Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa technologia biomimetyczna: nowatorski biokauczuk tworzy zdefiniowane architektury w mikro i makroskali w hydrożelach kolagenowych

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53578

⸱

12 lutego 2016

 ,  , 
1Department of Surgery - Division of General Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Chemical Engineering, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Innowacyjna technika biofabrykacji została opracowana w celu inżynierii trójwymiarowych konstrukcji, które przypominają cechy architektoniczne, komponenty i właściwości mechaniczne tkanki in vivo. Technika ta wykorzystuje nowo opracowany materiał protektorowy, kauczuk BSA, który przenosi szczegółowe cechy przestrzenne, odtwarzając architekturę in vivo szerokiej gamy tkanek.

Streszczenie

Rusztowania tkankowe odgrywają kluczową rolę w procesie regeneracji tkanek. Idealne rusztowanie musi spełniać kilka wymagań, takich jak odpowiedni skład, ukierunkowany moduł i dobrze zdefiniowane cechy architektoniczne. Biomateriały, które odwzorowują wewnętrzną architekturę tkanek in vivo, są niezbędne do badania chorób, a także do ułatwiania regeneracji utraconych i zniekształconych tkanek miękkich. Opracowano nowatorską technikę biofabrykacji, która łączy najnowocześniejsze obrazowanie, druk trójwymiarowy (3D) i selektywną aktywność enzymatyczną w celu stworzenia nowej generacji biomateriałów do zastosowań badawczych i klinicznych. Opracowany materiał, kauczuk albuminowy surowicy bydlęcej, jest reakcyjnie wtryskiwany do formy, która zachowuje określone cechy geometryczne. Ten materiał protektorowy pozwala na odpowiednie przeniesienie cech architektonicznych na naturalny materiał rusztowania. Prototyp składa się z rusztowania kolagenowego 3D z kanałami 4 i 3 mm, które reprezentują rozgałęzioną architekturę. Niniejszy artykuł kładzie nacisk na zastosowanie tej techniki biofabrykacji do generowania naturalnych konstruktów. Protokół ten wykorzystuje oprogramowanie wspomagane komputerowo (CAD) do wytworzenia stałej formy, która zostanie wstrzyknięta w reakcję z gumą BSA, a następnie enzymatyczne trawienie gumy, pozostawiając jej cechy architektoniczne w materiale rusztowania.

Wprowadzenie

W dziedzinie inżynierii tkankowej możliwość wytwarzania rusztowań tkankowych jest niezbędna. Odpowiednie rusztowanie tkankowe ma strukturę 3D, składa się z biokompatybilnych materiałów i naśladuje architekturę tkanek in vivo, ułatwiając wzrost i przebudowę komórek i tkanek. Rusztowanie to musi umożliwiać transport składników odżywczych i usuwanie odpadów1-4. Jedną z głównych przeszkód w produkcji tych rusztowań jest możliwość rekapitulacji określonych cech geometrycznych w biokompatybilny materiał. Doniesiono o kilku technikach biofabrykacji w celu kontrolowania cech geometrycznych tych rusztowań, przykładami są między innymi elektroprzędzenie5-8, odlewanie rozpuszczalnikiem9, stereolitografia10 i druk 3D11. Techniki te nie zapewniają stosunkowo łatwego przenoszenia kontrolowanych wewnętrznych i zewnętrznych cech architektonicznych, są drogie, ograniczone rozdzielczością i drukowalnością (np. rozstaw dysz, ograniczenia materiałowe) lub wymagają technik postprodukcyjnych, które wymagają długiego okresu czasu do wyprodukowania opłacalnych rusztowań12.

