuszczonych metali toksycznych lub cennych, matryce do syntezy lub określonego osadzania nanocząstek metalicznych (NP) o regularnej strukturze do katalizy oraz inne materiały bioinżynieryjne, takie jak warstwy biosensoryczne 3,5,18,33. Regularnie rozmieszczone macierze NP, takie jak Au(0)-NPs, mogą być wykorzystywane do głównych zastosowań, takich jak elektronika molekularna i biosensory, urządzenia do przechowywania o ultrawysokiej gęstości i katalizatory do CO-oksydacji 34-37. Rozwój takich zastosowań i inteligentne projektowanie tych materiałów wymaga głębszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wiązania metali.

Warunkiem wstępnym dla rozwoju takich materiałów pochodzenia biologicznego jest niezawodna implementacja warstwy interfejsu między biomolekułą a powierzchnią techniczną 38,39. Na przykład polielektrolity zestawione techniką warstwa po warstwie (LbL) 40,41 zostały wykorzystane jako warstwa graniczna do rekrystalizacji białek warstwy S 39. Taki interfejs oferuje stosunkowo łatwy sposób na wykonanie powłoki białkowej w sposób powtarzalny i ilościowy. Przeprowadzając różne eksperymenty z modyfikacją i bez modyfikacji promotorów adhezyjnych, możliwe jest sformułowanie stwierdzeń dotyczących kinetyki powłoki, stabilności warstwy i interakcji metali z biomolekułami 19,42,Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)). Jednak złożony mechanizm adsorpcji białek i interakcji białko-powierzchnia nie jest w pełni zrozumiały. W szczególności nadal brakuje informacji na temat konformacji, orientacji wzoru i gęstości powłoki.

Technika mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D) przyciągnęła uwagę w ostatnich latach jako narzędzie do badania adsorpcji białek, kinetyki powlekania i procesów interakcji w skali nanometrowej 19,43-45. Technika ta pozwala na szczegółowe wykrywanie adsorpcji masy w czasie rzeczywistym i może być stosowana jako wskaźnik procesu samoorganizacji białek i sprzężenia funkcjonalnych cząsteczek na sieciach białkowych 19,20,42,46-48. Ponadto pomiary QCM-D otwierają możliwość badania procesów interakcji metali z warstwą białkową w naturalnych warunkach biologicznych. W niedawnym badaniu badano interakcję białka warstwy S z wybranymi metalami, takimi jak Eu(III), Au(III), Pd(II) i Pt(II) i Pt(II) za pomocą QCM-D 19,20. Zaadsorbowana warstwa białkowa może służyć jako uproszczony model ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich. Badania nad tym pojedynczym składnikiem mogą przyczynić się do głębszego zrozumienia interakcji metali. Jednak wyłącznie eksperymenty z QCM-D nie pozwalają na stwierdzenie struktury powierzchniowej i wpływu metali na białko. Do uzyskania takich informacji niezbędne są inne techniki. Jedną z możliwości obrazowania bio-nanostruktur i uzyskania informacji o właściwościach strukturalnych jest mikroskopia sił atomowych (AFM).

Celem prezentowanego badania było zbadanie sorpcji złota (Au(III) i Au(0)-NPs) do białek warstwy S, w szczególności Slp1 L. sphaericus JG-B53. Eksperymenty przeprowadzono z zawieszonymi białkami w skali partii w zakresie pH 2,0 - 5,0 przy użyciu ICP-MS oraz z unieruchomionymi warstwami S przy użyciu QCM-D. Dodatkowo zbadano wpływ roztworu soli metalu na stabilność sieci w kolejnych badaniach AFM. Połączenie tych technik przyczynia się do lepszego zrozumienia procesów interakcji metali in vitro jako narzędzia pozwalającego dowiedzieć się więcej o zdarzeniach wiązania całych komórek bakteryjnych w odniesieniu do określonych powinowactw do metali. Wiedza ta ma kluczowe znaczenie nie tylko dla opracowania odpowiednich materiałów filtracyjnych do odzysku metali w celu ochrony środowiska i zachowania zasobów 49, ale także dla opracowania matryc wysoce uporządkowanych metalicznych nanocząsteczek do różnych zastosowań technicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mikroorganizmy i warunki hodowli

Uwaga: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w warunkach sterylnych. L. sphaericus JG-B53 uzyskano z kultury krio-zachowanej 29,30.

