Artykuł metodologiczny

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

DOI:

10.3791/53585

⸱

25 marca 2016

 ,  , 
1David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, NY

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność limfocytów T CD4 do wykonywania funkcji efektorowych zależy od szybkiej i efektywnej migracji tych komórek w tkankach obwodowych objętych stanem zapalnym za pomocą jeszcze niezdefiniowanego mechanizmu. Zastosowanie mikroskopii wielofotonowej do badania układu odpornościowego stanowi narzędzie do pomiaru dynamiki odpowiedzi immunologicznych w nienaruszonych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół nieinwazyjnego przyżyciowego obrazowania wielofotonowego limfocytów T CD4 w skórze właściwej ucha objętego stanem zapalnym. Zastosowanie niestandardowej platformy obrazowania i cewnika żylnego pozwala na wizualizację dynamiki limfocytów T CD4 w śródmiąższu skórnym, z możliwością badania tych komórek w czasie rzeczywistym poprzez dodanie przeciwciał blokujących do kluczowych składników molekularnych zaangażowanych w ruchliwość. System ten zapewnia przewagę zarówno nad modelami in vitro, jak i inwazyjnymi procedurami obrazowania chirurgicznego. Zrozumienie szlaków wykorzystywanych przez limfocyty T CD4 do ruchliwości może ostatecznie dostarczyć informacji na temat podstawowej funkcji limfocytów T CD4, a także patogenezy zarówno chorób autoimmunologicznych, jak i patologii przewlekłych infekcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcja efektorowa limfocytów T CD4 jest krytycznie zależna od ich zdolności do szybkiego wchodzenia i przechodzenia przez szeroką gamę tkanek obwodowych w celu zbadania uszkodzeń, zlokalizowania ognisk infekcji lub wywołania patologii z przewlekłej infekcji lub autoimmunizacji. Podczas gdy procesy naprowadzania do miejsc objętych stanem zapalnym1-4 i wynaczynienia5-7 z naczyń krwionośnych do tkanek zostały dobrze scharakteryzowane, czynniki napędzające i regulujące ruchliwość śródmiąższową limfocytów T pozostają nieokreślone. Migracja limfocytów T w złożonych środowiskach 3D była badana in vitro przy użyciu sztucznych matryc8-10 lub urządzeń mikroprzepływowych11,12, ale nie są one w stanie odtworzyć złożonego i dynamicznego środowiska systemu in vivo. Dopiero niedawno, wraz z pojawieniem się wielokolorowego obrazowania przyżyciowego o wysokiej rozdzielczości, możliwe stało się badanie dynamicznego zachowania komórek odpornościowych in situ, co pozwala na lepsze zrozumienie nienaruszonych odpowiedzi immunologicznych.

Ponad dziesięć lat temu, opublikowano kilka wpływowych badań, które po raz pierwszy wykorzystały mikroskopię wielofotonową do odpowiedzi na pytania immunologiczne. Wczesne badania koncentrowały się na zachowaniu komórek odpornościowych w eksplantowanych narządach limfatycznych13-16, po których wkrótce zastosowano techniki obrazowania odsłoniętych węzłów chłonnych u znieczulonych myszy17. Obrazowanie pozwoliło na nowe fundamentalne obserwacje dotyczące etapów pobudzania węzłów chłonnych limfocytów T18, mechanizmów, za pomocą których limfocyty T migrują w wtórnych narządach limfoidalnych19, interakcji limfocytów T z innymi komórkami odpornościowymi20,21 oraz dynamicznego pozycjonowania limfocytów T w węźle chłonnym22. Chociaż wiele wczesnych badań koncentrowało się na dynamice węzłów chłonnych, obrazowanie przyżyciowe było od tego czasu wykorzystywane do obrazowania odpowiedzi immunologicznej w wielu tkankach obwodowych, w tym w mózgu23-25, wątrobie26, płucach27 i skórze28-30.

Skóra właściwa ucha myszy jest szczególnie dobrze przygotowana do obrazowania, ze względu na cienkość skóry ucha, względny brak włosów i łatwość, z jaką można ją odizolować od ruchów oddechowych31. Rzeczywiście, skóra właściwa ucha została wykorzystana do obrazowania śródmiąższowego zachowania komórek dendrytycznych32,33, limfocytów T28,29,34,35 i neutrofili36,37 i jest dobrze ugruntowanym miejscem do badania zapalenia skóry. Coraz częściej zabiegi nieinwazyjne zastępują chirurgiczne preparaty skóry, w tym modele rozszczepionej skóry właściwej38,39, boku39,40 lub grzbietowego okienka płata skórnego39,41, które mogą wywołać zmiany w miejscowym środowisku zapalnym. Zastosowanie przeniesionych, sytuowanych in vitro, specyficznych dla antygenu efektorowych limfocytów T CD4 pozwala na badanie jednorodnej populacji komórek w kontekście skórnej odpowiedzi zapalnej30. Tutaj opisujemy nieinwazyjną procedurę obrazowania, która pozwala na wizualizację specyficznych dla antygenu efektorowych limfocytów T CD4 w śródmiąższu skóry ucha myszy objętego stanem zapalnym oraz możliwość manipulowania tymi komórkami w czasie rzeczywistym poprzez wprowadzenie przeciwciał blokujących przez cewnik żylny. Pokazujemy, że ten model jest skuteczny w śledzeniu ruchu limfocytów T CD4 w skórze właściwej i w badaniu mechanizmów rządzących tą ruchliwością.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Rochester i przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt oraz Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie Humanitarnej Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych administrowaną przez National Institutes of Health, Office of Laboratory Animal Welfare.

1. Przygotowanie efektorowych limfocytów T CD4

UWAGA: BALB/c TCR-transgeniczne myszy DO11.10, które rozpoznają peptyd z albuminy jaja kurzego (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Inne systemy transgeniczne TCR mogą być podstawione, przy użyciu odpowiedniego pokrewnego peptydu zamiast pOVA, jeśli jest to wskazane.