W wielu komercyjnych systemach produkcyjnych, tworzenie wewnętrznych pustych przestrzeni, kanałów i cech odbywa się za pomocą piasku lub innych odpowiednich materiałów usuwalnych lub ofiarnych. Metalowa lub plastikowa część jest formowana wokół formy piaskowej, a po jej zestaleniu piasek jest usuwany. W podobny sposób następna generacja biomateriałów potrzebuje odpowiednika biopiasku. W związku z tym kauczuk BSA został opracowany jako substytut biopiasku. Kauczuk BSA to nowo opracowany materiał, który składa się z albuminy surowicy bydlęcej usieciowanej aldehydem glutarowym. Ostatecznym celem jest odtworzenie określonych cech architektonicznych w biodegradowalnym rusztowaniu kolagenowym. Opisano charakterystykę biokauczuku ofiarnego, który zachowuje wierność wymiarową z formą oryginalnej tkanki.

Kilka kombinacji stężeń BSA i aldehydu glutarowego zostało przetestowanych przy użyciu różnych rozpuszczalników. Materiał ten powstał w wyniku reakcji BSA i aldehydu glutarowego. Kauczuk BSA może być reakcyjnie wstrzykiwany w skomplikowane geometrie form tkankowych. Usieciowany BSA to trypsyna labilna i łatwo trawiona przez enzym w łagodnych warunkach pH i temperatury. I odwrotnie, nienaruszony kolagen typu I jest bardzo odporny na trawienie trypsyny. Cechy te zostały skapitalizowane, aby selektywnie usunąć gumę BSA, pozostawiając kolagen. Obecne prace polegały na określeniu idealnych parametrów potrzebnych do uzyskania labilnej formy, która może nadać rusztowaniu biokompatybilnemu określone cechy architektoniczne. Konkretne cechy, które zostały ocenione, obejmowały mieszalność, trawienie enzymatyczne, nośność obciążenia i zdolność do reakcji wtryskiwania do formy ujemnej. Połączenie 30% BSA i 3% aldehydu glutarowego spełnia te wymagania. Protokół ten zawiera niezbędne wytyczne do tworzenia tych trójwymiarowych rusztowań. Prototyp składa się z rusztowania kolagenowego, które reprezentuje rozgałęzioną architekturę z jednym kanałem dopływowym i dwoma kanałami odpływowymi o średnicach odpowiednio 4 i 3 mm. Technika ta może potencjalnie naśladować makro- i mikrośrodowiska tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Technologia ta zapewnia realną technikę dostarczania określonych instrukcji geometrycznych do biodegradowalnego materiału w stosunkowo łatwej i szybkiej materii o wysokiej wierności, którą można dostroić tak, aby naśladować elastyczność tkanki in vivo i inne cechy tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wyznaczenie zawartości substancji stałych w partii kolagenu

