Artykuł metodologiczny

Generowanie "humanizowanej" linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5

DOI:

10.3791/53594

⸱

20 stycznia 2016

 , 
1Molecular and Cellular Biology Graduate Group, Biology Department, University of Massachusetts, Amherst

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak wygenerować linię komórkową Drosophila S2, która jest wrażliwa na małocząsteczkowe inhibitory kinezyny-5. Przedstawiono również zastosowanie tych komórek w teście korekcji błędów opartym na komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinetochores to duże struktury oparte na białkach, które gromadzą się na centromerach podczas podziału komórki i łączą chromosomy z mikrotubulami wrzecionowatymi. Prawidłowa dystrybucja materiału genetycznego wymaga, aby kinetochory siostrzane na każdym chromosomie stały się dwukierunkowe poprzez przyłączanie się do mikrotubul z przeciwległych biegunów wrzeciona przed przejściem do anafazy. Jednak błędne, niedwukierunkowe stany przyłączenia są powszechne i istnieją szlaki komórkowe, które zarówno wykrywają, jak i korygują takie przyłączenia podczas podziału komórki. Proces, w którym destabilizowane są nieprawidłowe interakcje kinetochor-mikrotubule, jest określany jako korekcja błędów. Aby zbadać korekcję błędów w żywych komórkach, nieprawidłowe mocowania są celowo generowane poprzez chemiczne hamowanie silnika kinezyny-5, co prowadzi do montażu wrzeciona monopolarnego, a przejście od złej orientacji do dwuorientacji obserwuje się po wypłukaniu leku. Duża liczba chromosomów w wielu modelowych typach komórek hodowli tkankowej stanowi wyzwanie w obserwacji poszczególnych zdarzeń korekcji błędów. Drosophila Komórki S2 są lepszymi obiektami do takich badań, ponieważ posiadają zaledwie 4 pary chromosomów. Jednak małocząsteczkowe inhibitory kinezyny-5 są nieskuteczne przeciwko Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Tutaj opisujemy, jak zbudować linię komórkową Drosophila, która skutecznie zastępuje Klp61F ludzką kinezyną-5, co sprawia, że komórki są wrażliwe na farmakologiczne hamowanie motoryczne i nadają się do zastosowania w teście korekcji błędów na bazie komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednakowa segregacja genomu podczas podziału komórki wymaga prawidłowych interakcji między replikowanym DNA a mikrotubulami wrzeciona. Mikrotubule fizycznie oddziałują z chromosomami poprzez zestaw białek, który gromadzi się w centromerach znanych jako kinetochor1. Prawidłowa dystrybucja chromosomów wymaga, aby kinetochory siostrzane były dwukierunkowe, w których każda siostra jest związana z mikrotubulami pochodzącymi z przeciwległych biegunów wrzeciona. Przyczepy mikrotubul kinetochorowych (kt-MT), które nie są w konformacji dwukierunkowej, są szybko i skutecznie destabilizowane, aby zapewnić możliwość ustanowienia dwuorientacji w procesie znanym jako korekcja błędów. Test korekcji błędów, który został wcześniej opracowany w komórkachssaków5, wymaga montażu wrzecion monopolarnych przy użyciu odwracalnych inhibitorów małych cząsteczek przeciwko Eg5 (kinezynie-5). Leczenie farmakologiczne generuje wiele błędnych przyczepów syntelicznych, w których oba siostrzane kinetochory przyczepiają się do tego samego bieguna wrzeciona. Późniejsze wypłukanie leku pozwala na wizualizację procesu korekcji błędów. Test korekcji błędów można przeprowadzić w obecności inhibitorów małych cząsteczek lub knockdownów w celu zbadania udziału białek kandydujących w korygowaniu błędnych przyłączeń kt-MT.

