Artykuł metodologiczny

Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki

DOI:

10.3791/53577

⸱

11 marca 2016

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, NYU School of Medicine, 2Harkness Eye Institute, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera siatkówkę czuciową poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego, które gromadzą się jako lipofuscyna. Produkty te są autofluorescencyjne i mogą być jakościowo obrazowane in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny RPE za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) jest zestawiony z leżącą nad nim siatkówką czuciową i wspiera funkcję układu wzrokowego. Wśród zadań wykonywanych przez RPE znajdują się fagocytoza i przetwarzanie zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez organelle pochodzące z lizosomów. Te produkty degradacji, przechowywane i określane jako granulki lipofuscyny, składają się częściowo z bisretinoidów, które mają szerokie widma absorpcji i emisji fluorescencji, które można wykryć klinicznie jako autofluorescencję dna oka za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO). Akumulacja lipofuscyny jest związana z postępującym wiekiem, ale występuje również w różnych wzorcach zarówno w nabytych, jak i dziedzicznych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. W związku z tym badanie wzorca akumulacji i korelowanie takich wzorców ze zmianami w leżącej nad nią siatkówce czuciowej jest niezbędne do zrozumienia patofizjologii i postępu choroby siatkówki. Tutaj opisujemy technikę stosowaną przez nasze laboratorium i inne, która wykorzystuje cSLO w celu ilościowego określenia poziomu lipofuscyny RPE zarówno w zdrowych, jak i chorych oczach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera funkcję siatkówki czuciowej poprzez liczne procesy 1. Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest najważniejszą przyczyną nieuleczalnej ślepoty w krajach uprzemysłowionych i charakteryzuje się zmianami w RPE, w tym utratą pigmentu, utratą funkcji i atrofią. W AMD i przy normalnym starzeniu się RPE gromadzi fluorescencyjne organelle pochodzące z lizosomów zawierające fagocytozowane fragmenty fotoreceptorów, zwane granulkami lipofuscyny. Uważa się, że nagromadzenie lipofuscyny RPE wskazuje na dysfunkcję oksydacyjną 1, ale ostatnie badania wykazały, że morfologia RPE pozostaje normalna w starszych oczach z wysokim poziomem lipofuscyny 2. Jednak nieprawidłowe wzorce dystrybucji lipofuscyny, w szczególności utrata lipofuscyny, są udokumentowanymi markerami AMD i progresji AMD, zarówno histologicznie, jak i klinicznie 3,4

Wykazano również, że wadliwe przetwarzanie lipofuscyny RPE występuje w niektórych dziedzicznych zwyrodnieniach siatkówki. Pacjenci cierpiący na chorobę Stargardta (STGD) gromadzą lipofuscynę w RPE w młodym wieku, ostatecznie rozwijając utratę wzroku podobną do obserwowanej w AMD 5. Wyniki te sugerowały, że akumulacja lipofuscyny może sama w sobie być toksyczna i prowadzić do dysfunkcji RPE 6,7. Jednak szczegółowe badanie obrazowe osób z STGD w czasie nie potwierdziło, że ogniskowa akumulacja lipofuscyny doprowadziła do późniejszej utraty RPE 8. W związku z tym, chociaż nieprawidłowości lipofuscyny są markerami zwyrodnień siatkówki, rola bezpośredniej toksyczności lipofuscyny pozostaje nieudowodniona.

RPE to najbardziej tylna warstwa komórkowa siatkówki, ale generuje większość sygnału fluorescencyjnego z dna oka. Generowanie i detekcja autofluorescencji (AF) pochodzącej z RPE może być realizowana za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO), która pozwala na wizualizację przestrzennego rozkładu migotania oka dna oka. Niektóre zwyrodnienia siatkówki wykazują charakterystyczne wzorce migotania przedsionków dna, a obrazowanie AF pomaga w diagnozowaniu i monitorowaniu tych schorzeń. Chociaż standardowe obrazowanie AF ma znaczenie kliniczne, ilościowe migotanie przedsionków (qAF) stało się ważnym sposobem oceny stanu zdrowia RPE. Wraz z innymi opracowaliśmy ustandaryzowane podejście, które może wiarygodnie określić poziomy qAF w określonych lokalizacjach siatkówki 9. qAF ma potencjalne zastosowania w diagnostyce i monitorowaniu schorzeń siatkówki, a także może być przydatny w prognozowaniu i stratyfikacji ryzyka. Ponadto opisano również możliwości diagnostyczne qAF dla niektórych zaburzeń siatkówki 10-12. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe informacje na temat wykonywania naszej techniki wraz z wizualną demonstracją jej zastosowania w ocenie zdrowych i chorych oczu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszyscy pacjenci włączeni do tych badań zostali przeprowadzeni zgodnie z zatwierdzonym nadzorem instytucjonalnej komisji rewizyjnej w New York University School of Medicine.