  1. Wyodrębnić kolagen zgodnie z uprzednio opisaną procedurą13. Odmrozić minimum 20 ml kolagenu. Wyznaczyć początkowy procentowy udział części stałych kolagenu w partii w celu dostosowania stężenia kolagenu w tworzonych hydrożelach.
    1. Wyciąć trzy kawałki folii aluminiowej (około 6 x 6 cm) i uformować z każdego z nich naczynie, wykorzystując dno zlewki o pojemności 25 ml. Zapisać masę każdego naczynia.
    2. Do każdego naczynia dodać niewielką ilość kolagenu i zapisać całkowitą masę naczynia aluminiowego wraz z kolagenem. Na każde aluminiowe naczynie nanieść 0,5 - 0,8 g kolagenu.
      Uwaga: Po tym kroku otrzymujemy trzy aluminiowe naczynia, z których każde powinno zawierać niewielką ilość kolagenu. Należy upewnić się, że zapisano masę każdego z (łącznie 3) pustych aluminiowych naczyń oraz masę naczynia po dodaniu kolagenu.
    3. Obliczyć masę kolagenu w każdym naczyniu, korzystając z następiego wzoru:
      Masa kolagenu = Masa naczynia z kolagenem - Masa naczynia
    4. Umieścić trzy aluminiowe naczynia z kolagenem w piekarniku w temperaturze 100 °C na 24 h.
    5. Po 24 h zapisać masę każdego aluminiowego naczynia wraz z odwodnionym kolagenem.
    6. Obliczyć masę odwodnionego kolagenu, korzystając z następującego równania:
      Masa odwodnionego kolagenu = Masa naczynia z odwodnionym kolagenem - Masa naczynia
    7. Obliczyć zawartość części stałych dla trzech próbek, aby wyznaczyć stężenie stałego kolagenu, stosując poniższy wzór:
      Wzór na zawartość kolagenu, równowaga statyczna, równanie obliczania procentowej zawartości stałego kolagenu.
    8. Obliczyć średnią zawartość stałego kolagenu w partii, wykorzystując procentowy udział części stałych dla każdej z trzech próbek.
      Uwaga: Do dalszych prac wykorzystany zostanie pozostały uwodniony kolagen. Żadna część odwodnionego kolagenu nie będzie używana.
    9. Po wyznaczeniu procentowej zawartości stałego kolagenu (początkowe stężenie kolagenu) w partii, kontynuować pracę z pozostałym uwodnionym kolagenem. Za pomocą skalibrowanego pH-metru dostosować pH partii kolagenu do wartości 3.
      1. Dodawać niewielkie ilości (po 2-5 µl) 12 N kwasu solnego (HCl). Przez cały czas przechowywać w lodzie. Nie dodawać kwasu solnego bezpośrednio do kolagenu — dodawać kwas na ściankę probówki. Po dodaniu kwasu, za pomocą szpatułki wprowadzić kwas do kolagenu i szybko wymieszać zawiesinę.
    10. Po osiągnięciu pH 3 pozostawić kolagen przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie gumowej matrycy z BSA

  1. Przygotować roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zgodnie z poniższą procedurą.
    1. Przygotować 2x roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Dodać dwie tabletki PBS do 100 ml wody, aby otrzymać 0,02 M roztwór PBS.
    2. Połączyć BSA z 2x PBS w celu przygotowania 30% roztworu BSA zgodnie z poniższą procedurą.
      1. Na przykład, aby przygotować 30% BSA z 30 ml 2x PBS, użyć 12,9 g BSA. Dodać 1/3 części 2x PBS (np. 10 ml) do kolby z mieszadełkiem magnetycznym. Dodać 1/2 części BSA (np. 6,45 g BSA) do kolby i za pomocą szpatułki zwilżyć suchy rozpuszczalnik.
      2. Powtarzać proces dodawania PBS, a następnie BSA, aż cały rozpuszczalnik i rozpuszczalnik znajdą się w kolbie. Użyć szpatułki, aby zwilżyć cały rozpuszczalnik. Mieszanina będzie przypominać ciecz z grudkami. Pozostawić na około 30 min.
      3. Następnie uruchomić mieszadło na niskich obrotach i upewnić się, że wokół mieszadełka nie ma grudek. Całkowite rozpuszczenie powinno zająć 90 min lub można pozostawić do mieszania O/N w 4 °C. Po całkowitym rozpuszczeniu substancji przenieść roztwór do strzykawki 20 ml i założyć filtr strzykawkowy 0,20 µm. Nacisnąć tłok, aby przepchnąć ciecz przez filtr i zebrać wysterylizowany roztwór do nowej probówki. Przechowywać w 4 °C.
    3. Przygotować 3% roztwór glutaraldehydu poprzez rozcieńczenie 25% roztworu glutaraldehydu sterylnie filtrowanym 2x PBS. Na przykład, aby otrzymać 10 ml 3% roztworu glutaraldehydu, użyć 2 ml 25% glutaraldehydu i 8 ml 2x PBS. Przechowywać w 4 °C.