Możliwość wizualizacji korekcji błędów w żywych komórkach jest potężnym narzędziem do dalszego zrozumienia mechanizmu molekularnego związanego z tym złożonym procesem. Jednak duża liczba chromosomów obecnych w większości linii komórkowych stanowi wyzwanie w obserwacji poszczególnych przyłączeń kt-MT. Drosophila Komórki S2 byłyby idealne do zastosowania testu korekcji błędów, ponieważ zawierają zaledwie 4 chromosomy6, ale małocząsteczkowe inhibitory kinezyny 5, takie jak S-trytylo-L-cysteina (STLC) i monoastrol7-9, nie wpływają na montaż wrzeciona ani funkcję motoryczną kinezyny-5 w komórkach Drosophila. W związku z tym wygenerowaliśmy linię komórkową Drosophila S2 wykazującą ekspresję ludzkiej kinezyny-5 pod indukowalnym promotorem, który jest wrażliwy na inhibitory kinezyny-5. Protokół ten opisuje, w jaki sposób zniszczyć endogenny homolog kinezyny-5 Drosophila, Klp61F, i użyć tej linii komórkowej w teście korekcji błędów na bazie komórek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfekcja komórek S2

  1. Z uprzednio wyhodowanej kolby o długości 25cm2 dodać komórki S2 wykazujące ekspresję GFP-α-tubuliny10 do końcowej objętości 2 ml przy 100% zbiegu i pozostawić je do częściowego przylegania do dna naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm przez około 1 godzinę.
  2. Wyjmij nośnik z naczynia. Transfekcję 2 μg konstruktu Eg5-mCherry11 należy przeprowadzić za pomocą 1 ml pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS (zwanej dalej pożywką Schneidera) i odczynnikiem do transfekcji, zgodnie z protokołem producenta. Uszczelnić naczynie preparatem Parafilm i inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez 16-18 godzin.
  3. Dodać 1 ml pożywki Schneidera. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 25 °C.
  4. W 3 dniu po transfekcji przenieść 500 μl transfekowanych komórek do nowego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającego 1,5 ml pożywki Schneidera w celu indukcji testowej. Wywołać ekspresję Eg5-mCherry poprzez dodanie CuSO4 do końcowego stężenia 500 μM. Zamknąć szalkę w Parafilm i inkubować w temperaturze 25 °C O/N.
  5. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte konkanawaliną A, należy pobrać pipetą wystarczającą objętość roztworu konkanawaliny A (0,5 mg/ml rozpuszczonego wH2O), aby pokryć szkiełko nakrywkowe przemyte kwasem, usunąć nadmiar i pozostawić szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu.
  6. Umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm pokryte konkanawaliną A w czystym naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm, a następnie zasiać 500 μl przy 100% zbiegu indukowanych komórek na szkiełku nakrywkowym i pozostawić komórki do przylegania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Aby sprawdzić ekspresję Eg5-mCherry, złóż szkiełko nakrywkowe w komorze różanej (lub odpowiednim naczyniu do obrazowania) z pożywką do obrazowania w RT na mikroskopie fluorescencyjnym. Użyj odpowiednich źródeł światła i zestawów filtrów, aby uwidocznić komórki. Na przykład mikroskop użyty w tym badaniu ma źródło białego światła LED oraz kostki filtrujące EGFP (FITC/Cy2) i DSRed (TRITC/Cy3). Eg5-mCherry lokalizuje się w mikrotubulach i jest wzbogacany w pobliżu biegunów wrzeciona.
  8. Po upewnieniu się, że komórki wykazują ekspresję zarówno Eg5-mCherry, jak i tubuliny GFP-α, przenieś pozostałą część transfekowanych, nieindukowanych komórek do kolby do hodowli tkankowej o długości 25cm2 zawierającej 4 ml pożywki Schneidera.
  9. Dodać Blasticydynę S HCL w końcowym stężeniu 25 μg/ml do kolby transfekowanych komórek i kontynuować rozszczepianie w obecności 25 μg/ml Blasticidin S HCl, aż do ustania śmierci komórki, upewniając się, że okresowo sprawdzasz ekspresję Eg5-mCherry. Inkubować linie komórkowe w inkubatorze w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Odsetek komórek wykazujących ekspresję Eg5-mCherry wzrasta z czasem.
  10. Gdy komórki zostaną stabilnie transfekowane, kontynuuj dzielenie pod nieobecność leku i zamroź12 komórek do wykorzystania w przyszłości.

