Artykuł metodologiczny

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

DOI:

10.3791/53572

⸱

19 stycznia 2016

 ,  , 
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać podstawowe informacje na temat sorpcji i recyklingu złota z układów wodnych, zbadano oddziaływanie nanocząstek Au(III) i Au(0) na białka warstwy S. Absorpcję polimerów białkowych badano za pomocą ICP-MS, a monowarstw białkowych za pomocą QCM-D. Późniejsze AFM umożliwia obrazowanie nanostruktur.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej publikacji opisano zachowanie sorpcji złota białek warstwy powierzchniowej (warstwy S) (Slp1) Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Te biomolekuły układają się w parakrystaliczne dwuwymiarowe układy na powierzchniach, wiążą metale, a zatem są interesujące dla kilku zastosowań biotechnicznych, takich jak materiały biosorpcyjne do usuwania lub odzyskiwania różnych pierwiastków ze środowiska i procesów przemysłowych. Osadzanie nanocząstek Au(0) na warstwach S, zarówno poprzez syntezę ukierunkowaną warstwy S1, jak i adsorpcję nanocząstek, otwiera nowe możliwości dla różnorodnych zastosowań sensorycznych. Chociaż liczne badania opisały właściwości biosorpcyjne warstw S 2-5, głębsze zrozumienie interakcji białko-białko i białko-metal nadal pozostaje wyzwaniem. W poniższym badaniu zastosowano spektrometrię mas sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) do wykrywania sorpcji metali przez zawieszone warstwy S. Zostało to skorelowane z pomiarami mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem rozpraszania (QCM-D), która umożliwia wykrywanie online tworzenia się monowarstw białkowych i osadzania metali, a tym samym bardziej szczegółowe zrozumienie wiązania metali.

Wyniki ICP-MS wskazują, że wiązanie Au(III) z zawieszonymi polimerami warstwy S jest zależne od pH. Maksymalne wiązanie Au(III) uzyskano przy pH 4,0. Badania QCM-D umożliwiły wykrycie sorpcji Au(III), a także osadzanie Au(0)-NPs w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów in situ. Co więcej, metoda ta pozwoliła na zbadanie wpływu wiązania metali na stabilność sieci białkowej Slp1. Właściwości strukturalne i stabilność warstwy białkowej można było zobrazować bezpośrednio po eksperymencie QCM-D przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM). Podsumowując, połączenie tych różnych metod zapewnia głębsze zrozumienie wiązania metali przez bakteryjne białka warstwy S w zawiesinie lub w postaci monowarstw na komórkach bakteryjnych lub zrekrystalizowanych powierzchniach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na rosnące wykorzystanie złota do wielu zastosowań, takich jak elektronika, katalizatory, biosensory czy instrumenty medyczne, popyt na ten cenny metal wzrósł w ciągu ostatnich kilku lat o 6-9. Złoto, podobnie jak wiele innych metali szlachetnych i ciężkich, jest uwalniane do środowiska poprzez ścieki przemysłowe w rozcieńczonych stężeniach, poprzez działalność wydobywczą i utylizację odpadów 7,8,10, chociaż większość zanieczyszczeń środowiska metalami ciężkimi lub szlachetnymi jest procesem ciągłym, spowodowanym głównie działalnością technologiczną. Prowadzi to do znacznej ingerencji w naturalne ekosystemy i może potencjalnie zagrozić zdrowiu ludzi 9 . Wiedza o tych negatywnych skutkach sprzyja poszukiwaniu nowych technik usuwania metali z zanieczyszczonych ekosystemów i poprawie recyklingu metali ze ścieków przemysłowych. Dobrze znane metody fizykochemiczne, takie jak wytrącanie lub wymiana jonowa, nie są tak skuteczne, zwłaszcza w mocno rozcieńczonych roztworach 7,8,11. Biosorpcja, zarówno z żywą, jak i martwą biomasą, jest atrakcyjną alternatywą dla oczyszczania ścieków 10,12. Stosowanie takich materiałów biologicznych może zmniejszyć zużycie toksycznych chemikaliów. Opisano wiele mikroorganizmów, które gromadzą lub unieruchamiają metale. Na przykład komórki Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 wykazały wysoką zdolność wiązania metali szlachetnych, np. Pd(II), Pt(II), Au(III) i innych metali toksycznych, takich jak Pb(II) lub U(VI) 4,13, komórki Bacillus megaterium dla Cr(VI) 14, komórki Saccharomyces cerevisiae dla Pt(II) i Pd(II) 15 oraz Chlorella vulgar dla Au(III) i U(VI) 16,17. Wiązanie poprzednich metali, takich jak Au(III), Pd(II) i Pt(II) zostało również zgłoszone dla Desulfovibrio desulfuricans18 i dla L. sphaericus JG-B53 19,20. Niemniej jednak nie wszystkie drobnoustroje wiążą duże ilości metali, a ich zastosowanie jako materiału sorpcyjnego jest ograniczone 12,21. Ponadto zdolność wiązania metali zależy od różnych parametrów, np. składu komórki, zastosowanego biokomponentu, czy warunków środowiskowych i doświadczalnych (pH, siła jonowa, temperatura itp.). Badanie izolowanych fragmentów ściany komórkowej 22,23, takich jak lipidy błonowe, peptydoglikan, białka lub inne składniki, pomaga zrozumieć procesy wiązania metali w złożonych zbudowanych całych komórkach 8,21.