3. Obróbka form

Uwaga: Prototyp opisany w niniejszej pracy wykorzystuje wykonany na zamówienie element formy w kształcie litery Y ze stali nierdzewnej. Forma posiada jeden kanał wlotowy oraz dwa kanały wylotowe o średnicach odpowiednio 4 i 3 mm. Najpierw należy oczyścić formy, spryskać je nienasyconym smalcem i wysterylizować. Formy należy przygotować zgodnie z procedurą opisaną poniżej.

  1. Oczyść stalowe formy za pomocą sonikatora o częstotliwości 35 kHz. Umieść formy w sonikatorze i zanurz je w wodzie z lodem. Przez cały czas pracy sonikatora należy utrzymywać niską temperaturę form. Uruchom sonikator na 2 cykle po 90 min.
    1. Po każdym cyklu użyj igły, aby upewnić się, że w stalowym lub mosiężnym złączu Luer lock nie pozostał żaden materiał. Umyj wodą z mydłem całą powierzchnię obu stron form. Sprawdź, czy w kanałach nie ma żadnych zatorów.
  2. Umieść formy, śruby i złącze Luer lock w worku do autoklawowania i poddaj je autoklawowaniu.
  3. Napełnij do połowy butelkę przystosowaną do natryskiwacza powietrznego dostępnym w handlu smalcem (środkiem uwalniającym na bazie mieszanych kwasów tłuszczowych). Zamień korek na zwykłą zakrętkę od butelki. Umieść butelkę w worku do autoklawowania i poddaj ją autoklawowaniu.
    Uwaga: Smalec jest stosowany w celu ułatwienia uwalniania materiału, który zostanie wstrzyknięty w późniejszej reakcji (guma BSA). Nie wkładaj nakrętki natryskiwacza do autoklawu – może to uszkodzić wewnętrzną uszczelkę.
  4. Podgrzewaj smalec w kuchence mikrofalowej przez 45 sec lub do momentu, aż stanie się przejrzysty i płynny. Przykręć nakrętkę natryskiwacza do butelki ze smalcem. Połącz nakrętkę z natryskiwaczem. Podłącz natryskiwacz do źródła powietrza przy stole laboratoryjnym. Otwórz zawór powietrza i uruchom dyszę natryskiwacza, aż zacznie zwilżać powierzchnię ręcznika papierowego.
  5. Natryskuj smalec prostopadle do powierzchni formy, aż zostanie ona całkowicie pokryta. Po spryskaniu każdego elementu umieść go w szalce Petriego i szczelnie ją zamknij. Przechowuj formy w temperaturze 4 °C przez 2 hr.
  6. Przeprowadź sterylizację form poprzez naświetlanie ich powierzchni światłem UV przez 30 min. Ponownie umieść je w temperaturze 4 °C do czasu rozpoczęcia wstrzykiwania reakcyjnego.

4. Wstrzykiwanie odczynnika do gumy BSA

Uwaga: Wszystkie materiały i roztwory należy przechowywać w niskiej temperaturze aż do momentu użycia, aby zapobiec przedwczesnemu sieciowaniu gumy BSA w kolejnych etapach.