  1. Oczyść naiwne limfocyty T CD4
    1. Poddaj eutanazji 6-8 tygodniową samicę myszy DO11.10 BALB/c, wystawiając ją na działanie 2 l/min CO2 do momentu, gdy mysz nie wykaże żadnych oznak ruchu lub oddychania przez 1 minutę, po czym nastąpi zwichnięcie szyjki macicy lub zgodnie z wytycznymi lokalnego komitetu ds. Instytucjonalnej Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania. Spryskaj mysz 70% roztworem etanolu i wykonaj około 7 cm nacięcie w skórze od podbródka myszy do 2/3 długości brzucha. Wykonaj 2-3 cm nacięcia skóry od końca nacięcia w brzuchu w kierunku tylnych łap. Uważaj, aby nie przeciąć otrzewnej.
    2. Ostrożnie oddziel skórę od otrzewnej, delikatnie ciągnąc kleszczami. Pachwinowe węzły chłonne znajdują się na skórze w pobliżu połączenia tylnych nóg z ciałem. Usunąć, chwytając i ciągnąc kleszczami, i umieścić w 8 ml HBSS uzupełnionym 2% surowicą dla noworodków cielęcych (NCS).
    3. Zbierz pachowe i ramienne węzły chłonne od myszy, delikatnie chwytając i ciągnąc kleszczami. Umieścić w HBSS +2% NCS z pachwinowymi węzłami chłonnymi.
    4. Zbierz głębokie i powierzchowne węzły chłonne szyjne znajdujące się na szyi myszy za pomocą kleszczy i umieść w HBSS + 2% NCS z innymi węzłami chłonnymi.
    5. Delikatnie wciąć w otrzewną, uważając, aby nie wciąć się w jelita. Chwyć jelito ślepe i okrężnicę kleszczami i odsłoń krezkowe węzły chłonne, które znajdują się tuż wzdłuż okrężnicy. Ostrożnie usuń krezkowe węzły chłonne za pomocą kleszczy i umieść je z innymi węzłami chłonnymi.
    6. Zlokalizuj śledzionę w jamie otrzewnej i ostrożnie ją usuń, przytrzymując kleszczami i odcinając tkankę łączną nożyczkami chirurgicznymi. Umieść śledzionę z węzłami chłonnymi.
    7. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, wlewając HBSS + 2% NCS zawierający śledzionę i węzły chłonne do metalowego sitka umieszczonego w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 15 mm. Delikatnie przetrzeć śledzionę i węzły chłonne przez metalowe sitko za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 10 ml do HBSS + 2% NCS.
    8. Za pomocą pipety przenieś zawiesinę komórek do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przepłukać metalowe sitko i naczynie hodowlane dodatkowymi 10 ml HBSS + 2% NCS za pomocą pipety i umieścić ten roztwór w tej samej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, co zawiesina komórkowa.
    9. Wirować komórki w temperaturze 600 x g przez 5 minut, aby uzyskać granulki i ponownie zawiesić w 10 ml HBSS + 2% NCS, delikatnie pipetując. O ile nie określono inaczej, wszystkie wirowanie powinno być przeprowadzane przy 600 x g przez 5 minut.
    10. Rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek w 90 μl 0,1% błękitu trypanowego w PBS do rozcieńczenia 1:10. Umieścić 10 μl komórek w błękitu trypanowym na hemocytometrze, pipetując roztwór do rowka na krawędzi hemocytometru. Policz białe krwinki w środkowej siatce hemocytometru, ignorując erytrocyty, które wydają się być nieco mniejszymi, okrągłymi, czerwonymi komórkami i niebieskimi martwymi/umierającymi komórkami. Pomnożyć liczbę komórek policzonych przez 104, przez współczynnik rozcieńczenia (10) i przez objętość komórek (10 ml), aby określić całkowitą liczbę komórek zebranych w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    11. Aby wzbogacić limfocyty T CD4, odwirować komórki do osadu i ponownie zawiesić komórki w dawce 2x107 komórek/ml w roztworze zawierającym około 1 μg/ml przeciwciała anty-CD8 (klon 3,155), 1 μg/ml anty-MHC klasy II (klon M5/114) i 1 μg/ml przeciwciała anty-CD24 (klon J11d) w HBSS + 2% NCS, delikatnie pipetując.
      UWAGA: Przeciwciała użyte na tym etapie pochodzą z linii komórkowych hybrydoma, a ich stężenia są przybliżone. Stężenie i objętość tych przeciwciał idealnych do lizy dopełniacza zostały określone empirycznie i będą się różnić w zależności od laboratorium. Alternatywnie, dostępnych na rynku jest kilka dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania naiwnych limfocytów T CD4 i można je zastąpić przedstawionym tutaj procesem lizy dopełniacza i oczyszczania CD62L +. W przypadku stosowania innej metody oczyszczania naiwnych limfocytów T CD4, protokół ten można kontynuować od kroku 1.2.
    12. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Pod koniec tej inkubacji należy szybko rozmrozić uzupełnienie świnki morskiej, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na około 2 minuty. Dodać 100 μl dopełniacza na każdy 1 ml komórek w roztworze przeciwciała, pipetując dopełniacz bezpośrednio do zawiesiny komórek. Inkubować komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    13. Dodać HBSS + 2% NCS, aby doprowadzić komórki do całkowitej objętości 20 ml w probówce wirówkowej. Umieścić pod komórkami 8 ml pożywki wirówkowej o gęstości RT (gęstość 1,086 g/ml). Natychmiast odwirować komórki przy 1400 x g przy suchej temperaturze przez 15 minut przy wyłączonym hamulcu wirówki.
    14. Zebrać komórki na granicy faz za pomocą pipety serologicznej i przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyć komórki, doprowadzając objętość w probówce wirówkowej do 50 ml za pomocą HBSS + 2% NCS i odwirować.
    15. Ponownie zawiesić komórki w buforze MACS (PBS uzupełniony o 2% NCS i 2 mM EDTA) delikatnie pipetując i policzyć jak poprzednio, w kroku 1.1.10.