  1. Przenieść mrożoną kulturę (1,5 ml) w komorze z laminarnym przepływem powietrza do 300 ml sterylnej pożywki nutrient broth (NB) (3 g/L ekstraktu mięsnego, 5 g/L peptonu, 10 g/L NaCl). Następnie mieszać roztwór przez co najmniej 6 h w temperaturze 30 °C w celu uzyskania przedkultury do hodowli.
  2. Hodować bakterie w warunkach tlenowych w pożywce NB o pH = 7,0, 30 °C w bioreaktorze o pojemności 70 l z systemem sterylizacji w miejscu (steam-in-place). Należy zatem napełnić reaktor ≈ 57 l wody dejonizowanej. Dodać i rozpuścić stałe podłoże NB bezpośrednio w bioreaktorze (stężenia patrz wyżej).
    1. Dodatkowo należy dodać środek odpieniający (30 µl/L NB-media) do pożywki, aby zapobiec tworzeniu się piany podczas hodowli, a następnie poddać autoklawowaniu (122 °C, czas utrzymania temperatury 30 min) pożywki wewnątrz urządzenia reaktora.
  3. Ochłodzić medium i przeprowadzić pełne nasycenie tlenem. Dostosować pH do wartości 7,0 (używając 1 M H2SO4 i 2 M NaOH) i rozpocząć automatyczną inokulację 300 ml prekultury. W punkcie inokulacji rozpocząć rejestrację danych dotyczących parametrów hodowli. Zarejestrować online parametry np. poziom tlenu rozpuszczonego (dO2), dodawanie kwasu i zasady oraz wartości pH w trakcie hodowli.
    1. Monitorowanie wzrostu bakterii online za pomocą nieinwazyjnych pomiarów mętności.
  4. Należy przeprowadzić dodatkowe pobieranie próbek po każdej godzinie hodowli i wyznaczyć kolejne parametry, takie jak sucha masa biomasy (BDW) oraz offline gęstość optyczną (OD). Należy zatem pobrać 20 ml pożywki hodowlanej w każdym punkcie próbkowania w warunkach sterylnych.
    1. Wyznacz offline OD za pomocą pomiarów fotometrycznych absorbancji przy 600 nm. Jako próbę ślepą zastosuj sterylnie filtrowane podłoże NB. Po osiągnięciu absorbancji >0.4 rozcieńczyć zawiesinę komórkową zgodnie z liniowością prawa Lamberta-Beera.
    2. W celu oznaczenia BDW odwiruj 1 do 5 ml zawiesiny bakteryjnej (w zależności od gęstości komórek) przy 5 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wysusz otrzymany osad komórkowy przy 105 °C w suszarce do uzyskania stałej masy, a następnie zmierzyć masę granulatu.
  5. Wykonaj zdjęcia mikroskopowe za pomocą optycznego mikroskopu badawczego z kontrastem fazowym przy powiększeniu 400- i 1000-krotnym (odpowiednio z kondensorem kontrastu fazowego 2 i 3), aby sprawdzić wzrost bakterii oraz w ramach kontroli zanieczyszczeń krzyżowych.
  6. Po osiągnięciu fazy wzrostu wykładniczego, wykrytej za pomocą online dO2 i online mętność, zebrać biomasę za pomocą wirowania przepływowego przy 15 000 x g, 4 °C i dwukrotnie przemyć biomasę standardowym buforem (50 mM TRIS, 10 mM MgCl2)2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Uwaga: Otrzymany pellet biomasy można przechowywać w temperaturze -18 °C do czasu dalszego wykorzystania do izolacji.

2. Izolacja i oczyszczanie białek warstwy S

Uwaga: Polimery Slp1 należy oczyścić zgodnie z dostosowaną metodą opisaną wcześniej2,19,30,32,50,51.

