Dyfuzyjna spektroskopia optyczna do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu modelu mysiego

Summary

Prezentujemy metodę rozproszonej spektroskopii optycznej (DOS), która dostarcza ilościowych biomarkerów optycznych reakcji skóry na promieniowanie. Opisujemy projekt oprzyrządowania DOS, algorytmy ekstrakcji parametrów optycznych i procedury postępowania ze zwierzętami wymagane do uzyskania reprezentatywnych danych z przedklinicznego mysiego modelu rumienia wywołanego promieniowaniem.

Abstract

Ostra toksyczność skórna spowodowana promieniowaniem jonizującym (IR) jest częstym skutkiem ubocznym kursów terapeutycznych radioterapii wiązką zewnętrzną (RT) i negatywnie wpływa na jakość życia pacjenta i długoterminowe przeżycie. Postępy w zrozumieniu szlaków biologicznych związanych z normalną toksycznością tkankową pozwoliły na opracowanie leków interwencyjnych, jednak obecne badania odpowiedzi są ograniczone ze względu na brak wskaźników ilościowych do oceny nasilenia reakcji skórnych. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na rozproszonej spektroskopii optycznej (DOS), które dostarcza ilościowych biomarkerów optycznych reakcji skóry na promieniowanie. Opisujemy projekt oprzyrządowania systemu DOS, a także algorytm inwersji do ekstrakcji parametrów optycznych. Wreszcie, aby wykazać przydatność kliniczną, przedstawiamy reprezentatywne dane z przedklinicznego mysiego modelu rumienia wywołanego promieniowaniem i porównujemy wyniki z powszechnie stosowaną oceną wizualną. Opisana metoda DOS oferuje obiektywną, wysokoprzepustową ocenę toksyczności skórnej poprzez odpowiedź funkcjonalną, którą można przełożyć na warunki kliniczne.

Introduction

Technologiczne ulepszenia w planowaniu i dostarczaniu radioterapii (RT) pozwalają teraz na dostarczanie wysoce konforemnych dawek terapeutycznych do obszaru guza, jednocześnie oszczędzając normalne otaczające struktury. Jednak ostra, a czasem ciężka toksyczność jest nieunikniona, gdy docelowa wysoka dawka znajduje się w bliskiej odległości od skóry. Jeśli jest wystarczająco poważne, wynikające z tego normalne uszkodzenie tkanek może negatywnie wpłynąć na wynik leczenia RT i jakość życia pacjenta^1,2.

Pomimo szkodliwych konsekwencji, obecne leczenie popromiennego rumienia skóry pozostaje niespecyficzne, stosując kremy lub maści, które ignorują podstawowe mechanizmy biologiczne prowadzące do uszkodzeń. Podejścia te opierają się na minimalizowaniu objawów, a nie przyczyny. Co więcej, czas i podawanie terapii interwencyjnych jest skomplikowane ze względu na jakościowy i subiektywny charakter oceny popromiennych uszkodzeń skóry. Podczas gdy kilka uznanych organizacji (RTOG, EORTC) zapewnia wizualne zalecenia dotyczące klasyfikacji, instytucje różnią się pod względem wyboru preferowanej punktacji, co zaciemnia porównania normalnej toksyczności tkankowej dla celów metaanaliz. Co więcej, takie systemy klasyfikacji są prymitywne i podatne na zmienność między obserwatorami, tak że różnice w ciężkości obrażeń popromiennych mogą być niedostrzegalne w badaniach oceniających strategie redukcji toksyczności.

Zamiast wizualnie opisywać stopień rumienia w napromieniowanej skórze, alternatywnym podejściem jest mierzenie parametrów, które ilościowo opisują podstawowe zmiany fizjologiczne, które zachodzą w narządzie. Poziomy hemoglobiny we krwi (Hb), wysycenia tkanek tlenem (StO₂) lub hemoglobiny tlenowej (oxyHb) zostały wykorzystane jako wskaźniki zastępcze dla rumienia wywołanego promieniowaniem u myszy^3-6. Po napromieniowaniu całkowite poziomy Hb ulegają wahaniom, ale oxyHb lub StO₂ ulegają charakterystycznemu wczesnemu gwałtownemu wzrostowi, po którym następuje spadek i kolejny, bardziej trwały wzrost^3,6. Gdy substancje drażniące są stosowane w celu wywołania rumienia skóry, poziomy oksyHb w naczyniach krwionośnych bezpośrednio korelują z nasileniem miejscowego rumienia i stanu zapalnego⁷.