Komponenty komórkowe, na których skupiono się w tym badaniu, to białka warstwy S. Białka warstwy S są częścią zewnętrznej otoczki komórkowej wielu bakterii i archeonów i stanowią około 15 - 20% całkowitej masy białkowej tych organizmów. Jako pierwszy interfejs ze środowiskiem, te związki komórkowe silnie wpływają na właściwości sorpcyjne bakterii 3. Białka warstwy S o masie cząsteczkowej od czterdziestu do setek kDa są wytwarzane w komórce, ale są składane na zewnątrz, gdzie są w stanie tworzyć warstwy na błonach lipidowych lub polimerowych składnikach ściany komórkowej. Po wyizolowaniu prawie wszystkie białka warstwy S mają wewnętrzną właściwość spontanicznego samoorganizowania się w zawiesinie, na granicy faz lub na powierzchniach tworzących płaskie lub rurkowate struktury 3. Grubość monowarstwy białkowej zależy od bakterii i mieści się w zakresie 5 - 25 nm 24. Ogólnie rzecz biorąc, utworzone struktury białkowe warstwy S mogą mieć symetrię ukośną (p1 lub p2), kwadratową (p4) lub sześciokątną (p3 lub p6) ze stałymi sieci od 2,5 do 35 nm 3,24. Tworzenie sieci wydaje się być w wielu przypadkach zależne od kationów dwuwartościowych, a głównie od Ca2 + 25,26, Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)). Niemniej jednak pełna kaskada reakcji fałdowania monomeru, oddziaływania monomer-monomer, tworzenia sieci oraz rola różnych metali, zwłaszcza kationów dwuwartościowych, takich jak Ca2+ i Mg2+, nadal nie są w pełni poznane.

Gram-dodatni szczep L. sphaericus JG-B53 (przemianowany z Bacillus sphaericus po nowej klasyfikacji filogenetycznej) 27 został wyizolowany ze składowiska odpadów wydobywczych uranu "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saksonia, Niemcy) 4,28,29. Jego funkcjonalne białko warstwy S (Slp1) ma kwadratową siatkę, masę cząsteczkową 116 kDa 30 i grubość ≈ 10 nm na żywych komórkach bakteryjnych 31. W poprzednich badaniach tworzenie in vitro zamkniętej i stabilnej warstwy białkowej o grubości około 10 nm osiągnięto w czasie krótszym niż 10 minut19. Pokrewny szczep L. sphaericus JG-A12, również izolat ze stosu "Haberland", ma wysoką zdolność wiązania metali, a jego izolowane białko warstwy S wykazało wysoką stabilność chemiczną i mechaniczną oraz dobre wskaźniki sorpcji dla metali szlachetnych, takich jak Au(III), Pt(II) i Pd(II) 4,32,33. To wiązanie metali szlachetnych jest mniej lub bardziej specyficzne dla niektórych metali i zależy od dostępności grup funkcyjnych na zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni białka polimeru oraz w jego porach, sile jonowej i wartości pH. Istotnymi grupami funkcyjnymi dla interakcji białek z metalami są COOH-, NH2-, OH-, PO4-, SO4- i SO-. Zasadniczo, zdolności wiązania metali otwierają szerokie spektrum zastosowań,Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)).np. jako składniki biosorpcyjne do usuwania lub odzyskiwania rozpuszczonych metali toksycznych lub cennych, matryce do syntezy lub określonego osadzania nanocząstek metalicznych (NP) o regularnej strukturze do katalizy oraz inne materiały bioinżynieryjne, takie jak warstwy biosensoryczne 3,5,18,33. Regularnie rozmieszczone macierze NP, takie jak Au(0)-NPs, mogą być wykorzystywane do głównych zastosowań, takich jak elektronika molekularna i biosensory, urządzenia do przechowywania o ultrawysokiej gęstości i katalizatory do CO-oksydacji 34-37. Rozwój takich zastosowań i inteligentne projektowanie tych materiałów wymaga głębszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wiązania metali.

Warunkiem wstępnym dla rozwoju takich materiałów pochodzenia biologicznego jest niezawodna implementacja warstwy interfejsu między biomolekułą a powierzchnią techniczną 38,39. Na przykład polielektrolity zestawione techniką warstwa po warstwie (LbL) 40,41 zostały wykorzystane jako warstwa graniczna do rekrystalizacji białek warstwy S 39. Taki interfejs oferuje stosunkowo łatwy sposób na wykonanie powłoki białkowej w sposób powtarzalny i ilościowy. Przeprowadzając różne eksperymenty z modyfikacją i bez modyfikacji promotorów adhezyjnych, możliwe jest sformułowanie stwierdzeń dotyczących kinetyki powłoki, stabilności warstwy i interakcji metali z biomolekułami 19,42,Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)). Jednak złożony mechanizm adsorpcji białek i interakcji białko-powierzchnia nie jest w pełni zrozumiały. W szczególności nadal brakuje informacji na temat konformacji, orientacji wzoru i gęstości powłoki.

Technika mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D) przyciągnęła uwagę w ostatnich latach jako narzędzie do badania adsorpcji białek, kinetyki powlekania i procesów interakcji w skali nanometrowej 19,43-45. Technika ta pozwala na szczegółowe wykrywanie adsorpcji masy w czasie rzeczywistym i może być stosowana jako wskaźnik procesu samoorganizacji białek i sprzężenia funkcjonalnych cząsteczek na sieciach białkowych 19,20,42,46-48. Ponadto pomiary QCM-D otwierają możliwość badania procesów interakcji metali z warstwą białkową w naturalnych warunkach biologicznych. W niedawnym badaniu badano interakcję białka warstwy S z wybranymi metalami, takimi jak Eu(III), Au(III), Pd(II) i Pt(II) i Pt(II) za pomocą QCM-D 19,20. Zaadsorbowana warstwa białkowa może służyć jako uproszczony model ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich. Badania nad tym pojedynczym składnikiem mogą przyczynić się do głębszego zrozumienia interakcji metali. Jednak wyłącznie eksperymenty z QCM-D nie pozwalają na stwierdzenie struktury powierzchniowej i wpływu metali na białko. Do uzyskania takich informacji niezbędne są inne techniki. Jedną z możliwości obrazowania bio-nanostruktur i uzyskania informacji o właściwościach strukturalnych jest mikroskopia sił atomowych (AFM).

