Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa technologia biomimetyczna: nowatorski biokauczuk tworzy zdefiniowane architektury w mikro i makroskali w hydrożelach kolagenowych

DOI:

10.3791/53578

⸱

12 lutego 2016

 ,  , 
1Department of Surgery - Division of General Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Chemical Engineering, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Innowacyjna technika biofabrykacji została opracowana w celu inżynierii trójwymiarowych konstrukcji, które przypominają cechy architektoniczne, komponenty i właściwości mechaniczne tkanki in vivo. Technika ta wykorzystuje nowo opracowany materiał protektorowy, kauczuk BSA, który przenosi szczegółowe cechy przestrzenne, odtwarzając architekturę in vivo szerokiej gamy tkanek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rusztowania tkankowe odgrywają kluczową rolę w procesie regeneracji tkanek. Idealne rusztowanie musi spełniać kilka wymagań, takich jak odpowiedni skład, ukierunkowany moduł i dobrze zdefiniowane cechy architektoniczne. Biomateriały, które odwzorowują wewnętrzną architekturę tkanek in vivo, są niezbędne do badania chorób, a także do ułatwiania regeneracji utraconych i zniekształconych tkanek miękkich. Opracowano nowatorską technikę biofabrykacji, która łączy najnowocześniejsze obrazowanie, druk trójwymiarowy (3D) i selektywną aktywność enzymatyczną w celu stworzenia nowej generacji biomateriałów do zastosowań badawczych i klinicznych. Opracowany materiał, kauczuk albuminowy surowicy bydlęcej, jest reakcyjnie wtryskiwany do formy, która zachowuje określone cechy geometryczne. Ten materiał protektorowy pozwala na odpowiednie przeniesienie cech architektonicznych na naturalny materiał rusztowania. Prototyp składa się z rusztowania kolagenowego 3D z kanałami 4 i 3 mm, które reprezentują rozgałęzioną architekturę. Niniejszy artykuł kładzie nacisk na zastosowanie tej techniki biofabrykacji do generowania naturalnych konstruktów. Protokół ten wykorzystuje oprogramowanie wspomagane komputerowo (CAD) do wytworzenia stałej formy, która zostanie wstrzyknięta w reakcję z gumą BSA, a następnie enzymatyczne trawienie gumy, pozostawiając jej cechy architektoniczne w materiale rusztowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W dziedzinie inżynierii tkankowej możliwość wytwarzania rusztowań tkankowych jest niezbędna. Odpowiednie rusztowanie tkankowe ma strukturę 3D, składa się z biokompatybilnych materiałów i naśladuje architekturę tkanek in vivo, ułatwiając wzrost i przebudowę komórek i tkanek. Rusztowanie to musi umożliwiać transport składników odżywczych i usuwanie odpadów1-4. Jedną z głównych przeszkód w produkcji tych rusztowań jest możliwość rekapitulacji określonych cech geometrycznych w biokompatybilny materiał. Doniesiono o kilku technikach biofabrykacji w celu kontrolowania cech geometrycznych tych rusztowań, przykładami są między innymi elektroprzędzenie5-8, odlewanie rozpuszczalnikiem9, stereolitografia10 i druk 3D11. Techniki te nie zapewniają stosunkowo łatwego przenoszenia kontrolowanych wewnętrznych i zewnętrznych cech architektonicznych, są drogie, ograniczone rozdzielczością i drukowalnością (np. rozstaw dysz, ograniczenia materiałowe) lub wymagają technik postprodukcyjnych, które wymagają długiego okresu czasu do wyprodukowania opłacalnych rusztowań12.

W wielu komercyjnych systemach produkcyjnych, tworzenie wewnętrznych pustych przestrzeni, kanałów i cech odbywa się za pomocą piasku lub innych odpowiednich materiałów usuwalnych lub ofiarnych. Metalowa lub plastikowa część jest formowana wokół formy piaskowej, a po jej zestaleniu piasek jest usuwany. W podobny sposób następna generacja biomateriałów potrzebuje odpowiednika biopiasku. W związku z tym kauczuk BSA został opracowany jako substytut biopiasku. Kauczuk BSA to nowo opracowany materiał, który składa się z albuminy surowicy bydlęcej usieciowanej aldehydem glutarowym. Ostatecznym celem jest odtworzenie określonych cech architektonicznych w biodegradowalnym rusztowaniu kolagenowym. Opisano charakterystykę biokauczuku ofiarnego, który zachowuje wierność wymiarową z formą oryginalnej tkanki.