  1. Uhomogenizować wypłukaną i rozmrożoną surową biomasę uzyskaną z hodowli w buforze standardowym (1:1 (w/v)), aby usunąć wici, używając dyspergera (poziom 3, 10 min) w kąpieli lodowej w temperaturze 4 °C.
  2. Odwirować zawiesinę (8,000 x g, 4 °C przez 20 min) i dwukrotnie przemyć otrzymany pellet buforem standardowym (1:1 (w/v)). Po przemyciu i wirowaniu (8,000 x g, 4 °C przez 20 min) resuspendować pellet w buforze standardowym (1:1 (w/v)), dodać do zawiesiny DNazę II i RNazę (0,4 jednostki/g biomasy) i rozbić komórki przy ciśnieniu 1,000 bar za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego. Następnie odwirować zawiesinę przy 27,500 x g, 4 °C przez 1 h.
    Uwaga: Kontrolować zawiesinę komórkową za pomocą mikroskopu badawczego. Rozbicie jest zakończone, gdy w polu widzenia mikroskopu przy 400-krotnym powiększeniu widocznych jest mniej niż 2-3 nienaruszone komórki.
  3. Dwukrotnie przemyć pellet buforem standardowym (1:1 (w/v)) i ponownie przeprowadzić wirowanie. Następnie resuspendować pellet w buforze standardowym (2:1 (w/v)) zmieszanym z 1% Triton X-100 i inkubować przez 20 min przy ciągłym wstrząsaniu (100 rpm) w celu solubilizacji złogów lipidowych.
  4. Odwirować roztwór (27,500 x g, 4 °C przez 1 h) i trzykrotnie przemyć otrzymany pellet buforem standardowym (1:1 (w/v)).
  5. Pellet uzyskany po dodatkowym wirowaniu (27,500 x g, 4 °C przez 1 h) inkubować przez 6 h w buforze standardowym (1:1 (w/v)) zmieszanym z 0,2 g/L lizozymu, aby zhydrolizować wiązania w peptydoglikanie 50. Dodatkowo dodać do zawiesiny DNazę II i RNazę (po 0,4 jednostki/g biomasy).
  6. Po wirowaniu (45,500 x g, 4 °C, 1 h) resuspendować górną białą fazę białkową niewielką objętością nadosadu z wirowania (<30 ml) zawierającego podjednostki białkowe.
  7. Zsolubilizować białą zawiesinę, mieszając ją w stosunku 1:1 z 6 M chlorkiem guanidyny (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). Roztwór staje się klarowny.
  8. Przeprowadzić filtrację sterylną (0,2 µm) roztworu traktowanego GuHCl, a następnie dodatkowe wirowanie z dużą prędkością (45,500 x g, 4 °C przez 1 h).
  9. Przenieść nadosad do probówek z membraną dializacyjną (MWCO 50,000 Dalton) i dializować przeciwko buforowi rekrystalizacyjnemu (1,5 mM TRIS, 10 mM CaCl2, pH = 8,0) przez 48 h.
  10. Przenieść biały roztwór rekrystalizowanego polimeru białkowego do probówek i odwirować przy 45,500 x g, 4 °C przez 1 h. Resuspendować pellet w niewielkiej objętości wody ultrapure (<30 ml).
  11. Następnie przenieść zawiesinę do probówek z membraną dializacyjną i przeprowadzić dializę przeciwko wodzie ultrapure przez 24 h w celu usunięcia zawartości buforu.
    Uwaga: Niezbędna jest kilkukrotna wymiana buforu lub wody ultrapure podczas dializy.
  12. Liofilizować oczyszczone Slp1 w liofilizatorze.

3. Charakterystyka i ilościowe oznaczenie Slp1 do eksperymentów

Uwaga: Stężenie Slp1 dla eksperymentów sorpcyjnych i powlekania określono za pomocą spektrofotometrii UV-VIS.

  1. Nanieś pipetą 2 µl rozpuszczonej próbki Slp1 bezpośrednio na dolny piedestał pomiarowy fotometru. Wyznacz stężenie białka przy maksimum adsorpcji przy długości fali 280 nm, charakterystycznej dla białek. Do wyznaczenia stężenia Slp1 przyjmij współczynnik ekstynkcji 0,61. Do pomiarów referencyjnych wykorzystaj roztwór wolnego Slp1.
  2. Rozcieńcz białko buforem (do eksperymentów sorpcyjnych w trybie okresowym użyj 0,9% NaCl, pH = 6,0, a do eksperymentów QCM-D buforu do rekrystalizacji, pH = 8,0) do pożądanego stężenia dla eksperymentów (odpowiednio 1 g/L i 0,2 g/L).
  3. Przeanalizuj jakość i masę cząsteczkową Slp1 standardową bioanalityczną metodą elektroforezy żelowej w polu elektrycznym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) opisaną przez Laemmliego, U. K. 52.
    1. Wykonaj SDS-PAGE przed użyciem Slp1 w eksperymentach oraz np. po inkubacji z Au(0)-NP, wykorzystując 10% rozdzielcze żele poliakrylamidowe.
    2. W celu przygotowania próbek do SDS zmieszaj ≈10 µl próbki hodowli lub białka z buforem do próbek (1,97 g TRIS, 5 mg błękitu bromofenolowego, 5,8 ml glicerolu, 1 g SDS, 2,5 ml β-merkaptoetanolu, uzupełnić wodą ultrapure do 50 ml) w stosunku 1:1 (v/v), a po 4 min inkubacji w temperaturze 95 °C nanieś mieszaninę pipetą do kieszeni żelu.
    3. Prowadź elektroforezę SDS-PAGE przez 30 min przy napięciu 60 V, aż próbki przejdą przez żel ładujący, a następnie zmień napięcie na 120 V po przejściu przez żel rozdzielczy.
    4. Wyjmij żele z systemu elektroforetycznego, wypłucz wodą ultrapure i umieść na 1 h w roztworze utrwalającym (10% kwasu octowego, 50% etanolu absolutnego). Następnie wypłucz żele wodą ultrapure.
    5. Zbarw żele, stosując zmodyfikowaną niespecyficzną metodę koloidalnego Coomassie brilliant blue 53,54. Po odbarwieniu72,73 wykonaj zdjęcia SDS-PAGE za pomocą systemu dokumentacji żeli zgodnie z protokołem producenta.