Dyfuzyjna spektroskopia optyczna (DOS) wykorzystuje światło bliskiej podczerwieni do dostarczania funkcjonalnych informacji na temat biochemicznych i mikrostrukturalnych składników ważnych składników tkanek. Ta ilościowa, nieinwazyjna technologia optyczna oferuje metodę pomiaru indukowanego cytokinami rozszerzenia naczyń krwionośnych w naczyniach krwionośnych, które występuje podczas rumienia za pomocą funkcjonalnych substytutów stężenia Hb i StO₂. Ostatnie badania porównujące parametry mierzone przez DOS z kontrolowanymi metodami oceny klinicznej^8-11 wskazują na potencjał tej techniki w pokonywaniu ograniczeń nieodłącznie związanych z obecnymi systemami oceniania.

Tutaj opisujemy wewnętrzny, przenośny system DOS, który wykorzystuje funkcjonalne surogaty do ilościowego wykrywania różnic w toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem w przedklinicznym modelu myszy⁵. Opisana platforma może stanowić sposób standaryzacji oceny rumienia o wysokiej czułości do wczesnego wykrywania i subtelnego różnicowania interwencyjnej odpowiedzi na leki. Co więcej, przy niewielkich dostosowaniach, oprzyrządowanie może ostatecznie zostać wykorzystane klinicznie do monitorowania przy łóżku pacjenta w czasie rzeczywistym.

Protocol

Następujące metody są zgodne z wytycznymi Komitetu Etyki Opieki nad Zwierzętami Instytutu Badawczego Sunnybrook.

1. System spektroskopii odbicia dyfuzyjnego

1. Zbieraj rozproszone widma odbicia za pomocą ręcznej, światłowodowej sondy i przenośnego systemu akwizycji spektroskopowej, który został wcześniej opisany (Kim i in. 2010) i jest krótko omówiony na rysunku 1 (i powiązanych podpisach) pod kątem kompletności^1,2.

2. Przygotowanie mysiego modelu ostrego popromiennego uszkodzenia skóry

1. Zamów 6-tygodniowe myszy (najlepiej bezwłose, takie jak atymiczne lub SKH-1) i pozwól im zaaklimatyzować się w obiekcie dla zwierząt przez tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów. Zarezerwuj co najmniej 3 myszy dla nienapromieniowanej grupy kontrolnej i 5 myszy dla grupy napromieniowanej.
2. Przed pomiarami DOS i napromienianiem na linii bazowej oznacz myszy za pomocą dziurkaczy w uszach lub trwałych znaczników na ogonie. Jeśli myszy nie są nagie, usuń sierść z plamy skóry na boku o wymiarach 2 cm na 2 cm, ale może to spowodować podrażnienie skóry.

3. Akwizycja danych z dyfuzyjnej spektroskopii optycznej

1. Włącz zasilanie elektroniki.
2. W przypadku skórki myszy ustaw parametry sygnału dla oprogramowania do akwizycji, wpisując 25 ms dla czasu zbierania, 25 dla średnich sygnałów i 1 dla szerokości filtra boxcar. Parametry te zapewniają rozsądną równowagę między czasem akwizycji a sygnałem do szumu.
3. Korzystając z niestandardowego zaprogramowanego oprogramowania do akwizycji, automatycznie uzyskaj odczyt tła, R_bg (dioda LED wyłączona) i odbicie rozproszone w dwóch odległościach separacji źródło-detektor, pomiary R (260 μm, 520 μm), klikając przycisk "Uzyskaj". Całkowity czas akwizycji wynosi ~ 2 sek.
4. Wyłącz wszystkie fluorescencyjne światła w pomieszczeniu, naciskając włącznik światła w pomieszczeniu przed wykonaniem pomiarów.
   UWAGA: Światło fluorescencyjne w pomieszczeniu zakłóca wykryty sygnał (światła te wytwarzają zmienne w czasie natężenie światła, dlatego trudno je odjąć jako sygnał tła). Chociaż można zastosować żarówki, utrzymuj światła w pewnej odległości od sondy DOS, aby uniknąć wysokiego poziomu tła (i słabego sygnału do szumu).