  1. Przygotuj dozownik do podawania gumy BSA do form, wykonując następujące kroki.
    1. Zesterylizuj wszystkie komponenty mieszające (dwa pierścienie O-ring, korek strzykawki, podwójną strzykawkę, końcówkę mieszającą i dozownik 4:1), wystawiając je na działanie światła UV przez 30 min w komorze do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
      Uwaga: Wykorzystano komorę PCR, ponieważ procedura ta obejmuje utrwalacze. Odczynników tych nie można stosować w komorze do hodowli komórkowych/tkanek ze względu na ryzyko ekspozycji i toksyczność dla komórek. Odpowiednia będzie każda inna komora wyposażona w lampę UV.
    2. Załóż kapturek końcówki na uchwyt do roztworu.
    3. Przeprowadź mieszanie i wtryskiwanie w stosunku 4:1 BSA:glutaldehyd. Dodaj 30% BSA do komory podwójnej strzykawki, która będzie podawać największą ilość roztworu (do wypełnienia potrzeba około 4 ml). Pamiętaj, aby pozostawić wystarczająco dużo miejsca na pierścień O-ring, aby zapobiec przelewaniu się i zanieczyszczeniu sąsiedniej komory.
    4. Dodaj 3% roztwór glutaraldehydu do drugiej komory (do wypełnienia potrzeba około 1 ml). Pamiętaj, aby pozostawić wystarczająco dużo miejsca na pierścień O-ring, aby zapobiec przelewaniu się i zanieczyszczeniu sąsiedniej komory.
    5. Umieść podwójną strzykawkę w dozowniku. Przechyl zestaw pionowo tak, aby korek strzykawki znajdował się na górze. Zastąp korek końcówką mieszającą.
    6. Skręć dwie stalowe części formy.
    7. Umieść zestaw w worku autoklawowym.
    8. Aby usunąć powietrze z dozownika, trzymaj go w pozycji pionowej i szybko naciśnij uchwyt jeden raz, aby uwolnić niewielką ilość BSA zmieszanej z glutaraldehydem. Następnie szybko podłącz konektor Luer lock stalowej formy Y do końcówki strzykawki.
    9. Trzymając stalową formę Y w lewej ręce, a dozownik mieszaniny BSA-glutaraldehydu w prawej, na przemian zakrywaj lewy i prawy wylot kanałów odpływowych, dociskając wyloty do ścianek worka autoklawowego, aby upewnić się, że wewnętrzne pustki są wypełnione roztworem. Następnie ułóż formy poziomo i wtryśnij roztwór ponownie.
    10. Odłącz formy od dozownika i umieść je w szalce Petriego o średnicy 25 mm.
    11. Owiń szalkę Petriego Parafilmem, aby zapobiec dehydratacji gumy.
    12. Umieść formę w lodówce w temperaturze 4 °C na noc (O/N).

5. Dostosowanie stężenia kolagenu

Uwaga: Kolagen należy przez cały czas procesu przechowywać w lodzie.

  1. Zmodyfikuj stężenie kolagenu, korzystając z procentowej zawartości składników stałych kolagenu.
    1. Przygotuj 10 ml 1,75% kolagenu, regulując początkowe stężenie kolagenu za pomocą zimnej wody.
    2. Używając skalibrowanego pH-metru, dostosuj pH do wartości 3, używając 12 N kwasu solnego. Nie dodawaj kwasu solnego bezpośrednio do kolagenu – dodaj kwas na ściankę probówki. Po dodaniu kwasu użyj szpatułki, aby wprowadzić kwas do kolagenu i szybko wymieszaj zawiesinę.
    3. Odważ 4 g kolagenu do oddzielnej probówki stożkowej.
    4. Wirowkuj kolagen w celu usunięcia powietrza w temperaturze 4 °C przy 9,343 x g przez 20-30 min.
    5. Sterylizuj dygestorium do hodowli komórkowych promieniami UV przez 30 min, a następnie dodaj 14 µl lamininy do 4 ml kolagenu. Pozwoli to uzyskać końcowe stężenie lamininy 10 µg/µl. Uwaga: Laminina zapewnia integralność strukturalną, adhezję oraz wspomaga różne reakcje komórkowe.
    6. Włącz lampę UV w urządzeniu PCR na 20-30 min przed użyciem dygestorium w celu sterylizacji.
    7. Umieść zatyczkę typu Luer lock, przeznaczoną do strzykawki 20 ml, w etanolu na 2 h. Następnie pozostaw ją do wyschnięcia i wystaw na działanie promieni UV.
    8. Naświetlaj kolagen promieniami gamma przez 8,6 min, aby osiągnąć dawkę 1,200 cGy.
      Uwaga: Czas zależy od rozpadu źródła cezu. Dostosuj czas tak, aby osiągnąć tę samą dawkę.