1. Selekcja pacjentów i wstępne przygotowanie do obrazowania

Uwaga: Wymagane są następujące materiały: 0,5% roztwór okulistyczny tropikamidu, 2,5% roztwór oftalmiczny fenylefryny, cSLO wyposażony w optyczną tomografię koherentną w domenie spektralnej (SD-OCT) oraz odniesienie do fluorescencji wewnętrznej.

  1. Przed przystąpieniem do obrazowania należy odpowiednio skonfigurować cSLO do akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Zamontuj wewnętrzne odniesienie fluorescencyjne w cSLO. Uwaga: Wewnętrzny fluorescencyjny wzorzec, zakupiony od producenta, jest umieszczony w metalowym pierścieniu i jest umieszczony bezpośrednio za obiektywem aparatu. W przypadku zastosowania cSLO innego producenta może wystąpić inna konfiguracja niż opisana w tym protokole.
    1. Aby włożyć odniesienie do cSLO, przekręć obiektyw, aby go wyjąć, odkręć metalowy pierścień maszyny i zastąp go nowym metalowym pierścieniem zawierającym odniesienie.
      Uwaga: wewnętrzne odniesienie fluorescencyjne jest niezbędne dla techniki qAF, ponieważ umożliwia korekcję zmian mocy lasera i czułości/wzmocnienia detektora.
  3. Poproś pacjentów zrekrutowanych do obrazowania, aby poddali się rutynowemu badaniu rozszerzonych oczu i uzyskali podstawowe informacje na temat historii okulistycznej w przeszłości i podstawowych schorzeń, które mogą objawiać się wynikami ocznymi.
  4. Rozszerz źrenice 0,5% tropikamidu i 2,5% fenylefryny. ETAP KRYTYCZNY: Rozszerz źrenice do co najmniej 6 mm. Uwaga: Jest to niezbędne do nieprzerwanego przepływu światła, a tym samym do optymalnej wizualizacji i pomiaru dna oka.
  5. Przed przystąpieniem do badania obrazowego należy prawidłowo ułożyć pacjenta na cSLO, z podbródkiem opartym na podbródku, czołem opartym o oparcie czoła, a boczne kanty prawidłowo wyrównane ze wskaźnikami.

2. Podstawowe obrazowanie dna oka

  1. Najpierw zobrazuj dno oka za pomocą światła odbiciowego w bliskiej podczerwieni (IR) (długość fali 820 nm), aby scentralizować kamerę nad plamką żółtą i uzyskać zgrubną ostrość.
    1. Przy prawidłowym ustawieniu pacjenta przełącz ustawienia sprzętowe na panelu sterowania w tryb obrazowania w podczerwieni, ustaw kamerę ręcznie, aż dno oka będzie w pełni ostre i zrób zdjęcie
    2. Dostosuj ustawienie na panelu sterowania do "IR-OCT", które wykorzystuje optyczną tomografię koherentną w domenie spektralnej (SD-OCT) w połączeniu z obrazowaniem w podczerwieni w celu oceny plamki żółtej pod kątem choroby podstawowej.
    3. Skorzystaj z prowadnic znajdujących się w oknie obrazowania, aby prawidłowo zorientować OCT na obraz dna oka w podczerwieni. Aby uzyskać optymalną jakość SD-OCT, ustaw kamerę tak, aby obraz OCT znajdował się w górnej jednej trzeciej okna obrazowania. Uzyskaj co najmniej jeden skan linii poziomej przez dołek środkowy i obejmujący całe pole obrazowania.