    16. Aby wzbogacić o naiwne limfocyty T CD4, ponownie zawieś komórki w dawce 2x107 komórek/ml w roztworze 2,5 μg/ml przeciwciała anty-CD62L sprzężonego z biotyną w buforze MACS, na podstawie liczby zliczonej w kroku 1.1.16. Inkubować przez 30 minut na lodzie.
    17. Umyj komórki, dodając 10 ml buforu MACS, a następnie odwiruj komórki. Ponownie zawiesić komórki w 10-7 komórkach/100 μl w buforze MACS i dodać kulki separacji magnetycznej sprzężone ze streptawidyną w rozcieńczeniu 1:10 bezpośrednio do komórek. Inkubować na lodzie przez 20 minut.
    18. Umyć komórki jak poprzednio, w kroku 1.1.17, i ponownie zawiesić komórki w temperaturze 2x108 komórek/ml w buforze MACS, w minimalnej objętości 500 μl.
    19. Umieść kolumnę separacji magnetycznej w uchwycie magnesu i umyj kolumnę, przepuszczając 3 ml buforu MACS. Nałóż komórki na kolumnę za pomocą pipety.
    20. Przemyć kolumnę w celu usunięcia komórek niezwiązanych z kolumną magnetyczną, pipetując 3 ml buforu MACS na kolumnę i pozwalając buforowi MACS przepłynąć, a następnie powtórzyć 3 razy. Odrzuć przepływ przez frakcję.
    21. Wyjmij kolumnę ze stojaka magnetycznego i przytrzymaj nową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml. Odpipetować 5 ml buforu MACS na kolumnę i użyć tłoka dołączonego do kolumny, aby przepchnąć bufor MACS przez kolumnę w celu uwolnienia komórek związanych z kolumną i zebrania przepływu zawierającego wzbogacone naiwne limfocyty T CD4.
    22. Odwirować komórki i ponownie zawiesić w 10 ml RPMI uzupełnionym 10% surowicą płodu cielęcego (FCS), 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 50 μM 2-merkaptoetanolu (RPMI-10). Policz komórki jak poprzednio, w kroku 1.1.10.
    23. Dostosuj końcowe stężenie naiwnych limfocytów T CD4 do 6x105/ml w RPMI-10.
  2. Oczyść APC śledziony zubożone w limfocyty T
    1. Poddaj eutanazji 6-8 tygodniową samicę myszy BALB/c typu dzikiego, jak w kroku 1.1.1.
    2. Spryskaj mysz 70% roztworem etanolu i odsłoń śledzionę, wykonując około 3 cm nacięcie po lewej stronie brzucha myszy. Rozetnij warstwę otrzewnej i usuń śledzionę, delikatnie chwytając ją kleszczami i odcinając od leżącej poniżej tkanki łączącej nożyczkami chirurgicznymi.
    3. Umieścić śledzionę w 8 ml HBSS + 2% NCS.
    4. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, rozgniatając śledzionę, umyć i policzyć komórki, jak poprzednio, w krokach 1.1.7-1.1.10
    5. Zubożyć limfocyty T przez obracanie komórek w temperaturze 600 x g przez 5 minut do osadzania, a następnie ponownie zawiesić komórki w temperaturze 2x107 w roztworze około 1 μg/ml przeciwciała anty-Thy1.2 (klon J1J) przez delikatne pipetowanie. Inkubować komórki na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: To przeciwciało zostało uzyskane wewnętrznie z linii komórkowej hybrydoma, a stężenie jest przybliżone. Stężenie i objętość tego przeciwciała idealnego do lizy dopełniacza zostało określone empirycznie i będzie się różnić w zależności od laboratorium. W razie potrzeby można zastąpić inne metody oczyszczania APC ze splenocytów. Nieleczone limfocyty T i APC należy przygotować w hodowli od kroku 1.3.
    6. Dodać dopełnienie świnki morskiej, inkubować i rozdzielać komórki na gradiencie pożywki wirowej o gęstości, jak poprzednio, w krokach 1.1.13-1.1.14.
    7. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml RPMI-10 i napromieniować APC, umieszczając komórki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w promienniku gamma na czas taki, który wystawi komórki na działanie promieniowania 25 Gy. Ten czas będzie się różnić w zależności od promiennika i będzie musiał być obliczany za każdym razem, gdy komórki są napromieniowywane.
    8. Policz komórki na hemocytometrze, jak poprzednio, w kroku 1.1.10, i dostosuj komórki APC do końcowego stężenia 2,4x106 komórek/ml w RPMI-10.
  3. Stymuluj komórki i różnicuj limfocyty T CD4 do fenotypu Th1 w 5-dniowej hodowli.
    UWAGA: Chociaż przedstawiamy tutaj protokół przygotowania i obrazowania efektorów Th1 generowanych z naiwnych limfocytów T CD4, protokół ten można dostosować w celu różnicowania naiwnych komórek do innego fenotypu lub do użycia innych typów komórek, takich jak limfocyty T CD8. Warunki gruntowania i różnicowania będą musiały zostać określone empirycznie.
    1. W każdym dołku 24-dołkowej szalki hodowlanej połącz 500 μl naiwnych limfocytów T CD4 i 500 μl napromienionych APC w każdym dołku, co daje w sumie 3x105 limfocytów T i 1,2x106 APC na studzienkę.
    2. Przygotować roztwór w RPMI-10 zawierający 2 μM pokrewny peptyd OVA, 20 U/ml rekombinowanego IL-2, 80 μg/ml anty-IL-4 (klon 11B11) i 40 ng/ml rekombinowanego IL-12 i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Dodać 1 ml tego roztworu do każdej studzienki komórek, uzyskując całkowitą objętość 2 ml w każdym dołku.
    3. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 3 dni.
    4. W dniu 3 należy podzielić kultury, delikatnie pipetując w celu ponownego zawieszenia komórek i przenosząc 1 ml z każdej studzienki do nowej studzienki. Doprowadzić każdą studzienkę do końcowej objętości 2 ml, dodając 1 ml/studzienkę RPMI-10 + 20 U/ml rekombinowanej IL-2.
    5. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i pozwolić komórkom rozszerzyć się do 5 dnia.