6. Odlewanie kolagenu na gumie z BSA

  1. Aby spolimeryzować kolagen, należy zastosować stosunek 8:1:1 (kolagen:HEPES:MEM). Poniższa procedura opiera się na początkowej ilości 4 g zakwaszonego kolagenu (z kroku 5.1.8).
    1. Przygotować 0,2 N roztwór HEPES w wodzie i dostosować pH do 9, dodając niewielkie ilości (1-5 µl) roztworu wodorotlenku sodu (NaOH) o stężeniu 1-5 M. Po każdym dodaniu należy monitorować pH roztworu za pomocą skalibrowanego pH-metru. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
    2. Włączyć lampę UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 20-30 min w celu sterylizacji komory.
    3. Zautoklawować pęsetę, szpatułkę i skalpel w celu sterylizacji.
    4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wymieszać 1,5 ml 0,2 N HEPES (pH 9) i 1,5 ml 10x MEM. Należy pamiętać o przechowywaniu mieszaniny w lodzie i wymieszaniu jej w wortexie przez 5 s przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
    5. Aby wysterylizować stanowisko PCR, włączyć lampę UV na 30 min.
    6. Umieścić płytkę 12-dołkową i strzykawkę 20 ml w temperaturze -20 °C na 10 min lub do momentu kontynuacji procedury. Uwaga: Wszystkie materiały należy utrzymać w niskiej temperaturze aż do momentu użycia. Wzrost temperatury indukuje przedwczesną fibrillogenezę kolagenu.
    7. Spryskać 70% etanolem wszystkie probówki i płytki dołkowe, które będą znajdować się w komorze, i pozostawić do wyschnięcia w celu sterylizacji. Umieścić strzykawkę 20 ml w lodzie w celu schłodzenia przed późniejszym użyciem.
    8. W komorze PCR otworzyć stalowe formy, aby zwolnić gumę BSA, a następnie za pomocą skalpela wyciąć kanały odpływowe formy gumowej BSA.
    9. W komorze PCR otworzyć sterylne probówki z kolagenem i dodać 1 ml roztworu HEPES-MEM (przed pobraniem roztworu HEPES-MEM należy upewnić się, że jest on dobrze wymieszany i nie zawiera osadów stałych).
    10. Za pomocą sterylnej szpatułki dokładnie wymieszać kolagen z roztworem buforowym.
    11. Zamknąć probówkę i szybko wymieszać w wortexie, aby uzyskać jednorodny hydrożel.
    12. Przenieść zawartość do schłodzonej strzykawki 20 ml.
    13. Jedną ręką przytrzymać gumę BSA wewnątrz dołka, a drugą nanieść połowę roztworu hydrożelu kolagenowego na dno dołka.
    14. Za pomocą sterylnej pęsety upewnić się, że wlotowe i wylotowe końce gumy dotykają ścianek dołka.
    15. Wlać roztwór kolagenu na górę gumy, aż zostanie ona całkowicie pokryta.
    16. Upewnić się, że guma BSA jest zawieszona w kolagenie i że nie ma pęcherzyków powietrza, szczególnie w pobliżu końców gumy.
    17. Nałożyć pokrywkę i owinąć obwód dołka Parafilmem.
    18. Umieścić w inkubatorze na 1 h w temperaturze 37 °C. Pozostawić włączoną lampę UV w komorze PCR.
  2. Po spolimeryzowaniu kolagenu należy przeprowadzić sieciowanie UV hydrożelu zgodnie z poniższą procedurą.
    Uwaga: Sieciowanie kolagenu zostanie wykonane za pomocą aparatu do sieciowania UV, w którym można kontrolować ilość dostarczonej energii.
    1. Włączyć urządzenie do sieciowania UV i ustawić parametry energii tak, aby napromieniować pustą komorę dawką 630 000 µJ/cm2.
    2. Wyjąć żele z inkubatora.
    3. Spryskać dłonie etanolem i wewnątrz komory jak najszybciej zdjąć pokrywkę.
    4. Zamknąć komorę i przeprowadzić sieciowanie UV hydrożeli, wybierając ustawienie energii i napromieniowując dawką 630 000 µJ/cm2.
    5. Po cyklu sieciowania wyłączyć lampę UV w komorze PCR.
    6. Spryskać dłonie etanolem, otworzyć komorę i szybko nałożyć pokrywkę z powrotem na płytkę dołkową. Przenieść płytkę do komory PCR.
    7. Za pomocą sterylnej szpatułki delikatnie poluzować i wyjąć żel z dołka. Odwrócić żele w komorze, aby usieciować dno hydrożelu. Powtórzyć kroki 6.2.3 i 6.2.4.