Kilka kombinacji stężeń BSA i aldehydu glutarowego zostało przetestowanych przy użyciu różnych rozpuszczalników. Materiał ten powstał w wyniku reakcji BSA i aldehydu glutarowego. Kauczuk BSA może być reakcyjnie wstrzykiwany w skomplikowane geometrie form tkankowych. Usieciowany BSA to trypsyna labilna i łatwo trawiona przez enzym w łagodnych warunkach pH i temperatury. I odwrotnie, nienaruszony kolagen typu I jest bardzo odporny na trawienie trypsyny. Cechy te zostały skapitalizowane, aby selektywnie usunąć gumę BSA, pozostawiając kolagen. Obecne prace polegały na określeniu idealnych parametrów potrzebnych do uzyskania labilnej formy, która może nadać rusztowaniu biokompatybilnemu określone cechy architektoniczne. Konkretne cechy, które zostały ocenione, obejmowały mieszalność, trawienie enzymatyczne, nośność obciążenia i zdolność do reakcji wtryskiwania do formy ujemnej. Połączenie 30% BSA i 3% aldehydu glutarowego spełnia te wymagania. Protokół ten zawiera niezbędne wytyczne do tworzenia tych trójwymiarowych rusztowań. Prototyp składa się z rusztowania kolagenowego, które reprezentuje rozgałęzioną architekturę z jednym kanałem dopływowym i dwoma kanałami odpływowymi o średnicach odpowiednio 4 i 3 mm. Technika ta może potencjalnie naśladować makro- i mikrośrodowiska tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Technologia ta zapewnia realną technikę dostarczania określonych instrukcji geometrycznych do biodegradowalnego materiału w stosunkowo łatwej i szybkiej materii o wysokiej wierności, którą można dostroić tak, aby naśladować elastyczność tkanki in vivo i inne cechy tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Określ procentową zawartość ciał stałych w partii kolagenu

  1. Ekstrahuj kolagen zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą13. Rozmrozić minimum 20 ml kolagenu. Określić początkową zawartość procentową stałych kolagenu w partii w celu manipulowania stężeniem kolagenu w utworzonych hydrożelach.
    1. Wytnij trzy kawałki folii aluminiowej (około 6 x 6 cm) i uformuj każdy z nich jako patelnię, używając dna zlewki o pojemności 25 ml. Zapisz wagę każdej patelni.
    2. Dodaj niewielką ilość kolagenu do każdej patelni i zapisz całkowitą wagę aluminiowej patelni i kolagenu. Dodaj 0,5 - 0,8 g kolagenu na każdą aluminiową patelnię.
      Uwaga: Po tym kroku znajdują się trzy patelnie z folii aluminiowej i każda z nich powinna zawierać niewielką ilość kolagenu. Upewnij się, że zapisałeś wagę każdej (łącznie 3) pustej aluminiowej patelni i wagę patelni po dodaniu kolagenu.
    3. Oblicz wagę kolagenu na każdej patelni, korzystając z następującego wzoru:
      Waga kolagenu = Waga patelni i kolagenu - Waga patelni
    4. Umieść trzy aluminiowe patelnie, w których znajduje się kolagen, w piekarniku w temperaturze 100 °C na 24 godziny.
    5. Po 24 godzinach zapisz wagę każdej aluminiowej patelni i odwodnionego kolagenu.
    6. Oblicz masę odwodnionego kolagenu, korzystając z następującego równania:
      Waga odwodnionego kolagenu = Waga patelni i odwodnionego kolagenu - Waga patelni
    7. Obliczyć procentową zawartość substancji stałych dla trzech próbek, aby określić stężenie kolagenu w postaci stałej, korzystając z poniższego wzoru:
      figure-protocol-1
    8. Obliczyć średnią zawartość kolagenu w stanie stałym w partii, stosując procentową zawartość suchej kolagenu dla każdej z trzech próbek.
      Uwaga: Kolagen, który zostanie użyty, to to, co pozostało z uwodnionego kolagenu. Żaden z odwodnionych kolagenów nie zostanie użyty.
    9. Po określeniu procentowej zawartości stałego kolagenu (początkowego stężenia kolagenu) w partii, kontynuuj stosowanie pozostałego uwodnionego kolagenu. Użyj skalibrowanego pH-metru, aby dostosować pH partii kolagenu do 3.
      1. Dodać niewielkie ilości (jednorazowo 2-5 μl) 12 N kwasu solnego (HCl). Trzymaj się lodu przez cały czas. Nie dodawaj kwasu solnego bezpośrednio do kolagenu - dodaj kwas z boku tubki. Po dodaniu kwasu za pomocą szpatułki wepchnij kwas do kolagenu i szybko wymieszaj mieszaninę.
    10. Gdy osiągnie pH 3, pozwól kolagenowi usiąść O/N w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie gumy BSA