4. Znieczulenie zwierząt i podstawowe pomiary DOS

1. Przygotuj aparat do znieczulenia, upewniając się, że wszystkie połączenia są nienaruszone, a poziom płynnego izofluranu jest odpowiedni. Użyj komory indukcyjnej znieczulenia z dołączoną rurką i stożkiem nosowym, które można przykleić taśmą do wysterylizowanej, miękko wyściełanej powierzchni w wygodnym zasięgu sondy DOS.
2. Znieczulać jedną klatkę myszy na raz w komorze indukcyjnej, indukując 4% izofluranem przez 30 sekund. Zmniejsz ilość izofluranu do 2% przez następne 2 minuty. Sprawdź, czy mysz jest znieczulona, obserwując brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi kończyny tylnej.
3. Szybko przenieś jedną mysz na wysterylizowany obszar sondowania DOS, połóż ją na boku, przymocuj jej pysk do stożka nosowego i otwórz rurkę stożka nosowego na przepływ znieczulenia (2% izofluranu).
   UWAGA: Jeśli zabieg trwa dłużej niż 1 - 2 minuty, nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
4. Przed uzyskaniem pomiarów skóry myszy wysterylizuj sondę, przecierając ją 70% etanolem. Nie sterylizuj skóry.
5. Delikatnie przyłóż sondę do skóry boku, uważając, aby nie rozproszyć miejscowego układu naczyniowego. Trzymaj sondę ręcznie przez cały czas trwania pomiaru.
6. Uzyskaj dane dotyczące współczynnika odbicia, badając obszar poszycia bocznego o wymiarach około 2 cm na 2 cm (obszar, który ma być napromieniowany), podążając za formacją 5 kropek na matrycy. Utrzymuj ten wzór sondowania, obszar, ciśnienie sondy i stronę korpusu (po lewej lub prawej) za spójne dla wszystkich kolejnych pomiarów.
   UWAGA: Pełne skanowanie trwa około 60 sekund. Ciśnienie w sondzie powinno być wystarczające, aby uzyskać skan bez rozpraszania miejscowego układu krwionośnego.
7. Przenieś mysz do klatki odzyskiwania i przesuń następną mysz do obszaru sondowania DOS. Powtarzaj kroki 4.2 - 4.6, aż wszystkie myszy zostaną zmierzone. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.

5. Napromienianie zwierząt

UWAGA: Ten protokół wymaga użycia promiennika, a przygotowanie zwierząt może wymagać dostosowania do potrzeb urządzenia naświetlającego. Podczas napromieniania tylko niewielki obszar skóry bocznej powinien być wystawiony na działanie wiązki promieniowania. Promiennik powinien być umieszczony w sterylnym pomieszczeniu, a podczas powrotu myszy do sterylnego pomieszczenia należy przestrzegać odpowiedniej sterylizacji w klatce.

1. Przygotować aparat do znieczulania (jak w krokach 4.1 - 4.2) i znieczulać jedną mysz na raz w komorze indukcyjnej przed przygotowaniem jej do napromieniania.
2. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej, delikatnie ściśnij skórę boku i umieść taśmę nad i pod rozciągniętą skórą, tworząc klapę.
3. Umieść mysz na stoliku z pleksiglasu i przykryj korpus niestandardowym przyrządem do ołowiu (działająca konstrukcja to prostokątne pudełko z dnem i co najmniej jednym końcem otwartym, wraz z bocznym okienkiem umożliwiającym przeciągnięcie poszycia boku). Przeciągnij klapkę skóry przez okienko przyrządu i delikatnie przyklej klapkę do sceny.
   UWAGA: Niestandardowy przyrząd do prowadzenia jest wystarczająco mały, aby unieruchomić mysz. Jeśli niestandardowy przyrząd nie unieruchomi całkowicie myszy, należy użyć dodatkowych środków ograniczających i/lub podać ketaminę (80 - 100 mg/kg) i ksylazynę (10 - 12,5 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe, aby utrzymać mysz unieruchomioną przez cały czas trwania procedury napromieniania.
4. Umieść stolik z pleksi za pomocą przyrządu i myszy w promienniku. Określ ustawienia (odległość skóry od źródła promieniowania rentgenowskiego, napięcie, czas trwania i natężenie prądu) i podaj żądaną dawkę (np. 11 cm od źródła promieniowania rentgenowskiego 160 kVp przez 2,5 minuty przy natężeniu 6,3 mA).
   UWAGA: Zachowaj OSTROŻNOŚĆ w przypadku źródła promieniowania rentgenowskiego, postępując zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania urządzenia, aby uniknąć oparzeń i uszkodzeń DNA.
   UWAGA: Atymiczne nagie myszy rozwijają wilgotne złuszczanie około 14 dni po napromieniowaniu w odpowiedzi na 35 Gy, ale tylko niewielkie, niejednolite złuszczanie przy 17 Gy.
5. Wyjmij aparat i mysz z promiennika, zdejmij osłonę, usuń taśmę i umieść ją w indywidualnej klatce regeneracyjnej. Przywróć mysz do normalnej wspólnej klatki po wyzdrowieniu ze znieczulenia. Powtórz kroki 5.2 - 5.4 dla wszystkich myszy i wykonaj pozorowaną operację na myszach kontrolnych.
6. Po napromieniowaniu zwierzęta należy trzymać w ich normalnych warunkach. Jeśli pojawi się nietypowe zachowanie (np. zgarbiona postawa, która może oznaczać ból), skonsultuj się z weterynarzem, aby zdiagnozować problem. Łagodzenie bólu może obejmować podawanie 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie lub zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii. Jeśli utrata masy ciała przekracza 20% normalnej masy ciała, trzymaj ją oddzielnie we własnej klatce i dostarczaj pokarm o wysokiej zawartości składników odżywczych.