Celem prezentowanego badania było zbadanie sorpcji złota (Au(III) i Au(0)-NPs) do białek warstwy S, w szczególności Slp1 L. sphaericus JG-B53. Eksperymenty przeprowadzono z zawieszonymi białkami w skali partii w zakresie pH 2,0 - 5,0 przy użyciu ICP-MS oraz z unieruchomionymi warstwami S przy użyciu QCM-D. Dodatkowo zbadano wpływ roztworu soli metalu na stabilność sieci w kolejnych badaniach AFM. Połączenie tych technik przyczynia się do lepszego zrozumienia procesów interakcji metali in vitro jako narzędzia pozwalającego dowiedzieć się więcej o zdarzeniach wiązania całych komórek bakteryjnych w odniesieniu do określonych powinowactw do metali. Wiedza ta ma kluczowe znaczenie nie tylko dla opracowania odpowiednich materiałów filtracyjnych do odzysku metali w celu ochrony środowiska i zachowania zasobów 49, ale także dla opracowania matryc wysoce uporządkowanych metalicznych nanocząsteczek do różnych zastosowań technicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikroorganizmy i warunki uprawy

Uwaga: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w sterylnych warunkach. L. sphaericus (L. sphaericus) JG-B53 otrzymano z hodowli kriokonserwowanej 29,30.

  1. Przenieść kulturę kriokonserwowaną (1,5 ml) pod czystą ławkę do 300 ml sterylnego bulionu odżywczego (NB) (3 g/l ekstraktu mięsnego, 5 g/l peptonu, 10 g/l NaCl). Następnie mieszać roztwór przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 30 °C, aby uzyskać kulturę wstępną do uprawy.
  2. Hodować bakterie w warunkach tlenowych w pożywkach NB przy pH = 7,0, 30 °C w 70-litrowym bioreaktorze parowym na miejscu. Dlatego napełnij reaktor ≈ 57 l wody dejonizowanej. Dodać i rozpuścić stałe pożywki NB bezpośrednio w bioreaktorze (stężenia patrz wyżej).
    1. Dodatkowo dodać środek przeciwpieniący (30 μl/L NB-media) do podłoża, aby zahamować tworzenie się piany podczas uprawy, a następnie autoklawować (122 °C, czas utrzymywania temperatury 30 min) media wewnątrz reaktora.
  3. Schłodzić pożywkę i przeprowadzić pełne nasycenie tlenem. Dostosować pH do 7,0 (używając 1 M H2SO4 i 2 M NaOH) i rozpocząć automatyczne zaszczepianie 300 ml kultury wstępnej. Rozpocznij rejestrację parametrów uprawy w punkcie inokulacji. Rejestruj parametry online, np. poziom tlenu rozpuszczonego (dO2), dodatek kwasów i zasad oraz wartości pH w uprawie.
    1. Monitoruj rozwój bakterii online za pomocą nieinwazyjnych pomiarów zmętnienia.
  4. Wykonaj dodatkowe pobieranie próbek po każdej godzinie uprawy i określ dalsze parametry, takie jak bio sucha masa (BDW) i gęstość optyczna offline (OD). W związku z tym w każdym punkcie pobierania próbek należy zebrać 20 ml bulionu uprawowego w sterylnych warunkach.
    1. Określić OD offline za pomocą pomiarów fotometrycznych adsorpcji przy 600 nm. Użyj sterylnego przefiltrowanego pożywki NB jako wartości ślepej. Po osiągnięciu adsorpcji >0,4 rozcieńczyć zawiesinę komórkową zgodnie z liniowością prawa Lamberta-Beera.
    2. Do oznaczania BDW odwirować od 1 do 5 ml zawiesiny bakteryjnej (w zależności od gęstości komórek) przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymane osady komórkowe wysuszyć w temperaturze 105 °C w piecu grzewczym do uzyskania stabilności masy i zmierzyć masę osadu.
  5. Wykonuj obrazy mikroskopowe za pomocą optycznego mikroskopu badawczego z kontrastem fazowym w powiększeniu 400 i 1,000 razy (kondensor kontrastu fazowego odpowiednio 2 i 3) w celu sprawdzenia wzrostu bakterii i kontroli zanieczyszczenia krzyżowego.
  6. Po osiągnięciu fazy wzrostu wykładniczego wykrytej przez dO 2 i zmętnienie w trybie online, biomasę należy zebrać przez wirowanie przepływowe w temperaturze 15 000 x g, 4 °C i dwukrotnie przepłukać biomasę standardowym buforem (50 mM TRIS, 10 mM MgCl2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Uwaga: Otrzymany granulat z biomasy można przechowywać w temperaturze -18 °C do czasu dalszego wykorzystania do izolacji.

2. Izolacja i oczyszczanie białek warstwy S

Uwaga: Oczyszczaj polimery Slp1 zgodnie z dostosowaną metodą, jak opisano wcześniej2,19,30,32,50,51.