  1. Przygotować roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zgodnie z procedurą opisaną poniżej.
    1. Przygotować 2x roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS). Dodać dwie tabletki PBS do 100 ml wody, aby uzyskać 0,02 M PBS roztwór.
    2. Połącz BSA z 2x PBS, aby utworzyć 30% roztwór BSA, korzystając z procedury opisanej poniżej.
      1. Na przykład, aby zrobić 30% BSA z 30 ml 2x PBS, użyj 12,9 g BSA. Dodać 1/3 2x PBS (np. 10 ml) do kolby z mieszadłem. Dodać 1/2 BSA (np. 6,45 g BSA) do kolby i za pomocą szpatułki zwilżyć suchą substancję rozpuszczoną.
      2. Powtarzać ten proces dodawania PBS, a następnie BSA, aż cała substancja rozpuszczona i rozpuszczalnik znajdą się w kolbie. Użyj szpatułki, aby zwilżyć całą substancję rozpuszczoną. Będzie wyglądać jak mieszanina płynu i grudek. Pozostaw na około 30 minut.
      3. Następnie przekręć mieszadło na niski cykl i upewnij się, że wokół mieszadła nie ma grudek. Powinno to zająć 90 minut, aby wszystko znalazło się w roztworze lub można je pozostawić mieszając O/N w temperaturze 4 °C. Po rozpuszczeniu całej substancji rozpuszczonej umieścić roztwór w strzykawce o pojemności 20 ml i zakryć filtrem strzykawkowym 0,20 μm. Nacisnąć tłok, aby usunąć płyn przez filtr i zebrać wysterylizowany roztwór do nowej probówki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować 3% roztwór aldehydu glutarowego, rozcieńczając 25% roztwór aldehydu glutarowego sterylnym przefiltrowanym 2x PBS. Na przykład na 10 ml 3% roztworu aldehydu glutarowego użyj 2 ml 25% aldehydu glutarowego i 8 ml 2x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Leczenie pleśni

Uwaga: Prototyp opisany w tym artykule wykorzystuje specjalnie wykonany element formy Y ze stali nierdzewnej. Forma zawiera kanał dopływowy i odpływowy o dwóch kanałach odpływowych odpowiednio 4 i 3 mm. Najpierw oczyść pleśnie, spryskaj je nienasyconym smalcem i wysterylizuj. Przygotuj foremki zgodnie z procedurą opisaną poniżej.

  1. Wyczyść formy ze stali nierdzewnej za pomocą sonikatora o częstotliwości 35 kHz. Umieść foremki w sonikatorze i zanurz je w wodzie i lodzie. Utrzymuj formy w niskiej temperaturze przez cały czas, gdy soniator jest uruchomiony. Uruchom sonikator na 2 okresy po 90 minut.
    1. Po każdej miesiączce użyj igły, aby upewnić się, że w złączu Luer lock ze stali nierdzewnej lub mosiądzu nie ma materiału. Użyj mydła i wody, aby wyczyścić całą powierzchnię z dwóch stron foremek. Sprawdź, czy w kanałach nie ma przeszkód.
  2. Umieść formy, i złącze Luer lock w torbie do autoklawu i autoklaw go.
  3. Napełnij butelkę, która jest podłączona do rozpylacza pneumatycznego, do połowy dostępnym w handlu smalcem (środkiem antyadhezyjnym mieszanych kwasów tłuszczowych). Zastąp nakrętkę zwykłą butelką z nakrętką. Umieść go w torbie do autoklawu i autoklawuj go.
    Uwaga: Smalec stosuje się w celu ułatwienia uwalniania materiału, który zostanie później wstrzyknięty w reakcję (guma BSA). Nie umieszczaj pokrywki butelki z rozpylaczem w autoklawie - może to uszkodzić uszczelkę wewnętrzną.
  4. W kuchence mikrofalowej podgrzewaj smalec przez 45 sekund lub do momentu, aż stanie się klarowny i płynny. Przykręć pokrywę spryskiwacza powietrza do butelki ze smalcem. Połącz pokrywę z opryskiwaczem. Przymocuj opryskiwacz do źródła powietrza na stole laboratoryjnym. Otwórz zawór powietrza i otwórz dyszę opryskiwacza, aż zacznie zwilżać powierzchnię ręcznika papierowego.
  5. Spryskaj smalc prostopadle do powierzchni formy, aż powierzchnia zostanie całkowicie pokryta. Po spryskaniu każdego kawałka umieść je na szalce Petriego i zamknij ją. Umieść foremki w temperaturze 4 °C na 2 godziny.
  6. Przystąp do sterylizacji form, wystawiając powierzchnię na działanie światła UV przez 30 minut. Umieść je z powrotem w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do wstrzyknięcia reakcyjnego.