6. Dalsze pomiary DOS

1. Monitoruj i mierz intensywność reakcji skórnej za pomocą ilościowej techniki DOS. Oględziny zmian skórnych i wcześniejsze prace sugerują, że można spodziewać się dużych zmian parametrów DOS (w stosunku do wartości wyjściowej) około 6 - 12 dni po napromienianiu^3,4. Ponieważ jednak znaczące zmiany mogą zachodzić jeszcze wcześniej lub później w zależności od modelu, inne punkty czasowe pomiaru mogą być przydatne do zbadania.
2. Skonfiguruj sprzęt DOS i kalibracje zgodnie z opisem w rozdziale 3.Przygotuj aparat do znieczulania i uzyskaj pomiary DOS zgodnie z opisem w rozdziale 4.

7. Przetwarzanie po przejęciu

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w poniższej sekcji są wykonywane przy użyciu niestandardowego programu stworzonego w środowisku oprogramowania o wysokiej wydajności. Stosowane są ustandaryzowane konwencje nazewnictwa dla każdego pliku akwizycji spektralnej, aby umożliwić przetwarzanie wsadowe. Wszystkie kroki są zilustrowane na rysunku 2.

1. Odejmij linię bazową (dolny poziom szumu) od wszystkich zmierzonych widm, w tym od odczytu tła.
2. Odejmij odczyt tła, R_bg (dioda LED wyłączona), uzyskany w kroku 3.3 od widma pomiaru, R_mierzy.
   UWAGA: W pozostałej części tego artykułu zakłada się, że wszystkie widma są odjętym poziomem szumu i tłem i określane jako_{R corr}.
3. Przeliczyć współczynnik R_corr na współczynnik odbicia bezwzględnego, R_abs, zgodnie z opisem w odniesieniach 1,2 w sekcji 1.
   1. Uzyskać względne pomiary współczynnika odbicia, Rrel, w fantomach Intralipid-20% fantomy (Fresenius Kabi, Szwecja) z rosnącymi 3% podwielokrotnymi frakcjami do 48% (tj. 3%,6%,9%, ..., 48%) i utworzyć wykres stężenia Rrel w funkcji Intralipid
   .
   2. Wygeneruj bezwzględny wykres R_abs w funkcji μ_s', używając równania dyfuzji dla współczynnika odbicia. ¹⁴
   3. Dopasuj szczyt obu krzywych i dopasuj oś x Rrel tak, aby pasowała do osi x_{R abs}.
   4. Przy danej długości fali i separacji źródło-detektor przeskaluj oś y za pomocą:
      
      UWAGA: W poniższej sekcji wszystkie dopasowania pomiarów będą odnosić się do R_abs.

8. Dopasowanie danych spektralnych

UWAGA: Poniższa sekcja przedstawia teorię i algorytm dopasowania używany do wyodrębniania parametrów funkcjonalnych skóry myszy. Aby zapoznać się ze wszystkimi zastosowanymi teoriami, należy zapoznać się z poniższymi artykułami^14-18 i odnośnikami w nich. Zakłada się, że wszystkie równania są zaprogramowane w wysokiej klasy środowisku oprogramowania naukowego (zawierającym wstępnie zaprogramowane moduły) powszechnie używanym w laboratoriach fizycznych lub inżynierskich.

1. Zaprogramuj funkcję opisującą widmo absorpcji, μ_a(λ) skóry jako sumę odpowiednich pojedynczych chromoforów w zakresie widmowym zainteresowania za pomocą równania:
   