7. Trawienie enzymatyczne gumy BSA

  1. Aby uzyskać pusty w środku rusztowanie kolagenowe, należy usunąć guma BSA w sposób, który nie wpłynie na wymiary zatopione w hydrożelu. Procedura jest opisana poniżej.
    1. Włącz lampę UV na 20-30 min, aby wysterylizować komorę z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Przygotuj 0,25% roztwór trypsyny o pH 7,8. Na przykład dla 15 ml wody dodaj 0,0376 g trypsyny do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Dostosuj pH do 7,8, dodając niewielkie ilości (2-5 µl) 1 M NaCl. Umieść roztwór w strzykawce 20 ml i załóż filtr strzykawkowy 0,20 µm. Naciśnij tłok, aby przepuścić ciecz przez filtr, i zbierz sterylny roztwór do nowej probówki.
    3. Włącz kąpiel wodną i ustaw temperaturę na 30 °C.
    4. Po 30 min wyłącz lampę UV. Spryskaj etanolem wszystkie probówki i materiały, które będą używane w komorze.
    5. Przenieś hydrożel kolagenowy pod komorę i umieść w osobnej probówce stożkowej.
    6. Do każdej probówki dodaj około 3-5 ml (wystarczająco, aby pokryć żele) 0,25% roztworu trypsyny o pH 7,8.
    7. Uszczelnij probówki Parafilmem i lekko wymieszaj na wortexie przez około 1 min.
    8. Umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C na 15-24 h. Podczas przebywania w kąpieli wodnej często i lekko mieszaj żele na wortexie, aż guma BSA zostanie strawiona lub usunięta z hydrożelu.
      Uwaga: Aby stwierdzić, czy guma BSA została usunięta, należy sprawdzić, czy guma unosi się w roztworze trypsyny lub czy występują jej rozdrobnione fragmenty. Wewnątrz hydrożelu nie mogą występować żadne widoczne ciemne obszary.
  2. Aby upewnić się, że cała guma BSA i trypsyna zostały usunięte z hydrożeli, przepłucz je zgodnie z poniższym opisem.
    1. Włącz lampę UV w komorze PCR na 20-30 min.
    2. Przygotuj roztwór Mosconasa. Połącz chlorek potasu (KCl, 28,6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glukozę (9,4 mM) i (NaH2PO4, 0,08 mM) w wodzie. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą roztworu 1 M NaOH lub 12 M HCl. Umieść roztwór w strzykawce 20 ml i użyj filtra strzykawkowego 0,20 µm, aby wysterylizować roztwór.
    3. Przed umieszczeniem w komorze spryskaj wszystko etanolem i poczekaj, aż etanol wyschnie.
    4. Otwórz probówkę i przenieś 5-10 ml sterylnego roztworu Mosconasa do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    5. Przenieś hydrożel kolagenowy do probówki stożkowej zawierającej roztwór enzymu. Upewnij się, że hydrożel jest całkowicie pokryty roztworem. Pozostaw probówkę w wytrząsarce w lodówce w temperaturze 4 °C przez 30 min.
    6. Odsuń roztwór Mosconasa i powtórz krok 7.2.5 dwukrotnie.
    7. Przechowuj w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki wykazują, że ta technika biofabrykacji jest efektywna w generowaniu rusztowań 3D, które mogą naśladować układ przestrzenny obserwowany w tkance in vivo. Cechy architektoniczne są kluczowymi parametrami w zastosowaniach inżynierii tkankowej, odgrywając istotną rolę w oddziaływaniach komórkowych in vivo oraz funkcjonalności tkanki.