4. Wtrysk reakcyjny gumy BSA

Uwaga: Wszystkie materiały i roztwór powinny być przechowywane w niskiej temperaturze, dopóki nie będą gotowe do użycia, aby zapobiec przedwczesnemu związaniu gumy BSA w następnych krokach.

  1. Przygotuj dozownik do dostarczania gumy BSA do form, wykonując następujące czynności.
    1. Wysterylizuj wszystkie składniki mieszania (dwa O-ringi, nasadkę strzykawki, podwójną strzykawkę, końcówkę mieszającą i dozownik 4:1), wystawiając je na działanie światła UV przez 30 minut w kapturze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
      Uwaga: Użyto kaptura PCR, ponieważ ta procedura obejmuje utrwalacze. Te chemikalia nie mogą być stosowane w kapturze do hodowli komórkowych/tkankowych ze względu na ryzyko narażenia i toksyczności dla komórek. Odpowiedni będzie każdy inny okap, który zawiera światło UV.
    2. Umieść nasadkę końcówki na uchwycie roztworu.
    3. Przeprowadzić mieszanie i wstrzykiwanie w stosunku 4:1 BSA:Aldehyd glutarowy. Dodaj 30% BSA do podwójnej komory strzykawki, która dostarczy największą ilość roztworu (napełnienie zajmie około 4 ml). Upewnij się, że masz wystarczająco dużo miejsca na umieszczenie O-ringu, aby zapobiec przelaniu i zanieczyszczeniu sąsiedniej komory.
    4. Dodaj 3% roztwór aldehydu glutarowego do drugiej komory (napełnienie zajmie około 1 ml). Upewnij się, że masz wystarczająco dużo miejsca na umieszczenie O-ringu, aby zapobiec przelaniu i zanieczyszczeniu sąsiedniej komory.
    5. Umieścić podwójną strzykawkę na dozowniku. Przechylić zespół w pionie, tak aby nasadka strzykawki znajdowała się na górze. Załóż nakrętkę na końcówkę mieszającą.
    6. Przykręć ze sobą dwie formy ze stali nierdzewnej.
    7. Umieść zespół w torbie autoklawu.
    8. Aby usunąć powietrze z dozownika, przytrzymaj go w pozycji pionowej i szybko ściśnij uchwyt jeden raz, aby uwolnić niewielką ilość BSA zmieszanego z aldehydem glutarowym. Następnie szybko przymocuj złącze Luer lock formy Y ze stali nierdzewnej do końcówki strzykawki.
    9. Lewą ręką trzymaj formę Y ze stali nierdzewnej, a po prawej dozownik mieszaniny BSA-aldehydu glutarowego. Naprzemiennie zakrywaj każdy z lewych i prawych wylotów kanałów odpływowych, dociskając wydech do boków worka autoklawu, aby upewnić się, że wewnętrzne puste przestrzenie są wypełnione roztworem. Następnie umieść formy poziomo i ponownie wstrzyknij.
    10. Odłącz foremki od dozownika i umieść na szalce Petriego o średnicy 25 mm.
    11. Umieść Parafilm wokół szalki Petriego, aby zapobiec odwodnieniu gumy.
    12. Umieść formę w lodówce o temperaturze 4 °C.

5. Regulacja stężenia kolagenu

Uwaga: Kolagen powinien być trzymany na lodzie przez cały czas trwania procesu.