   Tutaj H_b to całkowite stężenie hemoglobiny (g / L) , podczas gdy StO₂ to niejednostkowe nasycenie tlenem w zakresie od 0 do 1.
2. Uzyskaj oxy, , oraz deoxy, , widma hemoglobiny (przechowywane jako pliki tekstowe) z internetowej kolekcji Prahl¹⁹.
3. Zaprogramuj funkcję opisującą widmo rozpraszania skóry, , używając zależności potęgowej, gdzie A (^cm-1) jest wartością μ_s^' przy λ_o = 1 nm, a k jest współczynnikiem mocy zależnym od medium¹⁶.
4. Zaprogramować funkcję matematyczną dla przedniego modelu odbicia rozproszonego w oparciu o równania z odniesienia 14, które włączają równania spektralne z kroków 8.2 - 8.3 do funkcji modelu do przodu (tj. R(r, μ_a(λ), μ_s'(λ)) = R(r, H_b, StO₂, A, k).
   UWAGA: Chociaż istnieją różne modele, równanie teorii dyfuzji w stanie ustalonym zapewnia prosty i dokładny opis rozkładu światła w tkance.
5. Zaprogramować funkcję, która podniesie do kwadratu różnicę między widmami odbicia modelowanymi do przodu z sekcji 8.4 a zmierzonymi widmami odbicia.
6. Iteracyjnie zmieniaj H_{, b,} StO₂, A i k, aż funkcja różnicy najmniejszych kwadratów w sekcji 8.5 będzie najmniejsza. lsqcurvefit firmy MatLab może być użyty do automatycznego wykonania tego kroku.
7. Powtórz kroki 8.5 - 8.6, aby uzyskać parametry DOS (H_{, b}, StO₂, A i k) dla wszystkich zmierzonych zestawów danych odbicia.
8. Wykreśl względną zmianę parametru DOS z odpowiadającym jej unikalnym pomiarem bazowym, używając średniej z zestawu 3–5 znormalizowanych pomiarów punktowych sondy dla każdej myszy. Wykresy te są tworzone za pomocą polecenia wykresu MatLab.

9. Okres punktacji popromiennego zapalenia skóry

1. Monitoruj i oceniaj intensywność reakcji skórnej za pomocą jakościowej skali ocen (patrz skala ocen Douglasa i Fowlera²⁰) po napromienianiu co 48 godzin (można również zaobserwować zmiany w ciągu 3 - 24 godzin po napromienianiu). Dwóch zaślepionych śledczych jest idealnych. Robienie zdjęć za pomocą ręcznego aparatu i skali referencyjnej (tj. linijki) może pomóc w ocenach.
2. UWAGA: Ocenianie skóry co dwa dni po napromieniowaniu może pomóc w określeniu optymalnych czasów pomiaru DOS dla modelu. Częstsze ocenianie może przynieść ważne dane w zależności od modelu i pytania badawczego.
3. Wykreśl medianę każdej grupy w każdym punkcie czasowym. Porównaj grupy w określonych punktach czasowych lub medianę całkowitych obszarów pod każdą krzywą.
4. Po tym, jak myszy były obserwowane do punktu gojenia się skóry, który jest pożądany (np. 4 tygodnie), należy poddać myszy eutanazji odpowiednią (zatwierdzoną) metodą.

Results

Technika odbicia DOS stanowi obiektywną alternatywę dla tradycyjnych jakościowych metod oceny toksyczności skóry wywołanej promieniowaniem. Wizualne zmiany w wyglądzie skóry po toksycznych dawkach promieniowania objawiają się zmianami zarówno wielkości, jak i kształtu mierzonych widm odbicia. Oba są związane ze zmianami funkcjonalnymi w podstawowej mikrostrukturze komórkowej i fizjologicznym stanie tkanki. W tej sekcji dokonano przeglądu reprezentatywnych wyników z wcześniej opublikowanych prac Yohana i in. ^{2014 5}

.

Rysunek 3 (po lewej) pokazuje reprezentatywne widma (cienkie niebieskie linie) mierzone w odległości 260 μm od źródła w mysim modelu rumienia skóry 6 dni po napromieniowaniu 40 Gy. W porównaniu z napromienianiem wstępnym (ryc. 3, prawy panel) obserwuje się różnice w kształcie widma przy ~ 550-650 nm, prawdopodobnie z powodu wzrostu natlenionej hemoglobiny. Obserwuje się również niewielki wzrost bezwzględnego współczynnika odbicia, który jest skorelowany ze wzrostem mocy rozpraszania tkanek. Widma obserwowane w 6 dniu po napromieniowaniu korelowały z wizualnym wynikiem skóry wynoszącym 0,75.

Ocena zmian współczynnika odbicia po napromieniowaniu na wybranych długościach fal nie wykorzystuje pełnego spektrum odbicia, a także niesie ze sobą potencjalny problem wrażliwości na zakłócenia. Jednak dopasowanie pełnego spektrum pozwala na przekształcenie całego zestawu danych w intuicyjne biomarkery optyczne (H_{, b}, StO_{, 2}). Rysunek 3 przedstawia wynikowe pasowania (ciągła zielona linia) zmierzonych danych (cienka zaszumiona linia) przy użyciu równań przedstawionych w sekcji 4. Obserwuje się doskonałą zgodność, co potwierdza, że dobór bazowych chromoforów i kształt rozpraszania adekwatnie opisują model skóry myszy.