2. Transfer komórek i indukcja stanu zapalnego

UWAGA: Aby uzyskać optymalną liczbę komórek do obrazowania, 5x106 fluorescencyjnie znakowanych komórek Th1 powinno zostać przeniesionych do każdej myszy w całkowitej objętości 200 μl PBS. Komórki są tutaj oznaczone zielonym barwnikiem CFSE lub prawie czerwonym barwnikiem CMTMR, chociaż można użyć innych barwników śledzących komórki. Komórki znakowane CFSE i CMTMR mogą być przenoszone jednocześnie, aby umożliwić śledzenie dwóch odrębnych populacji efektorowych CD4.

  1. Oznacz efektorowe limfocyty T za pomocą CFSE
    1. Zebrać komórki z szalek hodowlanych, energicznie pipetując komórki w każdym dołku i przenosząc do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z pipetą. Policz komórki jak w kroku 1.1.10, a następnie odwiruj i ponownie zawieś komórki przy 107 komórkach/ml w PBS + 5% NCS.
    2. Rozcieńczyć 5 mM podstawowego roztworu CFSE w stosunku 1:100 w PBS. Dodać 110 μl roztworu CFSE na każdy 1 ml komórek, umieszczając kroplę roztworu CFSE z boku probówki, a następnie szybko kołysząc probówką w przód iw tył, aby dokładnie wymieszać.
    3. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wygasić CFSE, dodając 5 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS) bezpośrednio do probówki z komórkami. Doprowadzić objętość do 50 ml za pomocą PBS + 5% NCS.
    4. Odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w 20 ml PBS + 5% NCS. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, aby umyć komórki łącznie 3 razy. Policz komórki na hemocytometrze, jak poprzednio, w kroku 1.1.10 i ponownie zawieś komórki w sterylnym PBS w stężeniu 2,5 x 107 komórek/ml w celu przeniesienia do myszy.
  2. Oznacz efektorowe limfocyty T za pomocą CMTMR
    1. Zebrać komórki jak powyżej w kroku 2.1.1, a następnie policzyć, odwirować i ponownie zawiesić komórki przy 10 7 komórkach/ml w RPMI-10.
    2. Dodać 10 mM roztworu podstawowego CMTMR bezpośrednio do komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM. Szybko odpipetować komórki, aby dokładnie wymieszać z CMTMR i zapobiec wytrącaniu się barwnika.
    3. Inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Umyj ogniwa 3x w PBS + 5% NCS jak poprzednio, w kroku 2.1.3-2.1.4. Policz i ponownie zawieś komórki w sterylnym PBS w dawce 2,5x107 komórek/ml w celu przeniesienia do myszy.
  3. Przenieś efektorowe limfocyty T do naiwnych 6-8 tygodniowych samic myszy BALB / c.
    1. Narysować zawiesinę krwinek (krok 2.1.4 lub 2.2.3) do strzykawki, zwracając uwagę na usunięcie wszystkich pęcherzyków, trzymając igłę strzykawki stroną do góry, delikatnie przesuwając bok strzykawki i przesuwając tłok w górę i w dół, jeśli to konieczne.
    2. Umieść myszy w czystej klatce i delikatnie podgrzej pod lampą grzewczą, aż żyła ogonowa będzie wyglądać na rozszerzoną naczyniami krwionośnymi. Umieść mysz w urządzeniu krępującym i przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Powoli wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej bocznej. Nie powinno być oporu przy wstrzykiwaniu ani widocznego bulgotania pod skórą.
  4. Wywołanie stanu zapalnego skóry poprzez uodpornienie za pomocą Complete Freund's Adjuvant (CFA)
    UWAGA: W tym protokole stan zapalny jest wywoływany przez śródskórne wstrzyknięcie CFA zemulgowanego antygenem pokrewnym lub niepokrewnym. Inne modele stanu zapalnego mogą zostać zastąpione, chociaż liczba komórek wymaganych do transferu i czas obrazowania będą musiały zostać dostosowane empirycznie.
    1. Przygotować 200 μM roztwór peptydu OVA w sterylnym PBS w probówce do mikrowirówki. Odpipetować równoważną objętość CFA na wierzch roztworu peptydu.
    2. Emulgować roztwór, wciągając go do strzykawki insulinowej 28 G1/2, a następnie zanurzając roztwór z powrotem w probówce mikrowirówkowej, a następnie powtarzając tę czynność około 20 razy. Po pełnym zemulgowaniu roztwór CFA i peptydu utworzy gęstą i nieprzezroczystą mieszaninę.
      UWAGA: do wytworzenia emulsji konieczne jest użycie strzykawki insulinowej ze stałą igłą, ponieważ emulsja zostanie utracona w martwym miejscu w strzykawce z niezamocowaną igłą.
    3. Przetestuj emulsję, upuszczając niewielką ilość na wodę umieszczoną na szalce Petriego. Emulsja powinna pozostać nienaruszona i nie rozpraszać się w wodzie.
    4. Pobrać emulsję do strzykawki insulinowej o pojemności 300 μl 28 G1/2 i mocno docisnąć tłok, aby usunąć duże pęcherzyki powietrza.
    5. Natychmiast po przeniesieniu znakowanych fluorescencyjnie efektorowych limfocytów T znieczulić myszy przez wstrzyknięcie ip 2,2,2-tribromoetanolu w stężeniu 240 mg / kg. Ocenić znieczulenie, delikatnie szczypiąc palec u nogi, podając więcej 2,2,2-tribromoetanolu w odstępach co 1 mg, jeśli to konieczne.
      UWAGA: 2,2,2-tribromoetanol można zastąpić innymi zatwierdzonymi środkami znieczulającymi.
    6. Umieść naparstek na lewym palcu wskazującym i ostrożnie chwyć ucho myszy między lewym kciukiem a palcem wskazującym, tak aby ucho brzuszne było skierowane do góry. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na ucho, ponieważ może to spowodować mechaniczne uszkodzenie skóry.
    7. Wsuń igłę zawierającą emulsję CFA do skóry właściwej, skośną stroną skierowaną do góry i powoli wstrzyknij 10 μl emulsji do ucha. Wstrzyknięcie powinno być umieszczone w zewnętrznej 1/3 małżowiny usznej, nieco poza środkiem, aby umożliwić optymalne obrazowanie.
    8. Monitoruj myszy, dopóki znieczulenie nie ustąpi, a myszy będą w stanie się wyprostować i będą chodzić. Obrazowanie myszy 3 dni po szczepieniu, dając czas na rozwój stanu zapalnego i przeniesienie przeniesionych limfocytów T do skóry właściwej ucha.
      UWAGA: Myszy nie mogą być pozostawione bez opieki w żadnym momencie pod narkozą.