  1. Umytą i rozmrożoną biomasę surową otrzymaną z hodowli homogenizować w buforze standardowym (1:1 (m/v)) w celu usunięcia wici za pomocą dyspergatora (poziom 3, 10 min) w łaźni lodowej schładzanej w temperaturze 4 °C.
  2. Zawiesinę odwirować (8 000 x g, 4 °C przez 20 min) i dwukrotnie przepłukać otrzymany osad standardowym buforem (1:1 (w/v)). Po umyciu i odwirowaniu (8 000 x g, 4 °C przez 20 min), ponownie zawiesić osad w standardowym buforze (1:1 (w/v)), dodać DNazę II i RNazę (0,4 jednostki/g biomasy) do zawiesiny i rozdrobnić komórki pod ciśnieniem 1000 bar za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego. Następnie odwirować zawiesinę w temperaturze 27 500 x g, 4 °C przez 1 godz.
    Uwaga: Kontroluj zawieszenie komórek za pomocą mikroskopu badawczego. Pęknięcie jest zakończone, gdy w polu widzenia mikroskopu widoczne są mniej niż 2 - 3 nienaruszone komórki w powiększeniu 400-krotnym.
  3. Przemyć osad dwukrotnie standardowym buforem (1:1 (w/v)) i ponownie przeprowadzić wirowanie. Następnie ponownie zawiesić osad w standardowym buforze (2:1 (w/v)) zmieszanym z 1% Triton X-100 i inkubować go przez 20 minut pod kolejnym wstrząsaniem (100 obr./min) w celu rozpuszczenia osadów lipidowych.
  4. Odwirować roztwór (27 500 x g, 4 °C przez 1 godzinę) i trzykrotnie przepłukać otrzymany osad standardowym buforem (1:1 (w/v)).
  5. Inkubować osad otrzymany po dodatkowym odwirowaniu (27 500 x g, 4 °C przez 1 godzinę) przez 6 godzin w standardowym buforze (1:1 (w/v)) zmieszanym z lizozymem 0,2 g/l, w celu hydrolizy wiązań w peptydoglikanie 50. Dodatkowo dodać DNazę II i RNazę (po 0,4 jednostki/g biomasy) do zawiesiny.
  6. Po odwirowaniu (45 500 x g, 4 °C, 1 godz.) należy ponownie zawiesić górną białą fazę białkową z małą objętością supernatantu wirującego (<30 ml) zawierającego podjednostki białkowe.
  7. Białą zawiesinę rozpuścić sowoluując, mieszając 1:1 z 6 M chlorowodorkiem guanidyny (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). Rozwiązanie staje się jasne.
  8. Przeprowadzić sterylną filtrację (0,2 μm) roztworu poddanego działaniu GuHCl, a następnie dodatkowe wirowanie z dużą prędkością (45 500 x g, 4 °C przez 1 godzinę).
  9. Przenieść supernatant do probówek z membraną dializacyjną (MWCO 50 000 daltonów) i dializować go z buforem rekrystalizacji (1,5 mM TRIS, 10 mM CaCl2, pH = 8,0) przez 48 godzin.
  10. Przenieść biały roztwór rekrystalizowanego polimeru białkowego do probówek i odwirować w temperaturze 45 500 x g, 4 °C przez 1 godzinę. Zawiesić osad w małej objętości ultraczystej wody (<30 ml).
  11. Następnie przenieść zawiesinę do probówek z membraną dializacyjną i przeprowadzić dializę w ultraczystej wodzie przez 24 godziny w celu usunięcia zawartości buforu.
    Uwaga: Niezbędna jest kilka podmian buforu lub wody ultraczystej podczas dializy.
  12. Liofilizuj oczyszczony Slp1 w liofilizatorze.

3. Charakterystyka i kwantyfikacja Slp1 do eksperymentów

Uwaga: stężenie Slp1 w eksperymentach z sorpcją i powlekaniem zostało określone ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV-VIS.

  1. Pobrać pipetę o objętości 2 μl rozpuszczonej próbki Slp1 bezpośrednio na dolny cokół pomiarowy fotometru. Oznaczyć stężenie białka przy maksimum adsorpcji przy długości fali 280 nm, charakterystycznej dla białek. Użyj współczynnika ekstynkcji 0,61, aby określić stężenie Slp1. Do pomiarów referencyjnych należy użyć roztworu wolnego od Slp1.
  2. Rozcieńczyć białko buforem (do eksperymentów sorpcyjnych w trybie wsadowym należy użyć 0,9% NaCl, pH = 6,0, a do eksperymentów QCM-D należy użyć buforu rekrystalizacyjnego, pH = 8,0) do pożądanego stężenia dla doświadczeń (odpowiednio 1 g/L i 0,2 g/L).
  3. Analizuj jakość i masę cząsteczkową Slp1 za pomocą standardowej metody bioanalitycznej elektroforezy poliakryloamidowej dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) opisanej przez Laemmli, U. K. 52.
    1. Wykonaj SDS-PAGE przed użyciem Slp1 w eksperymentach i np. po inkubacji Au(0)-NP przy użyciu 10% żeli separacyjnych z poliakrylamidu.
    2. W przypadku próbek SDS zmieszać ≈10 μl próbki z hodowli lub próbki białka z buforem próbki (1,97 g TRIS, 5 mg błękitu bromofenolowego, 5,8 ml gliceryny, 1 g SDS, 2,5 ml β-merkaptoetanolu, napełnić wodą ultraczystą do 50 ml) w stosunku 1:1 (v/v) i po 4 minutach inkubacji w temperaturze 95 °C odpipetować mieszaninę do kieszeni żelowych.
    3. Uruchomić SDS-PAGE 30 min pod napięciem 60 V, aż próbki przejdą przez żel zbiorczy i zmienić napięcie na 120 V po przejściu żelu separacyjnego.
    4. Wyjmij żele z systemu żelowego, spłucz ultraczystą wodą i umieść na 1 godzinę w roztworze utrwalającym (10% kwas kwaśny, 50% etanol absolutny). Następnie spłucz żele ultraczystą wodą.
    5. Barwienie żeli przy użyciu dostosowanej niespecyficznej metody błękitu koloidalnego Coomassie 53,54. Po odbarwieniu72,73 należy wykonać obrazy SDS-PAGE za pomocą systemu dokumentacji żelu zgodnie z protokołem producenta.