Ze względu na nieinwazyjny i samokalibrujący się charakter systemu DOS, pomiary mogą być wygodnie wykonywane przez wiele dni w różnych warunkach oświetleniowych. Rycina 4 przedstawia względne zmiany w StO₂ skóry dla różnych punktów czasowych (6, 9, 12 dni) w napromieniowanej kohorcie myszy (n = 8), podczas gdy rycina 5 pokazuje odpowiednie jakościowe wyniki reakcji skórnej. Obserwuje się postępujący wzrost stężenia_{StO 2}, który jest statystycznie różny w porównaniu z wartościami sprzed napromieniania przez wszystkie 3 dni (p < 0,05). Trendy te odzwierciedlają obserwowany wizualnie wzrost nasilenia uszkodzeń skóry, który osiąga szczyt w 12 dniu (średni wynik ~ 3), co pokazuje potencjał StO₂ jako wizualnego substytutu oceny (ryc. 5).

Należy zauważyć, że w ciągu 12 mierzonych dni nie zaobserwowano statystycznie istotnych zmian dla żadnego ze zwróconych biomarkerów optycznych dla nienapromieniowanej grupy kontrolnej (n=3) (dane nie pokazane). Zmiany w A i k mogą być również monitorowane w czasie (ryc. 6), co wskazuje, że właściwości rozpraszania skóry zmieniają się w odpowiedzi na promieniowanie.

Rysunek 1. Oprzyrządowanie DOS. (A) Schemat geometrii pomiaru współczynnika odbicia rozproszonego. (B) Sonda światłowodowa: Sonda optyczna składa się z liniowego układu światłowodów o rdzeniu 200 μm, które są połączone w metalową igłę 18 G i oddalone od siebie o 260 μm. Dwa włókna źródłowe są sprzężone z dwiema szerokopasmowymi diodami elektroluminescencyjnymi, podczas gdy światłowód detekcyjny jest podłączony do spektrometru optycznego. Poprzez sekwencyjne włączanie każdego ze źródeł, spektrometr może zbierać rozproszone odbicie w odległościach 260 μm i 520 μm od każdego ze źródeł włókien. (C) Kompletny system DOS, w tym laptop, dołączona sonda światłowodowa i skrzynka optyczna: Zautomatyzowany program do akwizycji danych służy do sterowania sekwencyjnym zbieraniem widm. Elektronika jest umieszczona w skrzynce akwizycyjnej, która łączy się z sondą światłowodową za pomocą złączy SMA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Przetwarzanie spektralne. Wszystkie skale osi x są podane w nm: (A) Surowe widma względne, linia bazowa to odczyt w przybliżeniu między 900 - 1,000 nm i w przybliżeniu równy sygnałowi tła. (B) Względne czytanie w tle. (C) Widma względne odjęte od tła i linii bazowej. (D) Widmo bezwzględnie skalibrowane po przeskalowaniu przetworzonych widm pokazanych w (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Typowe widma odbicia światła białego dla nienapromieniowanej (po lewej) i napromieniowanej (po prawej) skóry myszy 6 dni po napromieniowaniu. Zazwyczaj obserwowano doskonałą zgodność między pomiarem (hałaśliwy niebieski) a pasjami (ciągły zielony). Zaobserwowano dwie kluczowe różnice między obiema grupami: 1) ogólny wzrost bezwzględnego współczynnika odbicia i 2) wyraźną zmianę kształtu widmowego w zakresie 550 - 600 nm. Za zgodą Yohan i in. 2014⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Zmiana frakcji natlenienia skóry myszy po napromieniowaniu 40 Gy. Wyjściowa średnia znormalizowana różnica między dwiema grupami (na mysz) jest istotna dla dni 6 (ramka 1), 9 (ramka 2) i 12 (ramka 3). Za zgodą Yohan i in. 2014⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Średnie jakościowe wyniki reakcji skórnych (n = 8) w funkcji dni po napromieniowaniu skóry myszy 40 Gy. Na podstawie Yohan i in. 2014⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Względne zmiany w A i k skóry myszy po napromieniowaniu 40 Gy w dniu 6 (ramka 1), 9 (ramka 2) i 12 (ramka 3). Stwierdzono, że zmiana wartości A (lewa strona) i k (prawa strona) w dniu 6 (ramka 1, lewa i prawa strona) była istotna (p < 0,026). Za zgodą Yohan i in. 2014⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Przedstawiono podejście DOS do ilościowej oceny toksyczności popromiennej skóry przy użyciu biomarkerów optycznych. Systemy oceny wizualnej toksyczności skórnej wymagają specjalistycznego szkolenia, a nawet wtedy są podatne na zmienność i subiektywność między obserwatorami. System DOS i oprogramowanie analityczne są proste w obsłudze, wymagają minimalnego szkolenia i zwracają obiektywne parametry funkcjonalne do interpretacji zmian fizjologicznych w skórze. Ponadto, zamiast opisywać wygląd zmiany skórnej jako pojedynczy parametr, DOS dostarcza bogactwa informacji o kształcie spektralnym, właściwościach optycznych i parametrach funkcjonalnych / mikrostrukturalnych, które oferują dodatkowy stopień czułości i swoistości niedostępny w obecnych metodach oceny jakościowej. Sekcje 1 i 7 podkreślają główne etapy przetwarzania w celu uzyskania bezwzględnych danych spektralnych, które można wykorzystać do ilościowego dopasowania biomarkerów optycznych. Odejmowanie tła i linii bazowej jest niezbędne, aby umożliwić użytkownikowi wykonywanie pomiarów DOS w normalnych warunkach oświetleniowych. Sekcja 8 zawiera niezbędne modele i równania potrzebne do opisania myszy atymicznych przed i po napromieniowaniu rentgenowskim. W tym przypadku dobór odpowiednich absorberów ma kluczowe znaczenie dla dokładnego opisu mierzonych widm. Zaleca się, aby użytkownik dokładnie zapoznał się z literaturą kluczowych absorberów, które dominują w zakresie długości fal i tkanki będącej przedmiotem zainteresowania wykorzystanej w danym badaniu, przed skonstruowaniem optycznego modelu dopasowania biomarkera. Wreszcie, sekcje 3-5 opisują postępowanie z myszami atymicznymi podczas akwizycji DOS. Aby uniknąć zakłócenia miejscowego układu naczyniowego, użyj delikatnej siły, aby umieścić sondę DOS na powierzchni skóry myszy.