3. Przygotowanie myszy do obrazowania

  1. Przygotuj cewnik
    1. Ostrożnie wyjąć metalową igłę z igły strzykawki 30 G1/2 Tuberculin (TB) za pomocą szczypiec i usunąć nadmiar kleju za pomocą lunety preparcyjnej, aby zobaczyć, że klej został całkowicie usunięty.
    2. Odciąć końcówkę kolejnej igły do strzykawki o pojemności 30 TB G1/2 TB, upewniając się, że pozostała igła jest nadal opatentowana podczas oględzin. Wsuń 18-centymetrowy kawałek rurki medycznej PE-10 na przyciętą igłę i ostrożnie umieść gołą metalową igłę około 5 mm na drugim końcu rurki, tworząc cewnik.
  2. Przepłukać cewnik, wypełniając strzykawkę o pojemności 1 ml TBS sterylnym PBS, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza. Delikatnie umieść cewnik na końcówce strzykawki i delikatnie przepchnij PBS przez cewnik, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z rurki.
    UWAGA: podczas przepychania płynu przez cewnik należy koniecznie trzymać cewnik na strzykawce, aby zapobiec wypychaniu cewnika ze strzykawki przez ciśnienie płynu.
  3. Umieść myszy w czystej klatce i delikatnie podgrzej pod lampą grzewczą, aż żyła ogonowa będzie wyglądać na rozszerzoną naczyniami krwionośnymi. Znieczulij mysz mieszaniną powietrza z pomieszczenia i izofluranu (5% indukcji, 1-2% konserwacji, przy natężeniu przepływu 2 l/min), dostarczaną przez zespół stożka nosowego, który został dołączony do parownika izofluranu. Upewnij się, że mysz jest znieczulona delikatnym szczypnięciem palca u nogi. Stopniowo zwiększać szybkość przepływu izofluranu o 0,1%, jeśli zaobserwuje się ruch. Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu i obrażeniom podczas znieczulenia myszy.
    UWAGA: Ważne jest, aby myszy nigdy nie były pozostawiane bez opieki podczas znieczulenia. Myszy powinny być często monitorowane w celu uzyskania wystarczającego znieczulenia poprzez delikatne szczypanie palca u nogi.
  4. Unieruchom ogon u podstawy za pomocą kleszczy, a następnie wytrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Ostrożnie wsunąć cewnik do bocznej żyły ogonowej i sprawdzić drożność, delikatnie naciskając tłok strzykawki. Nie powinno być oporu przy poruszaniu się i widocznych bulgotaniu PBS pod skórą, jeśli jest on odpowiednio umieszczony. Przymocuj cewnik do ogona, nakładając 1-2 krople kleju tkankowego z cyjanoakrylanu na miejsce wstrzyknięcia i pozostaw do wyschnięcia przez około 30 sekund.
  5. Ostrożnie przytnij włosy z tyłu i po bokach ucha nożyczkami, uważając, aby nie uszkodzić skóry. Przytnij również wąsy. Za pomocą bawełnianego wacika zwilż wewnętrzną powierzchnię ucha PBS.
  6. Obróć mysz i ucho na szklany szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 50 mm nr 1.5. Za pomocą kleszczy delikatnie spłaszcz ucho na szkiełku nakrywkowym, w razie potrzeby przesuwając mysz, aby upewnić się, że ucho jest równo ze szkłem. Usuń nadmiar PBS z ucha, delikatnie osuszając chusteczką higieniczną.
    UWAGA: Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno na ucho, ponieważ cienka skóra może zostać łatwo uszkodzona przy nadmiernym nacisku.
  7. Za pomocą dwóch par zakrzywionych kleszczy chwyć kawałek taśmy z tkaniny o długości około 20 mm wzdłuż w górnych rogach. Umieść dolną część taśmy na szkiełku nakrywkowym w górnej części ucha myszy i nawiń taśmę na resztę ucha, w razie potrzeby odpychając nadmiar włosów za pomocą kleszczy, aby przymocować ucho do szkiełka nakrywkowego. Delikatnie dociśnij taśmę wokół ucha suchym bawełnianym wacikiem, aby zapewnić szczelne uszczelnienie, uważając, aby nie naciskać na samo ucho.
  8. Przymocuj platformę obrazowania do bloku grzewczego o temperaturze 37 °C za pomocą taśmy klejącej. Nałóż smar próżniowy po obu stronach ucha platformy obrazowania. Obróć mysz, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na platformie obrazowania, uważając, aby ustawić ucho na środku filcu.
    UWAGA: Unikaj osadzania się smaru próżniowego na taśmie, ponieważ spowoduje to jej oderwanie się od szkiełka pokrywy szkła.
  9. Zatrzaśnij nosek izofluranu w uchwycie na platformie obrazowania, upewniając się, że stożek nosa jest bezpieczny i całkowicie zakrywa nos myszy. Rozprowadź smar próżniowy pod szkiełkiem nakrywkowym, mocno, ale ostrożnie dociskając szkiełko nakrywkowe do platformy obrazowania czystym, suchym bawełnianym wacikiem.
  10. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do platformy za pomocą dwóch kawałków taśmy o średnicy 20 mm i dwóch dłuższych kawałków taśmy owiniętych wokół górnej części platformy. Jeśli między uchem a szkiełkiem nakrywkowym znajdują się pęcherzyki powietrza, można je delikatnie usunąć, naciskając ucho od dołu kawałkiem złożonego papieru.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie używać zbyt grubego papieru ani mocno dociskać, ponieważ może to spowodować blednięcie i uszkodzenie tkanek, komplikując wyniki.
  11. Przesuń mysz do stolika mikroskopu i zabezpiecz platformę taśmą klejącą. Nałóż podwójną warstwę smaru próżniowego na szkiełko nakrywkowe wokół ucha, aby służyło jako zbiornik na obiektyw do zanurzenia w wodzie.
  12. Owiń mysz wypełnionym wodą kocem grzewczym za pośrednictwem platformy obrazowania. Napełnić zbiornik wodą destylowaną o temperaturze 37 °C. Upewnij się, że wszystko jest przymocowane do stolika taśmą samoprzylepną i że strzykawka cewnika jest łatwo dostępna.

4. Obrazowanie poklatkowe in vivo i dożylne podawanie przeciwciał

UWAGA: Ten protokół wymaga użycia mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w system laserowy Ti:Sa. Zastosowany obiektyw to soczewka o 25-krotnym powiększeniu i 1,05 N.A., wyposażona w grzałkę obiektywu ustawioną na 40 °C. Optymalna temperatura dla tego grzejnika została określona empirycznie jako odpowiednia do utrzymania skóry właściwej na poziomie 37 °C i może wymagać dostosowania do stosowania w innych systemach obrazowania. Używane oprogramowanie do akwizycji może się różnić w zależności od instrumentu, a do pracy w różnych skonfigurowanych systemach może być konieczne dostosowanie protokołu. Upewnij się, że obrazy można zapisać w formacie zgodnym z dowolnym oprogramowaniem do analizy.