4. Eksperymenty sorpcyjne w trybie okresowym i oznaczanie ilości metali

  1. Do eksperymentów sorpcyjnych w trybie okresowym przygotować roztwór zapasowy Au(III) z HAuCl4 ∙ 3 H2O, rozcieńczyć sól metalu i zmieszać ją z roztworem Slp1/ NaCl do początkowego stężenia metalu 1 mM i końcowego stężenia Slp1 wynoszącego 1 g/L. Eksperymenty przeprowadzić w trzech powtórzeniach, z dodatkową kontrolą negatywną bez Slp1. Do doświadczeń sorpcyjnych zastosować całkowitą objętość 5 ml.
  2. Suspensję wstrząsać w sposób ciągły w temperaturze pokojowej (RT) przy różnych, uprzednio ustawionych wartościach pH w zakresie od 2,0 do 5,0 przez 24 h (pH regulować za pomocą rozcieńczonych roztworów HCl i NaOH).
  3. Po sorpcji próbki odwirować przy 15 000 x g, 4 °C przez 20 min, aby oddzielić Slp1 od supernatantu.
  4. Supernatant przenieść do probówek do ultrafiltracji (MWCO 50 000 Da) i odwirować przy 15 000 x g, 4 °C przez 20 min, aby usunąć rozpuszczone monomery białek.
  5. Stężenie metalu w otrzymanym filtracie oznaczyć metodą ICP-MS 19,20 i wykorzystać wyniki do obliczenia ilości metalu zaabsorbowanego przez suchą masę Slp1. Zasady pomiaru, możliwości metody oraz komponenty zastosowanego urządzenia ICP-MS zostały opisane w literaturze 55.
    1. Próbki i wzorce do pomiarów ICP-MS przygotować, stosując 1% HNO3 jako matrycę oraz rod jako standard wewnętrzny (1 mg/ml).

5. Synteza Au-NP i oznaczenie wielkości cząstek

Uwaga: Stabilizowane cytrynianem nanocząstki złota Au(0)-NP zsyntetyzowano zgodnie z dostosowaną metodą opisaną wcześniej przez Mühlpfordt, H. i wsp. (1982), aby uzyskać cząstki sferyczne o średnicy 10 - 15 nm 56,57.

  1. Przygotuj stabilizowany roztwór $\text{HAuCl}_4$ o stężeniu 25 mM4 ∙ 3 H2roztwór stokowy do formowania NP.
  2. Rozcieńczyć 250 µl tego roztworu zapasowego w 19,75 ml wody ultrapure i inkubować je w 61 °C przez 15 min przy ciągłym wstrząsaniu.
  3. Przygotuj 5 ml drugiego roztworu zapasowego (12 mM kwasu taninowego, 7 mM cytrynianu sodu dwuwodnego, 0,05 mM K2CO3) i inkubować 2nd roztwór oddzielnie w 61 °C przez 15 min.
  4. Przy stałym mieszaniu dodać 2nd roztwór zapasowy do roztworu jednego. Mieszać mieszaninę reakcyjną przez co najmniej 10 min w temperaturze 61 °CNastępnie schłodzić roztwór i wykorzystać go do powlekania nanocząstek (NP) na sieci Slp1 w ramach eksperymentów QCM-D.
    Uwaga: Otrzymane Au(0)-NP scharakteryzowano za pomocą spektroskopii UV-VIS przy maksymalnej absorbancji 520 nm, która jest zazwyczaj stosowana do wykrywania powstałych Au(0)-NP. 58Roztwór można przechowywać w 4 °C.
  5. Przeanalizuj rozmiar powstałych nanocząstek złota Au(0)-NP za pomocą spektroskopii korelacji fotonowej (PCS), znanej również jako dynamiczne rozpraszanie światła.
    1. W celu określenia rozmiaru nanocząstek (NP), należy przenieść 1,5 ml zsyntetyzowanego roztworu Au(0)-NP do kuwet w warunkach bezpyłowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie poddać go analizie za pomocą analizatora wielkości i potencjału zeta cząstek. Szczegółowy opis PCS oraz przygotowania próbek znajduje się w publikacji Schurtenberger, P. et al. (1993). 59 oraz Jain, R. et al. (2015) 60.