Chociaż jest to stosunkowo niedrogie w porównaniu z systemami kamer hiperspektralnych^3,4, wyraźnym ograniczeniem opisywanego podejścia DOS jest użycie sondy punktowej do pomiaru rozproszonego współczynnika odbicia. Ta geometria odbicia wymaga delikatnego kontaktu ze skórą i może wprowadzać niepewność pomiaru poprzez rozpraszanie układu naczyniowego, jeśli nie stosuje się stałego nacisku sondy na skórę. Przyszłe projekty sondy DOS mogą zawierać czujnik ciśnienia, aby utrzymać spójne wyniki. Ponadto, podczas gdy zastosowanie bliskiej separacji między źródłem a detektorem (< 2-3 mm) pozwala na optyczne głębokości sondowania specyficzne dla powierzchni skóry, poprawa specyficzności wiąże się z utratą rozdzielczości przestrzennej w porównaniu z obrazowaniem hiperspektralnym 2D. Aby zminimalizować to ograniczenie, zastosowano 5-punktowy skan kwadrantowy, który rejestruje całkowitą objętość napromieniowania. Pomimo braku rozdzielczości przestrzennej, wcześniejsze prace na myszach⁵ wykazały zdolność biomarkerów optycznych uśrednionych na rzadkim obszarze do różnicowania nie tylko napromieniowanej i nienapromieniowanej skóry, ale także wpływu oszczędzających skórę leków interwencyjnych, takich jak Vasculotide⁶.

Należy zauważyć, że chociaż ogólny projekt systemu może być modyfikowany dla różnych modeli skóry, podstawowe widma bazowe i kształt rozpraszania mogą wymagać optymalizacji. W szczególności, podczas gdy oxy- i deoksy-Hb dobrze opisują atymiczny model myszy, zastosowanie tego samego modelu na ciemniejszej skórze może wymagać dodania melaniny w celu optymalnego dopasowania. Ponadto rozszerzenie pasma DOS na wyższe długości fal > 950 nm wymagałoby dodania wody, która dominuje na wyższych długościach fal. Co więcej, modele zwierzęce o różnych grubościach skóry mogą wymagać innej separacji między źródłem a detektorem, aby zoptymalizować czułość głębokości. Wreszcie, funkcja bezwłosa upraszcza algorytmy. Chociaż modele bezwłose mogą być optymalne dla niektórych pytań badawczych, będą wymagały usunięcia włosów przed pomiarami DOS, a podrażnienie skóry spowodowane tym procesem może wpłynąć na wyniki. W przypadku badań, w których kluczowa jest całkowita funkcja immunologiczna, immunokompetentna mysz bezwłosa (np. SKH-1) może służyć jako lepszy model ze względu na jej eutymiczny charakter.

Ważnymi kwestiami przy pomiarach sondą DOS są spójny RT i oszacowanie napromieniowanego obszaru. Wahania temperatury mogą wpływać na poziomy Hb i StO₂ w tkankach. Pomiar grupy 3 nienapromieniowanych zwierząt w każdym czasie zbierania danych może służyć jako punkt odniesienia, do którego można znormalizować niezamierzone wahania wartości parametrów w środowisku. Dodatkowo, napromieniany obszar może być trudny do oszacowania (jeśli preparaty płatów skórnych nie były spójne), zanim uszkodzenie zacznie objawiać się wizualnie około 5 dnia (40 Gy). Jeśli używasz czarnego markera permanentnego do wykropkowania granic skóry wystawionej na promieniowanie, unikaj nadmiernego użycia atramentu, aby zapobiec rozmazywaniu atramentu, co może pogorszyć odczyty.