4. Eksperymenty sorpcyjne w trybie wsadowym i kwantyfikacji metali

  1. Do doświadczeń z sorpcją okresową przygotować roztwór podstawowy Au(III) z HAuCl4 ∙ 3H2O, rozcieńczyć sól metalu i zmieszać ją z roztworem Slp1 / NaCl do początkowego stężenia metalu 1 mM i końcowego stężenia Slp1 1 g/L. Przeprowadzić doświadczenia na trojaczkach z dodatkową kontrolą ujemną bez Slp1. Użyć całkowitej objętości 5 ml do doświadczeń sorpcyjnych.
  2. Wstrząsać zawiesiną w sposób ciągły w temperaturze pokojowej przy różnych wstępnie dostosowanych wartościach pH w zakresie od 2,0 do 5,0 przez 24 godziny (dostosować pH za pomocą roztworu HCl i NaOH o niskim stężeniu).
  3. Po sorpcji odwirować próbki w temperaturze 15 000 x g, 4 °C przez 20 minut) w celu oddzielenia Slp1 od supernatantu.
  4. Przenieść supernatant do probówek ultrafiltracyjnych (MWCO 50 000 Da) i odwirować go przy 15 000 x g, 4 °C przez 20 minut w celu usunięcia rozpuszczonych monomerów białkowych.
  5. Oznaczyć stężenie metalu w otrzymanym filtracie za pomocą ICP-MS 19,20 i wykorzystać wyniki do obliczenia wstecznego sorbowanego metalu przez suchą masę Slp1. Zasady pomiaru, możliwości metody i składowe zastosowanego ICP-MS opisano w literaturze 55.
    1. Przygotuj próbki i referencje do pomiarów ICP-MS z użyciem 1% HNO3 jako matrycy i rodu jako wzorca wewnętrznego (1 mg/ml).

5. Synteza Au-NP i określanie wielkości cząstek

Uwaga: Cytrynian stabilizowany Au(0)-NP został zsyntetyzowany zgodnie z dostosowaną metodą opisaną wcześniej przez Mühlpfordt, H. et al. (1982) w celu uzyskania sferycznych cząstek o średnicy 10 - 15 nm 56,57.

  1. Przygotować ustabilizowany 25 mM HAuCl4 ∙ 3 H2O do tworzenia NP.
  2. Rozcieńczyć 250 μl tego roztworu podstawowego w 19,75 ml ultraczystej wody i inkubować w temperaturze 61 °C przez 15 minut pod kolejnym wstrząsaniem.
  3. Przygotować 5 ml drugiego roztworu podstawowego (12 mM kwasu garbnikowego, 7 mM dwuwodnego cytrynianu sodu, 0,05 mMK2CO3) i inkubować drugi roztwór oddzielnie w temperaturze 61 °C przez 15 min.
  4. Dodawać przy ciągłym mieszaniu drugi roztwór podstawowy do roztworu pierwszego. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez co najmniej 10 minut w temperaturze 61 °C. Następnie schłodzić roztwór i użyć go do powlekania NP na sieci Slp1 w ramach eksperymentów QCM-D.
    Uwaga: Otrzymane Au(0)-NP scharakteryzowano za pomocą spektroskopii UV-VIS przy maksimum absorbancji 520 nm, zwykle używanej do wykrywania powstałych Au(0)-NPs 58. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przeanalizuj rozmiar utworzonego Au(0)-NP za pomocą spektroskopii korelacji fotonów (PCS), która jest również znana jako dynamiczne rozpraszanie światła.
    1. W celu określenia wielkości NP przenieść 1,5 ml zsyntetyzowanego roztworu Au(0)-NP do kuwet w warunkach bezpyłowych w komorze z przepływem laminarnym i przeanalizować go za pomocą sortownika wielkości i potencjału zeta. Szczegółowy opis PCS i przygotowania próbki znajduje się w Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 oraz Jain, R. et al. (2015) 60.

6. Eksperymenty QCM-D - Powłoka Slp1 na powierzchniach i adsorpcja Au-NP na siatce Slp1

Uwaga: Pomiary zostały przeprowadzone za pomocą QCM-D wyposażonego w maksymalnie cztery moduły przepływu. Wszystkie eksperymenty QCM-D przeprowadzono przy stałym natężeniu przepływu 125 μl/min w temperaturze 25 °C. Powlekanie Slp1 i inkubację metalu/NP przeprowadzono na piezoelektrycznych czujnikach kwarcowych SiO2 z cięciem AT-cut (Ø 14 mm) o częstotliwości podstawowej ≈ 5 MHz. Etapy płukania i dodawania roztworu zaznaczono na rysunkach w części z reprezentatywnymi wynikami. Eksperymenty QCM-D można opisać jako krok po kroku, zaczynając od czyszczenia i modyfikacji powierzchni używanych czujników, następnie rekrystalizacji Slp1, a następnie interakcji metal i metal NP.