6. Eksperymenty QCM-D – powlekanie powierzchni białkiem Slp1 i adsorpcja Au-NP na sieci Slp1

Uwaga: Pomiary przeprowadzono za pomocą QCM-D wyposażonego w maksymalnie cztery moduły przepływowe. Wszystkie eksperymenty QCM-D wykonano przy stałej szybkości przepływu 125 µl/min w temperaturze 25 °C. Powlekanie Slp1 oraz inkubacja z metalem/NP przeprowadzono na piezoelektrycznych czujnikach kwarcowych AT-cut z SiO2 (Ø 14 mm) o częstotliwości podstawowej ≈ 5 MHz. Etapy płukania i dodawania roztworu są zaznaczone na rysunkach w części z reprezentatywnymi wynikami. Eksperymenty QCM-D można opisać jako proces etapowy, rozpoczynający się od czyszczenia i modyfikacji powierzchni użytych czujników, a następnie rekrystalizacji Slp1 i w dalszej kolejności oddziaływania z metalem oraz nanocząsteczkami (NP) metalu.

  1. Procedury czyszczenia:
    1. Wyposaż celle przepływowe w atrapy czujników. Przepompuj co najmniej 20 ml (na każdy moduł) alkalicznego środka czyszczącego (2% detergentu w wodzie ultrapurej (v/v)) przez system QCM-D i układ rurek. Następnie przepompuj pięciokrotność tej objętości (na każdy moduł) wody ultrapurej przez system (przepływ do 300 µl/min). Przeprowadź czyszczenie zgodnie z protokołem producenta.
    2. Wyczyść czujniki SiO2 poza modułami przepływowymi poprzez inkubację (co najmniej 20 min) w 2% roztworie SDS, a następnie kilkakrotnie opłucz czujniki wodą ultrapurej 61,62.
    3. Wysusz kryształy przefiltrowanym sprężonym powietrzem i umieść je w komorze do czyszczenia ozonem na 20 min 63,64.
    4. Powtórz procedurę czyszczenia dwukrotnie, aby usunąć wszystkie zanieczyszczenia organiczne.
    5. Aby usunąć metale związane z powierzchni czujnika, opłucz czujniki 1 M HNO3. Następnie przeprowadź wszystkie etapy płukania wodą ultrapurej.
  2. Modyfikacja powierzchni czujnika polielektrolitami:
    Uwaga: Modyfikację powierzchni można przeprowadzić albo wewnątrz (procedura przepływowa), albo poza modułem przepływowym (technika LbL). W niniejszych eksperymentach zastosowano następujący sposób modyfikacji powierzchni.
    1. Zmodyfikuj czujniki za pomocą 3 g/L naprzemiennych warstw polielektrolitów (PE) polietyleniminy (PEI, MW 25,000) i polistyrenosulfonianu (PSS, MW 70,000) metodą dip-coatingu z wykorzystaniem techniki LbL 40,41, opisanej wcześniej dla specjalnego układu zastosowanego w artykule Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Umieść czujniki w odpowiednim roztworze PE w płytkach do głębokich wgłębień i inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Wyjmij czujniki z roztworu PE i intensywnie płucz je wodą ultrapurej pomiędzy każdym etapem dip-coatingu.
      Uwaga: Nowa modyfikacja powierzchni składa się z co najmniej trzech warstw PE, kończących się dodatnio naładowaną PEI.
    4. Po tej zewnętrznej modyfikacji umieść czujniki wewnątrz modułu przepływowego i zrównoważ je, płucząc wodą ultrapurej przed rozpoczęciem eksperymentów.
  3. Rekrystalizacja monowarstwy Slp1:
    1. Rozpuść Slp1 w 4 M moczniku w celu przekształcenia polimerów w monomery.
    2. Odwiruj zmonomeryzowane białka przy 15,000 x g, 4 °C przez 1 h, aby usunąć większe agregaty białkowe.
    3. Wymieszaj solubilizowany i odwirowany supernatant Slp1 z buforem do rekrystalizacji do końcowego stężenia białka 0.2 g/L.
      Uwaga: Zależna od wapnia rekrystalizacja Slp1 (samoorganizacja) rozpoczyna się po dodaniu buforu do rekrystalizacji. Dlatego natychmiast przepompuj zmieszany roztwór z prędkością przepływu 125 µl/min na czujniki (umieszczone wewnątrz modułów przepływowych). Rekrystalizację uznaje się za zakończoną po wykryciu stabilnych wartości przesunięć częstotliwości i dyssypacji w eksperymentach QCM-D.
    4. Po pomyślnej rekrystalizacji białka na powierzchni zmodyfikowanych PE czujników wewnątrz modułów przepływowych, intensywnie opłucz powlekane czujniki buforem do rekrystalizacji lub wodą ultrapurej z prędkością przepływu 125 µl/min, aż do wykrycia stabilnych wartości przesunięć częstotliwości i dyssypacji.
      Uwaga: Modyfikacja powierzchni SiO2 za pomocą PE dla późniejszych eksperymentów sorpcyjnych na monowarstwie Slp1 oraz badań AFM jest przedstawiona na Rysunku 1.