Konsystencja i podatność do mieszania gumy z BSA były ważnymi parametrami w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biofabrykacja to wysoce multidyscyplinarna dziedzina, w której biologia i zasady inżynierii łączą się, aby generować złożone materiały naśladujące rodzimą tkankę. Aby to osiągnąć, konieczne jest opracowanie technik, które wykorzystują informacje zebrane z tkanek in vivo i przekształcają je w rusztowanie in vitro . W ten sposób można zaprojektować platformę, która bardzo przypomina architektoniczne, funkcjonalne i mechaniczne właściwości tkanki in vivo . Optymalny materiał rusztowania powinien p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH-NIDCR IRO1DE019355 (MJ Yost, PI) i NSF-EPSCoR (EPS-0903795).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagen typu IKolagen ekstrahowany ze skóry cielęcej
Kwas hydrokwarowy (HCl)Sigma-Aldrich7647-01-0
Bufor fosforanowy (tabletki PBS)MP BiomedicalU53781 tabletka na 100 ml sprawia, że 1x PBS
Albumium z surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9647
Aldehyd glutarowySigma -AldrichG5882Toxic
LardFields3090
Formyfrezowane za pomocą zestawu szczotki powietrznej do mikrolutacji
Centralna pneumatycznakońcówka mieszająca 47791
do podwójnej strzykawkiMieszalnik MedmixML2.5-16-LLM, DN2,5X16, 4:1 brązowy, med
Mały O-ring do podwójnej strzykawkiMedmixPPB-X05-04-02SMTłok B, 5 ml, 4:1, PE naturalny
Podwójna nasadka strzykawki MedmixVLX002-SMNasadka, 4:1/10:1, PE brązowa, med
Big O-ring do podwójnej strzykawkiMedmixPPA-X05-04-02SMTłok A, 5 ml, Podwójna strzykawka 4:1
MedmixSDL X05-04-50MPodwójna strzykawka, 5 ml, 4:1
Podwójna strzykawka DozownikMedmixDL05-0400MDozownik, 5 ml, 4:1, med, gładki
Laminim3,6 mg/ml - ekstrahowany USC lab
20 ml Końcówka strzykawki Luer LockBD302830
Nasadki Luer LockFisherJGTCBLLX
HEPESSigma -AldrichH4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM)Life Technologies1143-030
TrypsinLife Technologies27250-018
UV Crosslinker Spektrolina UVXLE1000
Klobryd sodu (NaCl)FisherS271-10Do przygotowania Mosconas
Chlorek potasu (KCl)Sigma -AldrichP5405-250Do przygotowania Mosconas
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)FisherBP328-500Aby przygotować Mosconas
GlucoseSigma -AldrichG-8270Przygotować Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS-7907Do przygotowania Mosconas
Sterylny filtr do strzykawekCorning431224
ze stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
  2. Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
  3. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
  4. Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
  5. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
  6. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  7. Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
  8. Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
  9. Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
  10. Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
  11. Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
  12. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  13. Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
  14. Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
  15. Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
  16. Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
  17. Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
  18. Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
  20. Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
  21. Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
  22. Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
  23. Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723(2012).
  24. Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Guma z albuminy surowicy bydlęcejrusztowanie z hydrożelu kolagenowegoprotokół trawienia enzymatycznegodruk trójwymiarowyselektywna aktywność enzymatycznatransfer materiału poświęcalnegoforma zaprojektowana wspomagana komputeroworusztowania do regeneracji tkanek
Trójwymiarowa technologia biomimetyczna: nowatorski biokauczuk tworzy zdefiniowane architektury w mikro i makroskali w hydrożelach kolagenowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.