3. Konfiguracja obrazowania qAF

  1. Użyj "Szybkiej" akwizycji obrazu. Uwaga: To ustawienie pozwala na szybszą akwizycję obrazu, co zmniejsza ryzyko utraty sygnału z powodu ruchu pacjenta i wynikającego z tego zablokowania światła przez tęczówkę lub powieki.
  2. Użyj ramek "Średnia z 9". Uwaga: To ustawienie pozwala na szybkie, sekwencyjne przechwytywanie 9 klatek obrazu, które można następnie "uśrednić" w celu redukcji szumów i artefaktów (patrz poniżej).
  3. Użyj pola "30 x 30 stopni". Uwaga: Odnosi się to do stopni obszaru siatkówki uchwyconego podczas akwizycji obrazu.
  4. Przed przystąpieniem do obrazowania należy ostrzec pacjenta przed niebieskim światłem, ponieważ na początku może to być niepokojące.
  5. Włącz tryb AF i ustaw oś aparatu tak, aby ekran był maksymalnie "wypełniony" AF dna oka (minimalne przyciemnienie boków i rogów obrazu).
    1. Jeśli pacjenci mają trudności z tolerowaniem jasnego niebieskiego światła, rozpocznij obrazowanie aparatem znajdującym się dalej od oka, a następnie powoli zbliżaj kamerę do pacjenta, aż dno oka będzie w pełni widoczne.
      KROK KRYTYCZNY: Jeśli światło wpadające do oka lub wychodzące z oka jest zasłonięte, spowoduje to zmniejszenie sygnału. Miejscowe zmniejszenie jest widoczne jako asymetryczne przyciemnienie boku lub rogu obrazu. Uogólniona utrata sygnału jest obserwowana, gdy same ruchy gałek ocznych blokują przepływ światła.
  6. Ustaw aparat w taki sposób, aby sygnał AF był na najwyższym poziomie w całym polu. Dąż do maksymalnego sygnału, a nie do najostrzejszego obrazu, jakkolwiek z grubsza są one skorelowane. Dostosuj ostrość kamery, przesuwając cSLO, aby zmienić położenie kamery ręcznie lub za pomocą joysticka oftalmoskopu.
  7. Dostosuj czułość/wzmocnienie tak, aby AF na dnie oka było dobrze widoczne, ale unikaj nadmiernego nasycenia. Podczas akwizycji obrazu kolorowe piksele widoczne zarówno w wewnętrznym odniesieniu (znajdującym się w górnej części obrazu), jak i na dnie obrazu, wskazują na przesycenie, a tym samym utratę sygnału.

4. Akwizycja obrazu

Uwaga: KRYTYCZNY KROK: Celem pozyskiwania obrazów powinno być uzyskanie 2 wysokiej jakości 9-klatkowych stosów obrazów na sesję, aby kontrolować zmienność między obrazami podczas sesji. Po zmianie położenia pacjenta i kamery należy przeprowadzić drugą sesję składającą się z dwóch obrazów, aby ocenić i kontrolować zmienność. Wszystkie obrazy zostaną ostatecznie skalibrowane do wewnętrznego odniesienia (opisanego poniżej).

  1. Obrazy należy wykonywać dopiero po co najmniej 20 sekundach od "wybielania" (pełnej ekspozycji siatkówki na światło AF), aby zminimalizować absorpcję światła przez rodopsynę w siatkówce czuciowej 9.
    1. Wykorzystaj ten okres, aby zoptymalizować wyrównanie, ostrość i czułość kamery.
  2. Spraw, aby fotografowane osoby mrugały przed każdym zrobieniem zdjęcia, ponieważ świeży film łzowy poprawia jakość sygnału.
  3. Omijaj powieki w płaszczyźnie akwizycji.
    Uwaga: Pomocne może być ręczne otwieranie powiek u trudniejszych pacjentów. Autorzy zalecają, aby zadanie to wykonał asystent.
  4. Zoptymalizuj wyrównanie przed każdym pobraniem obrazu, aby upewnić się, że światło nie jest zasłaniane przez tęczówkę, co skutkuje zmniejszeniem sygnału.
    Uwaga: Ponieważ co najmniej niewielki ruch jest bardzo powszechny, autorzy zalecają dokładne wyrównanie w razie potrzeby przed każdym akwizycją obrazu. Prowadzenie i zachęcanie pacjenta podczas obrazowania pomaga zmniejszyć ruch. Autorzy zalecają również używanie pedału nożnego maszyny jako "przycisku namierzania", aby zminimalizować rozproszenie uwagi operatora.
  5. Wykonaj przetwarzanie po obrazie, obliczając "średnią" stosu 9 klatek, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Oblicz średnią stosu za pomocą oprogramowania cSLO, wybierając opcję obliczenia średniej.
    Uwaga: Mogą istnieć stosy, w których niektóre ramki nie są optymalnej jakości (tj. mają zlokalizowany lub uogólniony zmniejszony sygnał w stosunku do optymalnych ramek), dlatego dokładnie sprawdź każdy stos i odznacz nieoptymalne ramki przed obliczeniem średniej.
    Uwaga: Średnie obrazy o akceptowalnym stosunku sygnału do szumu mogą być przetwarzane z co najmniej 3 klatek. To normalne, że boki i rogi każdego obrazu mają słabszy sygnał niż środkowe 20 stopni ze względu na ograniczenia w samym cSLO.
    1. Jeśli oprogramowanie zapyta, czy operator chciałby znormalizować poziomy szarości (tj. rozciągnąć histogram) w zakresie od 0 do 255, wybierz "Nie". Pozwala to zachować niezmienione poziomy szarości do analizy.