Schemat czujnika QCM-D z polielektrolitami, warstwami PEI/PSS i roztworem nanocząsteczek metalu.
Rycina 1. Schemat modyfikacji powierzchni PE i powłoki monowarstwy Slp1; Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Suhr, M. et al. (2015) 19 za zgodą wydawnictwa Springer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Interakcja metalu i nanocząsteczek metalu:
    Uwaga: Sorpcja z roztworem soli metalu Au (HAuCl4 ∙ 3 H2O) była przeprowadzana w stężeniach 1 mM lub 5 mM przy pH = 6,0 w 0,9% roztworach NaCl. Adsorpcja Au-NP była przeprowadzana z nierozcieńczonymi Au-NP w 1,6 mM buforze cytrynianu trisodku przy pH ≈ 5,0.
    1. Po pomyślnym naniesieniu powłoki Slp1 w modułach przepływowych, intensywnie płucz uzyskaną warstwę Slp1 roztworem 0,9% NaCl, aż do momentu wykrycia stabilnych wartości przesunięć częstotliwości i dysypacji.
    2. Pompuj przygotowany roztwór metalu (1 mM) i roztwór nanocząsteczek do modułów przepływowych z szybkością przepływu 125 µl/min i monitoruj adsorpcję masy na warstwie Slp1. Adsorpcja masy może być wykrywana bezpośrednio poprzez śledzenie przesunięć częstotliwości zgodnie z równaniem Sauerbreya (Równanie 1).
    3. Po zakończeniu interakcji metalu i nanocząsteczek metalu, płucz warstwę buforem wolnym od metalu/nanocząsteczek, aby usunąć słabo związane lub słabo przytwierdzone metale lub nanocząsteczki.
      Uwaga: Schemat układu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 2.

Schemat modułu przepływowego z pompą perystaltyczną, źródłem napięcia, procesem adsorpcji, układ QFM 401.
Rysunek 2. Schematyczny projekt układu QCM-D z wykorzystaniem modułu przepływowego QFM 401*66. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Rejestracja danych i ewaluacja:
    1. Rejestruj przesunięcia częstotliwości w Hz (Δfn) oraz dyssypację (ΔDn) podczas eksperymentów QCM-D, korzystając z dedykowanego oprogramowania QCM-D.
    2. Do oceny czułości masy zaadsorbowanej (Δm) wykorzystaj równanie/model Sauerbreya (Równanie 1) 65 66, który jest właściwy dla cienkich i sztywnych filmów sprzężonych bez tarcia z powierzchnią sensora w n-tej harmonicznej. Wartość C (stała Sauerbreya) dla zastosowanego kwarcowego sensora AT cut o częstotliwości 5 MHz wynosi 17,7 ng ∙ Hz-1 ∙ cm-268. Dla sztywnych, równomiernie rozłożonych i wystarczająco cienkich warstw zaadsorbowanych stosuj Równanie 1 jako dobre przybliżenie.
      Równanie Δm=-C(1/n)Δfn, analiza zmiany masy, obliczenia naukowe, formuła edukacyjna.
    3. Wykonaj dodatkowe modelowanie zgodnie z modelem Kelvina-Voigta, właściwym dla cząsteczek wiskoelastycznych 68-71, używając oprogramowania producenta i porównaj wyniki z danymi z modelu Sauerbreya.
    4. Do obliczenia grubości warstwy i masy adsorpcji przyjmij jako istotny parametr modelowania gęstość warstwy zaadsorbowanej wynoszącą 1,35 g ∙ cm-3, co odpowiada wartościom opisanym wcześniej dla białek warstwy S 72-75. Użyj tej samej wartości do obliczeń oddziaływania metalu z warstwą białkową.

7. Pomiary AFM

  1. Przeprowadzić badania z wykorzystaniem pełnofunkcyjnego AFM na odwróconym mikroskopie optycznym.
    1. Rejestrować obrazy AFM w cieczy, używając buforu do rekrystalizacji lub wody ultraczystej, bezpośrednio na powlekonych czujnikach QCM-D.
    2. Przepłukać czujniki wodą ultraczystą po eksperymentach QCM-D i umieścić je w celi przepływowej AFM. W tym celu należy użyć zamkniętej celi przepływowej o całkowitej objętości około 1,5 ml. Utrzymywać stałą temperaturę celi przepływowej na poziomie 30 °C.
    3. Użyć dźwigni (cantilever) o częstotliwości rezonansowej ≈ 25 kHz w wodzie i sztywności <0,1 N/m. Dostosować prędkość skanowania w zakresie od 2,5 do 10 µm/sec.
    4. Wykonawać obrazy w dynamicznym trybie kontaktowym, podczas gdy dźwignia jest pobudzana przez piezoelektryk z częstotliwością rezonansową. Odległość dźwigni od powierzchni określić na podstawie tłumienia oscylacji 76.
      Uwaga: Obrazy wysokości są prezentowane ze skalą z, gdzie wartości z reprezentują dokładną topografię powierzchni. Obrazy amplitudy (Pseudo 3D) są prezentowane bez skali z, ponieważ wartości z amplitudy zależą od parametrów skanowania i niosą ograniczoną ilość informacji. Analiza obrazów została przeprowadzona przy użyciu trzech różnych programów ewaluacyjnych 77.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kulturyzacja mikroorganizmów i charakterystyka białka Slp1