  1. Zmodyfikuj stężenie kolagenu za pomocą procentowej zawartości stałego kolagenu.
    1. Przygotuj 10 ml 1,75% kolagenu, dostosowując początkowe stężenie kolagenu zimną wodą.
    2. Za pomocą skalibrowanego pH-metru dostosuj pH do 3 za pomocą 12 N kwasu solnego. Nie dodawaj kwasu solnego bezpośrednio do kolagenu - dodaj kwas z boku tubki. Po dodaniu kwasu za pomocą szpatułki wepchnij kwas do kolagenu i szybko wymieszaj mieszaninę.
    3. Odważyć 4 g kolagenu w osobnej stożkowej tubie.
    4. Odwirować kolagen w celu usunięcia powietrza o temperaturze 4 °C i 9,343 x g przez 20-30 min.
    5. Sterylizuj UV kaptur do hodowli komórkowej przez 30 minut i dodaj 14 μl lamininy do 4 ml kolagenu. Spowoduje to końcowe stężenie lamininy wynoszące 10 μg/μl. Uwaga: Laminina zapewnia integralność strukturalną, przyczepność i wspomaga różne odpowiedzi komórkowe.
    6. Włącz lampę UV PCR na 20-30 minut przed użyciem okapu do sterylizacji.
    7. Umieść nasadkę Luer lock, którą należy podłączyć do strzykawki o pojemności 20 ml, w etanolu na 2 godziny. Następnie pozostaw do wyschnięcia i umieść w świetle UV.
    8. Gamma naświetla kolagen przez 8,6 minuty, aby osiągnąć 1,200 cGy.
      Uwaga: Czas będzie zależał od rozpadu źródła cezu. Dostosuj czas, aby osiągnąć tę samą dawkę.

6.Odlewanie kolagenu na gumie BSA

  1. Do polimeryzacji kolagenu użyj proporcji 8:1:1 (collagen:HEPES:MEM). Poniższa procedura opiera się na początkowych 4 g zakwaszonego kolagenu (z kroku 5.1.8).
    1. Przygotować 0,2 N roztwór HEPES w wodzie i dostosować pH do 9, dodając niewielkie ilości (1-5 μl) 1-5 M roztworu wodorotlenku sodu (NaOH). Za pomocą skalibrowanego pH-metru monitorować pH roztworu po każdym dodaniu. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
    2. Włącz światło UV okapu do hodowli tkankowej na 20-30 minut, aby wysterylizować kaptur.
    3. Kleszcze do autoklawu, szpatułka i skalpel do sterylizacji.
    4. Wymieszaj 1,5 ml 0,2 N HEPES (pH 9) i 1,5 ml 10x MEM za pomocą kaptura do hodowli tkankowych. Upewnij się, że trzymasz go na lodzie i wiruj przez 5 sekund przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
    5. Aby wysterylizować kaptur do PCR, włącz światło UV na 30 minut.
    6. Umieścić 12-dołkową płytkę i strzykawkę o pojemności 20 ml w temperaturze -20 °C na 10 minut lub do momentu, gdy będzie gotowa do kontynuowania. Uwaga: Utrzymuj wszystkie materiały w chłodzie, aż będą gotowe do użycia. Wzrost temperatury indukuje przedwczesną fibrylogenezę kolagenu.
    7. Spryskaj wszystkie probówki i płytki studzienek, które będą znajdować się w okapie, 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia w celu sterylizacji. Umieścić strzykawkę o pojemności 20 ml na lodzie do ostygnięcia do późniejszego użycia.
    8. W kapturze PCR otwórz formy ze stali nierdzewnej, aby uwolnić gumę BSA i za pomocą skalpela przetnij kanały wydechowe gumowej formy BSA.
    9. Pod kapturem PCR otwórz sterylne probówki kolagenowe i dodaj 1 ml roztworu HEPES-MEM (upewnij się, że przed ekstrakcją roztworu HEPES-MEM jest dobrze wymieszany i nie ma żadnych osadów stałych).
    10. Za pomocą sterylnej szpatułki dokładnie wymieszaj kolagen i roztwór buforowy.
    11. Zamknij i szybko zwiruj, aby uzyskać dobrze wymieszany hydrożel.
    12. Przenieść do zimnej strzykawki o pojemności 20 ml.
    13. Jedną ręką przytrzymaj gumę BSA wewnątrz studzienki, a drugą ręką wylej połowę roztworu hydrożelu kolagenowego na dno studzienki.
    14. Za pomocą sterylnej pęsety upewnij się, że gumowe końce dopływu i odpływu stykają się z bokami studzienki.
    15. Wlej roztwór kolagenu na gumę, aż zostanie całkowicie pokryty.
    16. Upewnij się, że guma BSA jest zawieszona w kolagenie i że nie ma pęcherzyków, szczególnie w pobliżu końców gumy.
    17. Umieść pokrywę i owiń Parafilm wokół obwodu studzienki.
    18. Umieścić w inkubatorze na 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Pozostawić włączone światło UV PCR.
  2. Po polimeryzacji kolagenu, UV sieciuje hydrożel w następujący sposób.
    Uwaga: Sieciowanie kolagenu odbywa się za pomocą aparatu sieciującego UV, w którym można kontrolować ilość energii.
    1. Włącz sieciownik UV i użyj ustawienia energii, aby napromienić pustą komorę napięciem 630 000 μJ/cm2.
    2. Usunąć żele z inkubatora.
    3. Spryskaj ręce etanolem i wewnątrz komory zdejmij pokrywę tak szybko, jak to możliwe.
    4. Zamknij komorę i usieciuj hydrożele UV, wybierając ustawienie energii i naświetlając 630 000 μJ/cm2.
    5. Po cyklu sieciowania wyłącz światło UV na kapturze PCR
    6. Spryskaj ręce etanolem i otwórz komorę, szybko umieszczając pokrywę z powrotem na płytce studzienki. Przenieś płytkę studzienki do okapu PCR.
    7. Za pomocą sterylnej szpatułki delikatnie poluzuj i wyjmij żel z dołka. Odwróć żele pod maską, aby usieciować spód hydrożelu. Powtórz kroki 6.2.3 i 6.2.4.