5. Analiza obrazu

  1. Analizuj obrazy AF zgodnie z wcześniejszym opisem za pomocą oprogramowania do analizy obrazu opracowanego dla techniki qAF (IGOR; 9). Krótki opis typowej analizy obrazu przy użyciu tego oprogramowania znajduje się poniżej.
    1. Załaduj program qAF do IGOR i zaimportuj obrazy (w formacie .bmp) wyeksportowane z oprogramowania cSLO o proporcjach pikseli 768 x 768 (domyślny parametr wyjściowy).
    2. Wybierz obraz z menu rozwijanego i rozpocznij analizę.
    3. Zmień położenie wskaźników kalibracji na obrazie w taki sposób, aby "krzyżyk" nakładał się na dołek środkowy, a "nawias" przylegał do tarczy nerwu wzrokowego (wskaźniki te służą do skalowania i pozycjonowania ROI). Po prawidłowym ustawieniu użyj podpowiedzi oprogramowania, a następnie wypełnij obraz obwodowymi ROI otaczającymi dołek środkowy (patrz rysunki 1, 2).
    4. Wybierz opcję w IGOR, aby skalibrować ogólne poziomy szarości każdego obrazu do poziomów obecnych w wewnętrznym odniesieniu fluorescencyjnym. Uwaga: Ten krok umożliwia kalibrację czynników związanych z maszyną, w tym elektronicznego poziomu zerowego każdego obrazu i wewnętrznego referencyjnego współczynnika kalibracji każdego urządzenia, a także czynników związanych z pacjentem, w tym wieku, refrakcji i krzywizny rogówki.
      Uwaga: Następnie oprogramowanie analityczne wyświetla stałe obszary na wynikowym obrazie, a wartość qAF jest demonstrowana w każdym regionie. Wartości qAF są również automatycznie wprowadzane do formatu arkusza kalkulacyjnego w osobnym oknie."
    5. Wygeneruj "mapy cieplne" qAF, wybierając opcję w wierszach poleceń. Wszystkie obrazy i dane można wyeksportować z oprogramowania IGOR w arkuszu kalkulacyjnym Excel, wybierając odpowiednie opcje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika została wykorzystana do zbadania qAF zarówno w zdrowych 13, jak i w stanach chorobowych 10-12. W zdrowych oczach (ryc. 1) migotanie przedsionków emitowane z RPE jest rozprowadzane stosunkowo równomiernie w całym dnie oka (ryc. 1A). Zmniejszona intensywność jest widoczna w centralnym obszarze plamki żółtej z powodu blokowania światła przez pigment plamki żółtej oraz po bokach i w rogach obrazu ze względu na optykę oka i ka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowa dystrybucja lipofuscyny RPE, niezależnie od tego, czy jest zwiększona, czy zmniejszona, jest wrażliwym markerem choroby siatkówki i jest na ogół związana z utratą funkcji siatkówki czuciowej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie qAF do oceny lipofuscyny RPE. Włączenie wewnętrznego fluorescencyjnego wzorca w celu skorygowania zmiennej mocy lasera i czułości detektora9 wraz z naszą ustandaryzowaną techniką obrazowania pozwala na wiarygodne ilościowe określenie poziomów AF. Naszym celem jest, aby ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STA: brak ujawnień, JPG: brak ujawnień, RTS: konsultant, Ocata Therapeutics.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować naszym współpracownikom, Francois Delori, Tomasowi Burke'owi i Tobiasowi Dunckerowi.

Wsparcie badań: NIH/NEI R01 EY015520 (RTS, JPG) oraz nieograniczone fundusze z Badań nad Zapobieganiem Ślepocie (RTB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spectralis HRA + OCTHeidelberg Engineering
0,5% roztwórMożna użyć dowolnej marki
2,5% roztwórMożna użyć dowolnej marki
Wewnętrzne odniesienie fluorescencyjneOprogramowanie Heidelberg Engineering
IGOR ProWaveMetrics
okulistyczny tropikamidu okulistyczny fenylefryny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).
  2. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 4832-4841 (2014).
  3. Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 56, 3242-3252 (2015).
  4. Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).
  5. Weng, J., et al. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell. 98, 13-23 (1999).
  6. Holz, F. G., et al. Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin. Investigative ophthalmology & visual science. 40, 737-743 (1999).
  7. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1981-1989 (2000).
  8. Smith, R. T., et al. Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD. Investigative ophthalmology & visual science. 50, 3907-3914 (2009).
  9. Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 9379-9390 (2011).
  10. Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 2841-2852 (2014).
  11. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 1471-1482 (2014).
  12. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy. Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).
  13. Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 5684-5693 (2013).
  14. Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects. Investigative ophthalmology & visual science. 42, 1855-1866 (2001).
  15. Sparrow, J. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2812-2820 (2013).
  16. Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. American National Standards Institute. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fundus AutofluorescenceRetinal Pigment EpitheliumConfocal Scanning Laser OphthalmoscopyLipofuscin QuantificationAge Related Macular DegenerationGeographic Atrophy AnalysisHigh Speed Image AcquisitionMean of 9 FramesInternal Fluorescent ReferencePupil Dilation Protocol

Powiązane artykuły