Zarejestrowane dane dotyczące wzrostu bakterii wskazują na zakończenie fazy wzrostu wykładniczego po około 5 godzinach. Poprzednie badania wykazały, że Slp1 można wyizolować w tym punkcie zbioru (4,36 g/L masy wilgotnej (≈ 1,45 g/L (BDW)) z maksymalnym wydajnością19. Niemniej jednak optymalizacja hodowli poprzez zastosowanie zdefiniowanych skł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy badano wiązanie Au z białkami warstwy S przy użyciu kombinacji różnych metod analitycznych. W szczególności wiązanie Au jest bardzo atrakcyjne nie tylko dla odzysku Au z wód kopalnianych lub roztworów procesowych, ale także dla budowy materiałów, np . powierzchni sensorycznych. Do badań interakcji Au (Au(III) i Au(0)-NPs) z zawieszoną i rekrystalizowaną monowarstwą Slp1 białko musiało zostać wyizolowane. Dlatego badanie to wykazało udaną hodowlę szczepu bakterii Gram-dodatnich L. sphaericu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Obecna praca została częściowo sfinansowana przez IGF-projekt "S-Sieve" (490 ZBG/1) finansowany przez BMWi oraz BMBF-projekt "Aptasens" (BMBF/DLR 01RB0805A). Specjalne podziękowania dla Tobiasa J. Günthera za jego cenną pomoc podczas studiów AFM oraz dla Erika V. Johnstone'a za przeczytanie rękopisu jako native speakera języka angielskiego. Ponadto autor tego artykułu pragnie podziękować Aline Ritter i Sabrinie Gurlit (z Institute for Resource Ecology za pomoc w pomiarach ICP-MS), Manji Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava oraz grupie biotechnologicznej z Helmholtz-Institute Freiberg for Resource Technology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
sprzęt i oprogramowanie
Bioreaktor, system pilotażowy Steam In Place 70LApplikon Biotechnology, HolandiaZ6XZawiera czujniki pH dO2, czujniki pH Applikon Biotechnology i oprogramowanie BioXpert V2
Nieinwazyjny monitor biomasy BugEye 2100BugLab, Concord (CA), USASpektrometr --- Z9X
Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech, Wielka Brytania80-2109-10Firma teraz GE Healthcare Nauki przyrodnicze
MiniStar mikrowirówkaVWR, Niemcy521-2844Do wirowania próbek hodowlanych
Mikroskop systemu badawczego BX-61Olympus Germany LLC, Niemcy037006Mikroskop w połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania
Cell^P (wersja 3.1)Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü nster, Niemcy---razem z mikroskopem
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-SCarr Centritech, Floryda, USA9010PLTDo zbioru biomasy
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik, Niemcy431-2601Do usuwania wici i homogenizacji próbki
Wirówka Superspeed Sorvall Evolution RCThermo Fisher Scientific, USA728411Stosowany w izolacji białek
Mobilny procesor płynów szybkotnących, M-110EH-30 PilotMicrofluidics, Massachusetts, USAM110EH30KUżywany do pękania komórek
Alpha 1-4 LSC LiofilizatorMartin Christ Liofilizatory LLC, Osterode, Niemcy102041---
UV-VIS spektrofotometria (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific, USA91-ND-2000C-LDo oznaczania białka stężenie
Pionowa komora do elektroforezy Mini-PROTEANBio-Rad Laboratories GmbH, Monachium, Niemcy165-3322Do SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000Bio-Rad Laboratories GmbH, Monachium, Niemcy1708030Służy do obrazowania żeli SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer, Waltham (MA), USAN8120536Do oznaczania stężenia metalu
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire, Wielka BrytaniaZEN3600Do oznaczania wielkości nanocząstek
Urządzenie Q-Sense E4 Q-Sense AB, Göteborg, SzwecjaQS-E4zamówiony przez LOT quantum design (oprogramowanie dołączone do platformy E4)
Q-Soft 401 (rejestracja danych)Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja
Q-Tools 3 (ocena i modelowanie danych)Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja
Moduły przepływu QCM-D QFM  401 Q-Sense AB, Göteborg, SzwecjaQS-QFM401zamówiony przez LOT quantum design
QSX  303 SiO2 piezoelektryczne czujniki kwarcowe AT-cutQ-Sense AB, Göteborg, SzwecjaQS-QSX303zamówione przez LOT quantum design