7. Trawienie enzymatyczne gumy BSA

  1. Aby uzyskać puste rusztowanie kolagenowe, należy usunąć gumę BSA w sposób, który nie wpływa na wymiary osadzone w hydrożelu. Procedura została opisana poniżej.
    1. Włącz światło UV na 20-30 minut, aby wysterylizować kaptur do hodowli tkankowych.
    2. Przygotować 0,25% roztwór trypsyny o pH 7,8. Na przykład na 15 ml wody dodaj 0,0376 g trypsyny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dostosuj pH do 7,8, dodając niewielkie ilości (2-5 μl) 1 M NaCl. Umieścić roztwór w strzykawce o pojemności 20 ml i zakryć filtrem strzykawkowym 0,20 μm. Nacisnąć tłok, aby usunąć płyn przez filtr i zebrać sterylny roztwór do nowej probówki.
    3. Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 30 °C.
    4. Po 30 minutach wyłącz światło UV. Rozpyl etanol na wszystkie rurki i materiały, które będą używane w okapie.
    5. Przenieś hydrożel kolagenowy pod kaptur i umieść w osobnej stożkowej tubie.
    6. Do każdej probówki dodać około 3-5 ml (tylko tyle, aby pokryć żele) 0,25% roztworu trypsyny o pH 7,8.
    7. Uszczelnij probówki Parafilmem i lekko wiruj przez około 1 minutę.
    8. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na 15-24 godziny. W kąpieli wodnej należy często delikatnie mieszać żele, aż guma BSA zostanie strawiona lub usunięta z hydrożelu.
      Uwaga: W celu ustalenia, czy guma BSA została usunięta, albo guma unosi się w roztworze trypsyny, albo są tam uszkodzone kawałki. W hydrożelu nie może być żadnych widocznych ciemnych obszarów.
  2. Aby upewnić się, że cała guma BSA i trypsyna zostały usunięte z hydrożeli, spłucz je zgodnie z poniższym opisem.
    1. Włącz lampę UV okapu PCR na 20-30 minut.
    2. Przygotuj roztwór Mosconas. Połącz chlorek potasu (KCl, 28,6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glukozę (9,4 mM) i (NaH2PO4, 0,08 mM) w wodzie. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 M roztworu NaOH lub 12 M HCl. Umieścić roztwór w strzykawce o pojemności 20 ml i użyć filtra strzykawkowego o wielkości 0,20 μm do sterylizacji roztworu.
    3. Spryskaj wszystko etanolem przed umieszczeniem ich na masce i pozostaw etanol do wyschnięcia.
    4. Otwórz probówkę i przenieś 5-10 ml sterylnego roztworu Mosconas do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    5. Przenieś hydrożel kolagenowy do stożkowej rurki zawierającej roztwór enzymu. Upewnij się, że hydrożel jest całkowicie pokryty roztworem. Pozostaw probówkę w shakerze w lodówce w temperaturze 4 °C na 30 minut.
    6. Zassać roztwór Mosconas i powtórzyć krok 7.2.5 dwukrotnie.
    7. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki pokazują, że ta technika biofabrykacji jest skuteczna w generowaniu rusztowań 3D, które mogą naśladować układ przestrzenny widoczny w tkance in vivo. Cechy architektoniczne są kluczowymi parametrami dla zastosowań inżynierii tkankowej, odgrywając kluczową rolę w interakcji komórkowej in vivo i funkcjonalności tkanki.