  1. Procedury czyszczenia:
    1. Wyposaż komórki płynów w manekiny czujników. Przepompować co najmniej 20 ml (każdy na moduł) alkalicznego płynnego środka czyszczącego (2% środka czyszczącego w ultraczystej wodzie (v/v)) przez system QCM-D i probówki. Następnie przepompuj przez system pięciokrotną objętość (każda na moduł) wody ultraczystej (natężenie przepływu do 300 μl/min). Czyszczenie należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta.
    2. Oczyścić czujnikiSiO 2 na zewnątrz modułów przepływowych przez inkubację (co najmniej 20 min) w 2% roztworze SDS, a następnie kilkakrotnie przepłukać czujniki ultraczystą wodą 61,62.
    3. Wysuszyć kryształy przefiltrowanym sprężonym powietrzem i umieścić je w komorze do czyszczenia ozonem na 20 minut 63,64.
    4. Powtórz procedurę czyszczenia dwa razy, aby usunąć całą zawartość organiczną.
    5. Aby usunąć związane metale z powierzchni czujnika, przepłucz czujniki 1 M HNO3. Następnie wykonaj wszystkie etapy płukania ultraczystą wodą.
  2. Modyfikacja powierzchni czujnika za pomocą polielektrolitów:
    Uwaga: Modyfikacja powierzchni może być wykonana zarówno wewnątrz (procedura przepływu przepływowego), jak i na zewnątrz modułu przepływowego (technika LbL). W ramach tych eksperymentów zastosowano następujący sposób modyfikacji powierzchni.
    1. Zmodyfikuj czujniki za pomocą 3 g/L naprzemiennych warstw PE z iminy polietylenu (PEI, MW 25 000) i sulfonianu polistyrenu (PSS, MW 70 000) poprzez powlekanie zanurzeniowe przy użyciu techniki LbL 40,41 opisanej wcześniej dla specjalnego systemu stosowanego w artykule Suhr, M. i in. (2014) 19.
    2. Umieścić czujniki w odpowiednim roztworze PE na płytkach głębinowych i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Wyjąć czujniki z roztworu PE i intensywnie płukać je wodą ultraczystą między każdym etapem powlekania zanurzeniowego.
      Uwaga: Nowa modyfikacja powierzchni składa się z co najmniej trzech warstw PE zakończonych dodatnio naładowanym PEI.
    4. Po tej zewnętrznej modyfikacji umieść czujniki wewnątrz modułu przepływu i wyrównaj czujniki, spłukując je ultraczystą wodą przed rozpoczęciem eksperymentów.
  3. Rekrystalizacja monowarstwowa Slp1:
    1. Rozpuścić Slp1 w 4 M moczniku w celu przekształcenia polimerów w monomery.
    2. Odwirować monomeryzowane białka w temperaturze 15 000 x g, 4 °C przez 1 godzinę, aby usunąć większe aglomeraty białkowe.
    3. Zmieszać rozpuszczony i odwirowany supernatant Slp1 z buforem rekrystalizacyjnym do końcowego stężenia białka 0,2 g/L,
      Uwaga: Rekrystalizacja Slp1 w zależności od wapnia (samoorganizująca się) rozpoczyna się od dodania buforu rekrystalizacyjnego. Dlatego zmieszany roztwór o natężeniu przepływu 125 μl/min należy natychmiast przepompować do czujników (umieszczonych wewnątrz modułów przepływowych). Rekrystalizacja odbywa się po wykryciu stabilnych wartości częstotliwości i przesunięć rozpraszania w eksperymentach QCM-D.
    4. Po udanej rekrystalizacji białek na czujnikach modyfikowanych PE wewnątrz modułów przepływowych przepłukać powlekane czujniki buforem rekrystalicznym lub ultraczystą wodą intensywnie z natężeniem przepływu 125 μl/min, aż do wykrycia stabilnych wartości częstotliwości i przesunięć rozpraszania.
      Uwaga: Modyfikacja powierzchni SiO2 za pomocą PE do późniejszych eksperymentów sorpcyjnych na monowarstwie Slp1 i badaniach AFM jest wizualizowana na rysunku 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schematyczny projekt modyfikacji powierzchni PE i powłoki jednowarstwowej Slp1; Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Suhr, M. et al. (2015) 19 za zgodą Springera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Interakcja metalu i metalu NP:
    Uwaga: Sorpcję roztworem soli metalu Au (HAuCl4 ∙ 3 H2O) przeprowadzono w stężeniach 1 mM lub 5 mM przy pH = 6,0 w 0,9% roztworach NaCl. Adsorpcję Au-NP przeprowadzono za pomocą nierozcieńczonych Au-NP w 1,6 mM buforze cytrynianu sodu o pH ≈ 5,0.
    1. Po udanym pokryciu Slp1 w modułach przepływowych, otrzymaną warstwę Slp1 należy intensywnie przepłukać 0,9% roztworem NaCl, aż do wykrycia stabilnych wartości częstotliwości i przesunięć rozpraszania.
    2. Przepompować przygotowany roztwór metalowy (1 mM) i roztwór NP do modułów przepływowych o natężeniu przepływu 125 μl/min i śledzić adsorpcję masy do warstwy Slp1. Adsorpcję masy można wykryć bezpośrednio, śledząc przesunięcia częstotliwości odnoszące się do równania Sauerbreya (równanie 1).
    3. Po zakończeniu interakcji metal z metalem NP należy przepłukać warstwę buforem wolnym od metalu/NP, aby usunąć słabo związane lub słabo przyłączone metale lub nanocząstki.
      Uwaga: Ilustracja konfiguracji eksperymentalnej jest pokazana na rysunku 2.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Schematyczny projekt konfiguracji QCM-D z wykorzystaniem modułu przepływowego QFM 401*66. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Rejestracja i ocena danych:
    1. Rejestruj zmiany częstotliwości w Hz (Δfn) i rozpraszaniu (ΔDn) w eksperymentach QCM-D za pomocą oprogramowania specyficznego dla QCM-D.
    2. Do oceny czułości zaadsorbowanej masy (Δm) należy zastosować równanie/model Sauerbreya (równanie 1) 65 66, który jest ważny dla cienkich i sztywnych warstw sprzężonych bez tarcia z powierzchnią czujnika przyłożonych don-tego alikwotu. Termin C (stała Sauerbreya) dla zastosowanego czujnika kwarcowego 5 MHz AT wynosi 17,7 ng ∙ Hz-1 ∙ cm-268. W przypadku sztywnych, równomiernie rozłożonych i wystarczająco cienkich warstw adsorbowanych należy użyć równania 1 jako dobrego przybliżenia.
      figure-protocol-3
    3. Wykonaj dodatkowe modelowanie zgodnie z modelem Kelvina-Voigta obowiązującym dla cząsteczek lepkosprężystych 68-71 za pomocą oprogramowania specyficznego dla producenta i porównaj wyniki z modelem Sauerbreya.
    4. Do obliczenia grubości warstwy i adsorpcji masowej należy użyć jako ważnego parametru modelowania gęstości warstwy zaadsorbowanej wynoszącej 1,35 g ∙ cm-3, odpowiadającej wartościom opisanym wcześniej dla białek warstwy S 72-75. Tę samą wartość należy zastosować do obliczenia interakcji metalu z warstwą białkową.