Dodatkową cechą systemu jest możliwość oddzielenia właściwości absorpcyjnych od rozpraszających. Podczas gdy alternatywne systemy obrazowania hiperspektralnego również zapewniają możliwość monitorowania tlenu Hb i stężenia Hb, geometria obrazowania hiperspektralnego w wolnej przestrzeni nie jest w stanie rozwiązać zmian rozpraszania. Ograniczenie to może skutkować niedokładnościami w zwracanych parametrach oxyHb, Hb i StO₂ w przypadku wystąpienia istotnych zmian w rozpraszaniu z powodu rumienia (zaczerwienienia). Co więcej, monitorowanie zmian rozpraszania za pomocą DOS może dostarczyć dodatkowych biomarkerów optycznych do oceny rumienia. Jak pokazano na rysunku 6, wstępne wyniki Yohana i in. (2014) wskazują, że A i k wykazują trend czasowy po promieniowaniu jonizującym, który nie koreluje z trendami obserwowanymi za pomocą innych alternatywnych metod, takich jak wizualne systemy punktacji. Wskazuje to, że zmiany rozpraszania nie manifestują się w sposób wizualnie opisowy i mogą w rzeczywistości opisywać odrębny proces biologiczny. W związku z tym, w porównaniu z alternatywnymi metodami, DOS zapewnia wysoką rozdzielczość dla powierzchownych zmian rozpraszania, co jest drogą do badania nowych biomarkerów uszkodzeń skóry, które mogą być niezależne od zwykłych pomiarów opartych na Hb.

Chociaż nasz model wykorzystuje dużą pojedynczą dawkę promieniowania (zamiast wielu małych dawek frakcjonowanych, które są stosowane w warunkach klinicznych), naśladuje to patofizjologię ostrej radiotoksyczności ludzkiej skóry²¹. Przewiduje się, że wraz z dalszą optymalizacją, DOS może zapewnić ilościowe podejście do zautomatyzowanej i standaryzowanej oceny reakcji skórnych wywołanych promieniowaniem. Po opanowaniu tej techniki, przyszłe zastosowania mogą obejmować monitorowanie różnic między terapiami oszczędzającymi skórę (np. porównywanie poziomów oxyHb między kontrolnym a eksperymentalnym leczeniem radioprotekcji skóry lub wspomaganiem gojenia się ran). Chociaż system DOS idealnie nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w modelach zwierzęcych, można go potencjalnie dostosować do środowiska klinicznego ze względu na łatwość obsługi i możliwość pomiaru w normalnych warunkach oświetleniowych. W takim przypadku konstrukcja sondy może wymagać niewielkich modyfikacji z nieco większymi separacjami optodowymi, aby uwzględnić zwiększoną grubość ludzkiej skóry. Kliniczny system DOS pozwoliłby na ocenę on-line terapii interwencyjnych, które mogłyby zminimalizować bolesne reakcje skórne oraz poprawić komfort pacjenta i przestrzeganie zaleceń lekarskich. W przyszłości interesujące może być rozszerzenie kwantyfikacji opartej na DOS na cechy przewlekłego uszkodzenia skóry wywołanego promieniowaniem (np . zwłóknienia).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nagie myszy	np. Charles River	Athymic nude Crl:NU(NCr)-Foxn1nu, lub immunokompetentne nago Crl:SKH1-Hrhr
Grzejnik dla małych zwierząt	np. Faxitron X-Ray Corp.	Faxitron CP160
Znieczulenie zwierząt			Jeśli używasz parownika izofluranu z komorą indukcyjną, potrzebujesz rurki i stożka nosowego.
Przyrząd ołowiany i stolik z pleksi	Wykonane		Jeśli promiennik naraża całe ciało zwierzęcia na promieniowanie, należy użyć osłony ołowianej, aby odsłonić tylko płat skóry.
Taśma medyczna
Marker permanentny/dziurkacz
Matlab	Mathworks Inc., Natick, MA		Ze statystykamiToolbox
Labview	National Instruments, Vaudreuil-Dorian,
			DOS
Multiplekser optyczny	Ocean Optics, Dunedin, FL	Model MPM-2000
Spektrometr	Ocean Optics, Dunedin, FL	Model S200
Źródło światła białego	Ocean Optics, Dunedin, FL	Model LS-1
Intralipid-20%	Kabi Pharmacia, Nowy Jork, NY
Norma odbicia	INO, Quebec City, QB