Konsystencja i mieszalność gumy BSA była ważnym parametrem w produkcji gumy BSA, która j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofabrykacja to wysoce multidyscyplinarna dziedzina, w której biologia i zasady inżynierii łączą się, aby generować złożone materiały naśladujące rodzimą tkankę. Aby to osiągnąć, konieczne jest opracowanie technik, które wykorzystują informacje zebrane z tkanek in vivo i przekształcają je w rusztowanie in vitro . W ten sposób można zaprojektować platformę, która bardzo przypomina architektoniczne, funkcjonalne i mechaniczne właściwości tkanki in vivo . Optymalny materiał rusztowania powinien p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH-NIDCR IRO1DE019355 (MJ Yost, PI) i NSF-EPSCoR (EPS-0903795).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagen typu IKolagen ekstrahowany ze skóry cielęcej
Kwas hydrokwarowy (HCl)Sigma-Aldrich7647-01-0
Bufor fosforanowy (tabletki PBS)MP BiomedicalU53781 tabletka na 100 ml sprawia, że 1x PBS
Albumium z surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9647
Aldehyd glutarowySigma -AldrichG5882Toxic
LardFields3090
Formyfrezowane za pomocą zestawu szczotki powietrznej do mikrolutacji
Centralna pneumatycznakońcówka mieszająca 47791
do podwójnej strzykawkiMieszalnik MedmixML2.5-16-LLM, DN2,5X16, 4:1 brązowy, med
Mały O-ring do podwójnej strzykawkiMedmixPPB-X05-04-02SMTłok B, 5 ml, 4:1, PE naturalny
Podwójna nasadka strzykawki MedmixVLX002-SMNasadka, 4:1/10:1, PE brązowa, med
Big O-ring do podwójnej strzykawkiMedmixPPA-X05-04-02SMTłok A, 5 ml, Podwójna strzykawka 4:1
MedmixSDL X05-04-50MPodwójna strzykawka, 5 ml, 4:1
Podwójna strzykawka DozownikMedmixDL05-0400MDozownik, 5 ml, 4:1, med, gładki
Laminim3,6 mg/ml - ekstrahowany USC lab
20 ml Końcówka strzykawki Luer LockBD302830
Nasadki Luer LockFisherJGTCBLLX
HEPESSigma -AldrichH4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM)Life Technologies1143-030
TrypsinLife Technologies27250-018
UV Crosslinker Spektrolina UVXLE1000
Klobryd sodu (NaCl)FisherS271-10Do przygotowania Mosconas
Chlorek potasu (KCl)Sigma -AldrichP5405-250Do przygotowania Mosconas
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)FisherBP328-500Aby przygotować Mosconas
GlucoseSigma -AldrichG-8270Przygotować Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS-7907Do przygotowania Mosconas
Sterylny filtr do strzykawekCorning431224
ze stali nierdzewnej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
  2. Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
  3. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
  4. Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
  5. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
  6. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  7. Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
  8. Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
  9. Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
  10. Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
  11. Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
  12. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  13. Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
  14. Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
  15. Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
  16. Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
  17. Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
  18. Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
  20. Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
  21. Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
  22. Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
  23. Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723(2012).
  24. Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Guma z albuminy surowicy bydl cejrusztowanie z hydro elu kolagenowegoprotok trawienia enzymatycznegodruk tr jwymiarowyselektywna aktywno enzymatycznatransfer materia u po wi calnegoforma zaprojektowana wspomagana komputeroworusztowania do regeneracji tkanek

Powiązane artykuły