7. Pomiary AFM

  1. Wykonuj badania z w pełni sprawnym AFM na odwróconym mikroskopie optycznym.
    1. Rejestruj obrazy AFM w cieczy za pomocą buforu rekrystalizacyjnego lub ultraczystej wody bezpośrednio na powlekanych czujnikach QCM-D.
    2. Po eksperymentach QCM-D przepłucz czujniki ultraczystą wodą i umieść je w komorze płynu AFM. Dlatego należy użyć zamkniętej komórki płynu o całkowitej objętości około 1,5 ml. Utrzymywać stałą temperaturę ogniwa płynu na poziomie 30 °C.
    3. Użyj wspornika o częstotliwości rezonansowej ≈ 25 kHz w wodzie i sztywności <0,1 N/m. Dostosuj prędkość skanowania w zakresie od 2,5 do 10 μm/s.
    4. Rób zdjęcia w dynamicznym trybie kontaktowym, gdy wspornik jest wzbudzany przez piezoelektryczny o częstotliwości rezonansowej. Określ odległość wspornika od powierzchni za pomocą tłumienia drgań 76,
      Uwaga: Obrazy wysokości są wyświetlane w skali z, podczas gdy wartości z reprezentują dokładną topografię powierzchni. Obrazy amplitudy (pseudo 3D) są wyświetlane bez skali z, ponieważ wartości Z amplitudy zależą od parametrów skanowania i zawierają ograniczone informacje. Analiza obrazów została przeprowadzona przy użyciu trzech różnych programów ewaluacyjnych 77.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla mikroorganizmów i charakterystyka Slp1