  1. Zlokalizuj skórę właściwą przez okulary, umieszczając obiektyw nad środkiem ucha i opuszczając obiektyw tylko do momentu, aż zetknie się z powierzchnią wody w zbiorniku. Korzystając z zewnętrznego źródła światła, spójrz przez okulary i kontynuuj powolne opuszczanie obiektywu, aż powierzchnia ucha stanie się ostra. Opuść wewnętrzną i zewnętrzną kurtynę wokół stolika mikroskopu.
  2. Określ ustawienia mikroskopu i zlokalizuj obszar do obrazowania
    1. Przed obrazowaniem skonfiguruj laser pod kątem maksymalnego wzbudzenia i wykrywania pożądanych fluoroforów, dostosowując długość fali lasera do 900 nm w oknie MP Laser Controller, moc lasera w oknie Acquisition Setting: Laser oraz napięcia PMT w oknie Image Acquisition Control.
      UWAGA: Ta procedura wykorzystuje długość fali wzbudzenia 900 nm z filtrami do wykrywania generowania drugiej harmonicznej (420-460 nm), CFSE (495-540 nm) i CMTMR (575-630 nm). Inne konfiguracje mogą być używane do wykrywania różnych fluoroforów zgodnie z potrzebami.
    2. Ustaw mikroskop na rozdzielczość 512 x 512 pikseli, z czasem przebywania 2 μs/piksel w oknach Acquisition Setting: Size (Ustawienia akwizycji): Rozmiar i Tryb. Aktywuj tryb obrazowania na żywo, aby umożliwić skanowanie przez tkankę w poszukiwaniu obszaru do zobrazowania, klikając "Powtórz XY". Idealnie byłoby, gdyby obszar był stosunkowo jednolity, bez pęcherzyków powietrza i unikał obszarów gęstych mieszków włosowych.
      UWAGA: Emulsja CFA jest jaskrawo autofluorescencyjna w kanale zielonym i prawie czerwonym i należy jej unikać. Optymalne pole można zwykle znaleźć w odległości około 3 mm od krawędzi emulsji. Na jednym obrazie można śledzić około 10 - 100 komórek. Jeśli obecnych jest zbyt wiele komórek, oprogramowanie śledzące zazwyczaj napotka błędy podczas próby oddzielenia blisko położonych komórek, co prowadzi do skrócenia i/lub niedokładnych ścieżek komórek.
    3. Po zlokalizowaniu odpowiedniego pola obrazowania określ obszar Z, który zostanie zobrazowany, lokalizując komórkę "najwyższą" w skórze właściwej, ustawiając pozycję Z na 0, klikając przycisk "Ustaw 0" i przewijając w dół w kierunku Z, aby zmierzyć zakres głębokości komórki. Typowa jest głębokość obrazowania 35-75 μm. Ustaw pozycję początkową i końcową w oknie Acquisition Setting: Mikroskop. Dostosuj napięcie PMT instrumentu i moc lasera w oknie "jasne Z", aby zoptymalizować wizualizację komórek na całej głębokości pola obrazowania.
      UWAGA: Unikaj podnoszenia mocy lasera powyżej 25 mW na próbce, ponieważ wysoki poziom mocy może spowodować uszkodzenie cieplne i sterylne uszkodzenie skóry właściwej. Odpowiedni maksymalny poziom mocy dla każdego mikroskopu będzie się różnił i będzie musiał zostać zmierzony. Należy zauważyć, że zwiększanie mocy lasera lub napięć PMT wraz z głębokością tkanki nie pozwala na ilościowe porównanie jasności obrazu na różnych głębokościach w analizie po akwizycji.
    4. Sprawdź przyciski "Głębokość" i "Czas" pod przyciskiem "Skanuj" w oknie Image Acquisition Control. Ustaw filtr Kalmana tak, aby skanował obraz 3 razy na linię w oknie Image Acquisition Control: Filter Mode (Kontrola akwizycji obrazu: Tryb filtru) i dostosuj głębokość wycinka Z w oknie Image Acquisition: Microscope (Akwizycja obrazu: Mikroskop) tak, aby przechwycenie całego stosu zajmowało około 1 minuty, zgodnie z opisem w oknie TimeView.
      UWAGA: Odstęp między stosami nie powinien trwać dłużej niż około 1 minuty, ponieważ dłuższe interwały uniemożliwiają śledzenie szybko migrujących komórek. W zależności od rodzaju obrazowanych komórek, interwał ten może wymagać dostosowania, aby umożliwić prawidłowe śledzenie komórek przez oprogramowanie analityczne. Plastry Z nie powinny być większe niż 5 μm. Ogólnie rzecz biorąc, 15-18 warstw Z o grubości 2-5 μm jest odpowiednich dla 1-minutowego interwału obrazowania.
  3. Przechwytywanie obrazu poklatkowego przed przeciwciałami
    1. Zrób 5-minutowy obraz poklatkowy obszaru, aby ocenić stabilność tkanki, ustawiając liczbę powtórzeń na "5" w oknie Ustawienie akwizycji: TimeScan i klikając przycisk "Skanuj".
      UWAGA: "Dryf" tkanek może być spowodowany niezapewnieniem uchu wystarczającej ilości czasu na osiągnięcie równowagi termicznej, złym przygotowaniem ucha lub może być spowodowany miejscowym dryfem w jednym obszarze ucha. Jeśli obraz z 5 minut nie jest stabilny, zobrazuj nowy obszar w skórze właściwej. Jeśli drugi obraz w nowym obszarze pozostaje niestabilny, najlepiej jest ostrożnie powtórzyć przygotowanie ucha i obrazowanie od kroku 3.6 z nowym szkiełkiem nakrywkowym.
    2. Jeśli tkanka jest stabilna na obrazie 5-minutowym, zbierz 30-45-minutowy obraz poklatkowy, ustawiając liczbę powtórzeń na od 30 do 45 w oknie Ustawienie akwizycji: TimeScan, monitorując wszelkie drobne dryfty tkanek podczas zbierania obrazu. Zapisz plik w formacie zgodnym z używanym oprogramowaniem analitycznym.
      UWAGA: W tym momencie protokołu kroki 4.2.2 - 4.3.2 można powtórzyć, aby zobrazować wiele lokalizacji w tym samym uchu. Pojedyncza mysz nie powinna być znieczulana dłużej niż 4 godziny, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo śmierci.