Komora do czyszczenia ozonuBioforce Nanoscience, Ames (IA), USAQS-ESA006zamówione przez LOT quantum design
Mikroskop sił atomowych MFP-3D Bio AFMAsylum Research, Santa Barbara (CA), USAOprogramowanie do pomiarów i obrazowania AFMMFP-3DBio
Oprogramowanie AFM Asylum Research AR Version 120804+1223Asylum Research, Santa Barbara (CA), USAoprogramowanie do obrazowania zawarte w Cat. Nie. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 OprogramowanieWaveMetrics, Inc., USAoprogramowanie do obrazowania zawarte w Cat. Nie. MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research, Santa Barbara (CA), USAPodgrzewaczpróbek do pomiarów AFM
Mini wspornik Biolever,  BL-AC40TS-C2Olympus Niemcy LLC, Niemcy  BL-AC40TS-C2Preferowany wspornik do pomiarów AFM
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)Nanotec Electronica S.L. , Hiszpaniadarmoweoprogramowanie do analizy
AFMNazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Detergenty i inne akcesoria
kwas kwaśny, 100 % rocznieCARL ROTH GmbH+CO. KG3738.5Niebezpieczne, łatwopalne i ciecze i pary. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu.
Przeciwpieniący 204Sigma-Aldrich Co., LLC.A6426Do tłumienia piany
błękit bromofenolowy, sól sodowaSigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
Coomassie Błękit brylantowy R (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO. KG3862.1---
Deoksyrybonukleaza II ze śledziony świńskiejSigma-Aldrich Co., LLC.D4138Typ IV , 2,000 - 6,000  Kunitz jednostek/mg białka
Etanol, 95%VWR, Niemcy20827.467Niebezpieczeństwo, gliceryna łatwopalna
, p.a.CARL ROTH GmbH+CO. KG3783.1---
Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
Kwas solny (HCl) (37%)CARL ROTH GmbH+CO. KG4625.2Niebezpieczeństwo; , używany do regulacji pH
Lizozym z białka jaja kurzegoSigma-Aldrich Co., LLC.L6876 Liofilizowany proszek, białko = 90 %, = 40 000 jednostek/mg białka (Sigma) 
Mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem,  MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG, Niemcy504.10100.00Standardowe mieszadło w eksperymencie
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
Kwas azotowy (HNO3)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN50.1Niebezpieczeństwo; Utleniający,
PageRuler Niebarwiona drabinka białkowaThermoScientific-Pierce26614---
Poli(4-styrenosulfonian sodu) (PSS)Sigma-Aldrich Co., LLC.243051Średnia Mw ~ 70 000
Polietyleninina (PEI), oddziałSigma-Aldrich Co. LLC.408727Ostrzeżenie; Szkodliwy, drażniący, niebezpieczny dla środowiska; średnia Mw ~ 25 000
Węglan potasu bezwodny (K2CO3)Sigma-Aldrich Co. LLC.60108Ostrzeżenie; Szkodliwa
rybonukleaza A z trzustki bydlęcej Sigma-Aldrich Co., Sp. z o.o.R5503Typ I-AS, 50 - 100 jednostek Kunitza/mg białka 
Azydek sodu (NaN3)Merck KGaA106688Niebezpieczeństwo; bardzo toksyczny i niebezpieczny dla środowiska
Chlorek sodu (NaCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG3957.2---
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich Co., LLC.L-5750Niebezpieczeństwo; toksyczny
wodorotlenek sodu (NaOH)CARL ROTH GmbH+CO. KG6771.1Niebezpieczeństwo; , stosowane do regulacji pH w uprawie i regulacji pH
Spectra/Por 6, membrana do dializy, MWCO 50 000 CARL ROTH GmbH+CO. KG1893.1---
Kwas siarkowy (H2SO4)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN52.2Niebezpieczeństwo; , stosowany do regulacji pH w uprawie
Kwas garbnikowy (C76H52O46)Sigma-Aldrich Co. LLC.16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG9090.2---
Triton X-100CARL ROTH GmbH+CO. KG3051.3Ostrzeżenie; Szkodliwe, niebezpieczne dla środowiska
VIVASPIN 500, 50 000 MWCO Rurki ultrafiltracyjneSartorius AGVS0132---
β-merkaptoetanolSigma-Aldrich Co., LLC.M6250Niebezpieczeństwo, toksyczny
------

Bibliografia

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705(2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Białka warstwy Ssorpcja złotaanaliza QCM-Ddetekcja ICP-MSobrazowanie AFMmonowarstwa Slp1wiązanie metalirekrystalizacja białekadsorpcja nanocząsteczek
Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.