Zarejestrowane dane dotyczące wzrostu bakterii wskazują na koniec fazy wzrostu wykładniczego po około 5 godzinach. Wcześniejsze badania wykazały, że Slp1 można wyizolować z tego punktu zbioru (4,36 g/l mokrej biomasy (≈ 1,45 g/L (BDW)) z maksymalną wydajnością 19. Niemniej jednak optymalizacja uprawy poprzez zastosowanie zdefiniowanych składników pożywek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy badano wiązanie Au z białkami warstwy S przy użyciu kombinacji różnych metod analitycznych. W szczególności wiązanie Au jest bardzo atrakcyjne nie tylko dla odzysku Au z wód kopalnianych lub roztworów procesowych, ale także dla budowy materiałów, np . powierzchni sensorycznych. Do badań interakcji Au (Au(III) i Au(0)-NPs) z zawieszoną i rekrystalizowaną monowarstwą Slp1 białko musiało zostać wyizolowane. Dlatego badanie to wykazało udaną hodowlę szczepu bakterii Gram-dodatnich L. sphaericu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna praca została częściowo sfinansowana przez IGF-projekt "S-Sieve" (490 ZBG/1) finansowany przez BMWi oraz BMBF-projekt "Aptasens" (BMBF/DLR 01RB0805A). Specjalne podziękowania dla Tobiasa J. Günthera za jego cenną pomoc podczas studiów AFM oraz dla Erika V. Johnstone'a za przeczytanie rękopisu jako native speakera języka angielskiego. Ponadto autor tego artykułu pragnie podziękować Aline Ritter i Sabrinie Gurlit (z Institute for Resource Ecology za pomoc w pomiarach ICP-MS), Manji Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava oraz grupie biotechnologicznej z Helmholtz-Institute Freiberg for Resource Technology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
sprzęt i oprogramowanie
Bioreaktor, system pilotażowy Steam In Place 70LApplikon Biotechnology, HolandiaZ6XZawiera czujniki pH dO2, czujniki pH Applikon Biotechnology i oprogramowanie BioXpert V2
Nieinwazyjny monitor biomasy BugEye 2100BugLab, Concord (CA), USASpektrometr --- Z9X
Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech, Wielka Brytania80-2109-10Firma teraz GE Healthcare Nauki przyrodnicze
MiniStar mikrowirówkaVWR, Niemcy521-2844Do wirowania próbek hodowlanych
Mikroskop systemu badawczego BX-61Olympus Germany LLC, Niemcy037006Mikroskop w połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania
Cell^P (wersja 3.1)Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü nster, Niemcy---razem z mikroskopem
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-SCarr Centritech, Floryda, USA9010PLTDo zbioru biomasy
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik, Niemcy431-2601Do usuwania wici i homogenizacji próbki
Wirówka Superspeed Sorvall Evolution RCThermo Fisher Scientific, USA728411Stosowany w izolacji białek
Mobilny procesor płynów szybkotnących, M-110EH-30 PilotMicrofluidics, Massachusetts, USAM110EH30KUżywany do pękania komórek
Alpha 1-4 LSC LiofilizatorMartin Christ Liofilizatory LLC, Osterode, Niemcy102041---
UV-VIS spektrofotometria (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific, USA91-ND-2000C-LDo oznaczania białka stężenie
Pionowa komora do elektroforezy Mini-PROTEANBio-Rad Laboratories GmbH, Monachium, Niemcy165-3322Do SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000Bio-Rad Laboratories GmbH, Monachium, Niemcy1708030Służy do obrazowania żeli SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer, Waltham (MA), USAN8120536Do oznaczania stężenia metalu
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire, Wielka BrytaniaZEN3600Do oznaczania wielkości nanocząstek
Urządzenie Q-Sense E4 Q-Sense AB, Göteborg, SzwecjaQS-E4zamówiony przez LOT quantum design (oprogramowanie dołączone do platformy E4)
Q-Soft 401 (rejestracja danych)Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja
Q-Tools 3 (ocena i modelowanie danych)Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja
Moduły przepływu QCM-D QFM  401 Q-Sense AB, Göteborg, SzwecjaQS-QFM401zamówiony przez LOT quantum design
QSX  303 SiO2 piezoelektryczne czujniki kwarcowe AT-cutQ-Sense AB, Göteborg, SzwecjaQS-QSX303zamówione przez LOT quantum design
Komora do czyszczenia ozonuBioforce Nanoscience, Ames (IA), USAQS-ESA006zamówione przez LOT quantum design
Mikroskop sił atomowych MFP-3D Bio AFMAsylum Research, Santa Barbara (CA), USAOprogramowanie do pomiarów i obrazowania AFMMFP-3DBio
Oprogramowanie AFM Asylum Research AR Version 120804+1223Asylum Research, Santa Barbara (CA), USAoprogramowanie do obrazowania zawarte w Cat. Nie. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 OprogramowanieWaveMetrics, Inc., USAoprogramowanie do obrazowania zawarte w Cat. Nie. MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research, Santa Barbara (CA), USAPodgrzewaczpróbek do pomiarów AFM
Mini wspornik Biolever,  BL-AC40TS-C2Olympus Niemcy LLC, Niemcy  BL-AC40TS-C2Preferowany wspornik do pomiarów AFM
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)Nanotec Electronica S.L. , Hiszpaniadarmoweoprogramowanie do analizy
AFMNazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Detergenty i inne akcesoria
kwas kwaśny, 100 % rocznieCARL ROTH GmbH+CO. KG3738.5Niebezpieczne, łatwopalne i ciecze i pary. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu.
Przeciwpieniący 204Sigma-Aldrich Co., LLC.A6426Do tłumienia piany
błękit bromofenolowy, sól sodowaSigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
Coomassie Błękit brylantowy R (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO. KG3862.1---
Deoksyrybonukleaza II ze śledziony świńskiejSigma-Aldrich Co., LLC.D4138Typ IV , 2,000 - 6,000  Kunitz jednostek/mg białka
Etanol, 95%VWR, Niemcy20827.467Niebezpieczeństwo, gliceryna łatwopalna
, p.a.CARL ROTH GmbH+CO. KG3783.1---
Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
Kwas solny (HCl) (37%)CARL ROTH GmbH+CO. KG4625.2Niebezpieczeństwo; , używany do regulacji pH
Lizozym z białka jaja kurzegoSigma-Aldrich Co., LLC.L6876 Liofilizowany proszek, białko = 90 %, = 40 000 jednostek/mg białka (Sigma) 
Mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem,  MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG, Niemcy504.10100.00Standardowe mieszadło w eksperymencie
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
Kwas azotowy (HNO3)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN50.1Niebezpieczeństwo; Utleniający,
PageRuler Niebarwiona drabinka białkowaThermoScientific-Pierce26614---
Poli(4-styrenosulfonian sodu) (PSS)Sigma-Aldrich Co., LLC.243051Średnia Mw ~ 70 000
Polietyleninina (PEI), oddziałSigma-Aldrich Co. LLC.408727Ostrzeżenie; Szkodliwy, drażniący, niebezpieczny dla środowiska; średnia Mw ~ 25 000
Węglan potasu bezwodny (K2CO3)Sigma-Aldrich Co. LLC.60108Ostrzeżenie; Szkodliwa
rybonukleaza A z trzustki bydlęcej Sigma-Aldrich Co., Sp. z o.o.R5503Typ I-AS, 50 - 100 jednostek Kunitza/mg białka 
Azydek sodu (NaN3)Merck KGaA106688Niebezpieczeństwo; bardzo toksyczny i niebezpieczny dla środowiska
Chlorek sodu (NaCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG3957.2---
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich Co., LLC.L-5750Niebezpieczeństwo; toksyczny
wodorotlenek sodu (NaOH)CARL ROTH GmbH+CO. KG6771.1Niebezpieczeństwo; , stosowane do regulacji pH w uprawie i regulacji pH
Spectra/Por 6, membrana do dializy, MWCO 50 000 CARL ROTH GmbH+CO. KG1893.1---
Kwas siarkowy (H2SO4)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN52.2Niebezpieczeństwo; , stosowany do regulacji pH w uprawie
Kwas garbnikowy (C76H52O46)Sigma-Aldrich Co. LLC.16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG9090.2---
Triton X-100CARL ROTH GmbH+CO. KG3051.3Ostrzeżenie; Szkodliwe, niebezpieczne dla środowiska
VIVASPIN 500, 50 000 MWCO Rurki ultrafiltracyjneSartorius AGVS0132---
β-merkaptoetanolSigma-Aldrich Co., LLC.M6250Niebezpieczeństwo, toksyczny
------

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705(2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka warstwy Ssorpcja z otaanaliza QCM Ddetekcja ICP MSobrazowanie AFMmonowarstwa Slp1wi zanie metalirekrystalizacja bia ekadsorpcja nanocz steczek

Powiązane artykuły