  4. Wstrzyknij przeciwciała blokujące i uchwyć obraz po przeciwciałach.
    1. Pobrać mieszaninę przeciwciał do strzykawki o pojemności 1 ml i wyjąć igłę, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte. Nacisnąć tłok tak, aby roztwór przeciwciała utworzył "kropelkę" na końcu strzykawki.
    2. Podnieś zasłony wokół sceny i zlokalizuj cewnik. Wyjąć oryginalną strzykawkę zawierającą PBS z cewnika. Nie odkładając cewnika, ostrożnie podłączyć nową strzykawkę zawierającą przeciwciała. Przytrzymaj koniec cewnika na strzykawce i powoli wstrzyknij mieszaninę przeciwciał do cewnika. Upewnij się, że nie ma oporu przy wstrzykiwaniu.
    3. Odłóż cewnik i opuść zasłony otaczające stolik mikroskopu. Zanotuj czas wstrzyknięcia i natychmiast rozpocznij pobieranie nowej 20-40-minutowej sekwencji obrazowania w tym samym miejscu, używając tych samych ustawień instrumentu, co obraz przed przeciwciałami. Zapisz plik w formacie odpowiednim dla używanego oprogramowania analitycznego.
      UWAGA: Pomiędzy zdjęciami poklatkowymi obserwuj mysz, czy jest wystarczająco znieczulona i oddycha. Nie zaleca się obrazowania więcej niż jednego pola po podaniu przeciwciał, ponieważ tempo usuwania przeciwciał może być zmienne.
  5. Wstrzyknąć znakowany fluorescencyjnie dekstran w celu zlokalizowania naczyń krwionośnych, oceny drożności cewnika i pomiaru przepuszczalności naczyń krwionośnych
    1. Przygotować roztwór 2 mg/ml fluorescencyjnie sprzężonego dekstranu (70 000 MW) w 100 μl sterylnego PBS i pobrać do strzykawki, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza.
    2. Stosując tę samą technikę, co w kroku 4.4.1-4.4.2, umieścić strzykawkę na cewniku i wstrzyknąć dożylnie roztwór dekstranu.
    3. Przechwyć pojedynczy stos w rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli, zmieniając rozdzielczość w oknie Ustawienie akwizycji: Tryb, z tymi samymi ustawieniami PMT i lasera, co w przypadku zdjęć poklatkowych. Aby zebrać obraz, odznacz przycisk "Czas" pod przyciskiem "Skanuj", a następnie kliknij przycisk "Skanuj". Ten obraz 3D pozwoli na wykluczenie limfocytów T znajdujących się w układzie naczyniowym i pokaże, że cewnik został opatentowany i prawidłowo wprowadzony. Dyfuzja fluorescencyjnego dekstranu z naczyń może być również wykorzystana do oceny lokalnej przepuszczalności naczyń krwionośnych.
      UWAGA: Ten statyczny obraz o wysokiej rozdzielczości (1024 x 1024) służy do celów prezentacyjnych i może być dodatkowo wykorzystany do analizy architektury tkankowej w tym samym obszarze, co obrazy poklatkowe. Alternatywnie można wykonać zdjęcie o wymiarach 512 x 512, które można połączyć ze zdjęciami poklatkowymi za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Obrazowanie poklatkowe podawania dekstranu może być również pożądane, w zależności od potrzeb badawczych poszczególnych laboratoriów. W takim przypadku obraz należy skonfigurować tak, jak w krokach 4.2.3-4.3.2.
  6. Po zakończeniu obrazowania ostrożnie wyjmij mysz spod obiektywu i odwiń koc wodny. Usuń szkiełko nakrywkowe z platformy obrazowania, przecinając taśmę i delikatnie podnosząc szkło, aż się odczepi. Gdy mysz jest nadal znieczulona, odłącz ucho od szkiełka nakrywkowego. Jeśli ma to być procedura śmiertelna, należy poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Jeśli zachowujesz tę mysz do wielokrotnego obrazowania, umieść ją z powrotem w czystej klatce oddzielonej od innych myszy i obserwuj, aż mysz będzie w stanie się wyprostować i zacznie chodzić. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia mysz może zostać zwrócona do klatki z innymi zwierzętami.
  7. Zaimportuj pliki obrazowania do programu do analizy obrazu i wprowadź dowolne poprawki. Zaleca się unikanie nieliniowych ulepszeń oraz automatycznych programów i algorytmów wygładzania lub redukcji szumów. Zazwyczaj obrazy wymagają jedynie niewielkiej korekcji tła poprzez ręczne zwiększenie punktu czerni obrazu przed analizą. Analizuj dane obrazowania za pomocą zautomatyzowanego programu do śledzenia komórek z ręczną korekcją, jak w Overstreet, Gaylo i wsp. 30.
    UWAGA: Dostępnych jest wiele pakietów do analizy obrazów, zarówno zastrzeżonych, jak i open source, które można wykorzystać do ilościowego określenia dynamiki komórek na podstawie obrazów wielofotonowych pochodzących z tego protokołu. Dokładny sposób analizy obrazu i optymalne pakiety oprogramowania, które zostaną zastosowane, będą zależały od potrzeb badawczych poszczególnych laboratoriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do badania odpowiedzi immunologicznych in situ bez zmieniania środowiska odpornościowego jest niezbędna w badaniu interakcji efektorowych komórek T z zapalną tkanką w czasie rzeczywistym. Obrazowanie nienaruszonej skóry właściwej ucha zgodnie z tym protokołem, przedstawionym na Rysunku 1A i B, pozwala na wizualizację przeniesionych, znakowanych fluorescencyjnie efektorowych komórek T w przestrzeni śródmiąższowej skóry właściwej. Umożliwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie

Tutaj przedstawiamy kompletny protokół wizualizacji 4D przeniesionych, specyficznych dla antygenu komórek efektorowych Th1 w nienaruszonej skórze właściwej ucha myszy. Metoda ta zapewnia przewagę nad niektórymi obecnymi metodami obrazowania z kilku powodów. Obrazując brzuszną skórę właściwą ucha, jesteśmy w stanie zrezygnować z depilacji, która jest wymagana w protokołach obrazowania obejmujących inne miejsca skóry. Chociaż depilatory są na ogół łagodne, wykazano, że powoduj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Ośrodkowi Mikroskopu Wielofotonowego Uniwersytetu w Rochester za pomoc w obrazowaniu na żywo. Obsługiwane przez NIH AI072690 i AI02851 do DJF; AI114036 do AG i AI089079 do MGO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy BALB/cJackson Laboratories000651Użyte myszy zostały wyhodowane we własnym zakresie
myszy DO11.10JacksonLaboratories 003303Myszy użyte zostały wyhodowane w domu
HBSSFisher10-013-CVWiele równoważnych
noworodków Serum cielęcych (NCS)Thermo/HyCloneSH30118.03Ciepło inaktywowane w temperaturze 56 &; C przez 30 minut
Dopełniacz świnki morskiejCedarlaneCL-5000
przeciwciało anty-CD8ATCC3.155 (ATCC TIB-211)Przeciwciała pochodzące z  tego hybrydoma
przeciwciała anty-MHC klasy IIATCCM5/114.15.2 (ATCC TIB-120)Przeciwciała pochodzące z  tego przeciwciała
anty-CD24hybrydoma ATCCJ11d.2 (ATCC TIB-183)Przeciwciała pochodzące z  to hybrydoma
przeciwciało anty-Thy1.2ATCCJ1j.10 (ATCC TIB-184)Przeciwciała pochodzące z  tego hybrydoma
Ficoll (Fico/Lite-LM)Atlanta BiologicalsI40650
PBSFisher21-040-CVWielokrotny równoważny
EDTAFisher15323591
biotynylowane przeciwciało anty-CD62L (klon MEL-14)BD
paciorkowce separacji magnetycznej streptawidynyMiltenyi130-048-101
Kolumna separacyjna MACS LSMiltenyi130-042-401
rekombinowana ludzka IL-2Peprotech200-02
rekombinowana mysz IL-4Peprotech214-14
rekombinowana mysz IL-12Peprotech210-12
anty-IFNg (klon XMG 1.2)eBioscience16-7311-85
przeciwciało anty-IL-4 (klon 11b11)eBioscience16-7041-85
RPMIVWR45000-412
Penicylina/StreptomycynaFisher15303641
L-glutaminaFisher15323671
2-merkaptoetanolBio-Rad161-0710
peptyd albuminy jaja kurzegoBiopeptydISQAVHAAHAEINEAGR-OH Peptyd
Surowica cielęca płodu (FCS)Thermo/HyCloneSV30014.03Inaktywowany termicznie w temperaturze 56 &; C przez 30 minut
24-dołkowa płytkahodowlana LPS3526Wiele równoważnych
CFSELife TechnologiesC34554
CMTMRLife TechnologiesC2927
28 strzykawek insulinowych G1/2, 1mlBD329420
28 strzykawek insulinowych G1/2, 300μ l
27 G1/2 TB, 1mlIgły BD309623
30 G1/2Rurka305106
PE-10BD427400
cyjanoakrylowy klej weterynaryjny (Vetbond)3M1469SB
grzewczaWPI61830
Regulator płyty grzewczejWPIATC-2000
Kontroler koca wodnegoGaymarTP500Nie jest już produkowany, nowszy odpowiednik dostępny
koc wodnyKent ScientificTP3E
Waporyzator izofluranowyLEI MedicalIsotec 4Nie jest już produkowany, dostępny jest nowszy odpowiednik
izofluranuHenry ScheinZamówiony przez Veterinary
probówki do mikrowirówekVWR20170-038Wielokrotna
równoważna taśma medyczna3M1538-0
nosekZbudowany we własnym zakresie, patrz Rys. 2
platformaZbudowana we własnym zakresie, patrz rys. 2
zakrzywione kleszczeWPI15915-GNożyczki
wielokrotne równoważneRobozRS-6802Wielokrotne równoważne
szkiełka nakrywkoweVWRWiele równoważnych
wysokopróżniowych
Wiele równoważnych
MaiTai HP DeepSee Ti:Salaser Olympuszaproszenie do wyceny
stół optyczny z kontrolą drgańNewportzaproszenie do składania ofert
25x NA 1,05 obiektyw zanurzeniowy do obrazowania wielofotonowegoGrzejnikXLPLN25XWMP2
BioptechsPN 150815
Kostka filtra detekcyjnegoOlympusFV10-MRVGR/XRZastrzeżona kostka, może być aproksymowana na podstawie indywidualnych filtrów/dichroików
antyintegryny i beta; 1 przeciwciało (klon hMb1-1)eBioscience16-0291-85Antyintegryna bez azydków o niskiej zawartości endotoksyn
i beta; 3 przeciwciała (klon 2C9. G3)eBioscience16-0611-82Wolny od azydków, o niskiej zawartości endotoksyn
Texas Red Dextran (70 000 MW)Life TechnologiesD-1830
553149 przeciwciało Strzykawki BD 309301 medyczna BD płyta dla personelu izofluranowy obrazowania smarów Waciki bawełniane Fisher 146355D delikatnych chusteczek do zadań Fisher 34155 Wielokrotny odpowiednik Mikroskop pionowy Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM z fizyką widm obiektywowy Olympus

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
  2. Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
  3. Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
  4. Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
  5. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  6. Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
  7. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  8. Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
  9. Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
  10. Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
  11. Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
  12. Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
  13. von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
  14. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
  15. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  16. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
  18. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
  19. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  20. Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
  21. Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
  22. Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
  23. Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
  24. Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
  25. Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
  26. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  27. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  28. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
  29. Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
  32. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  33. Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
  34. Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
  35. Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
  36. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  37. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  38. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135(2013).
  39. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  40. Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
  41. Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
  42. Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
  43. Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
  44. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  45. Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
  46. Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
  47. Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
  48. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  49. Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
  50. Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
  51. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  52. Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie intravitalnemikroskopia wielofotonowamigracja limfocyt w Tucho myszyplatforma obrazuj cawstrzykiwanie przeciwciatime lapseklej tkankowy

Powiązane artykuły