2. Interferencja RNA

  1. PCR amplifikuje region Klp61F o długości ~ 500 pz z cDNA (LD15641) za pomocą startera z dodaną sekwencją promotora T7 (sekwencja podana w wykazie materiałów), która ma być użyta jako matryca do syntezy dsRNA.
    1. Przygotuj cztery reakcje PCR, każda po 50 μl, zawierające 100 ng matrycy DNA, 25 μM każdego startera, odpowiedni bufor i polimerazę. Ustaw protokół PCR na termocyklerze zgodnie z protokołem producenta polimerazy.
    2. Zebrać i oczyścić cztery reakcje PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z protokołem producenta. Przechowywać czysty szablon w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj dwuniciowy RNA (dsRNA) z matrycy za pomocą zestawu do transkrypcji RNA T7, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Spodziewaj się stężenia dsRNA ~5-15 mg/ml. Przechowywać dsRNA w temperaturze -20 °C.
  3. Aby zniszczyć Klp61F za pomocą dsRNA, pozwól komórkom S2 wyrażającym Eg5-mCherry przy 25% konfluencji częściowo przylegać do dna 35-milimetrowej płytki do hodowli tkankowej przez 1 godzinę.
  4. Usunąć pożywkę z szalek i dodać 5 μg dsRNA przeciwko Klp61F (Drosophila kinesin-5) rozcieńczonej w 1 ml pożywki Schneidera bez surowicy.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie dodać 1 ml pożywki Schneidera z 10% FBS. Inkubować komórki w temperaturze 25 °C.
  6. 24 godziny po traktowaniu dsRNA indukować ekspresję Eg5-mCherry poprzez dodanie CuSO4 do końcowego stężenia 500 μM. Inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez kolejne 24 godziny.

3. Obrazowanie żywych komórek

  1. Umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm pokryte konkanawaliną A w czystym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
  2. Wysiewaj 500 μl komórek, które zostały potraktowane dsRNA i indukowane O/N na szkiełku nakrywkowym pokrytym konkanawaliną A i pozwól im przylegać przez około 1 godzinę.
  3. Zmontuj szkiełko nakrywkowe w komorze różanej (lub odpowiednim naczyniu) w celu obrazowania.
  4. Znajdź komórki mitotyczne wykazujące ekspresję zarówno Eg5-mCherry, jak i GFP-α-tubuliny.
    UWAGA: Komórki mitotyczne eksprymujące tylko tubulinę GFP-α powinny mieć wrzeciona monopolarne, ponieważ Klp61F, który jest wymagany do dwubiegunowości wrzeciona, jest strącony10,13.
  5. Zbierz obrazy poklatkowe wrzecion dwubiegunowych (np. 1 klatka na minutę) w komórkach wyrażających zarówno Eg5-mCherry, jak i GFP-α-tubulinę.
  6. Podczas obrazowania wyjmij pożywkę z komory rozetowej i zastąp ją pożywką Schneidera zawierającą 1 μM STLC w ciągu 3 kolejnych wymian mediów (łącznie ~5 ml) do komory, aby uwidocznić zapadanie się wrzeciona.
  7. Aby wypłukać lek i odwrócić zapadanie się wrzeciona, ostrożnie wyjmij pożywkę zawierającą STLC z komory różowej i umyj w pożywce Schneidera 4x (łącznie 6-8 ml) przed ponownym napełnieniem komory różowej po raz ostatni świeżym podłożem. Kontynuuj obrazowanie.

4. Test korekcji błędów

  1. Umieścić szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm pokryte konkanawaliną A w czystych szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
  2. Wysiewaj 500 μl komórek, które zostały potraktowane dsRNA Klp61F, na szkiełko nakrywkowe pokryte konkanawaliną A i pozwól im przylegać.
  3. Po przyklejeniu komórek dodaj 1,5 ml pożywki Schneidera do każdej pożywki, aby uzyskać ostateczną objętość do 2 ml.
  4. Aby zatrzymać komórki w mitozie, dodaj MG132 do końcowego stężenia 10 μM do każdej z szalek i inkubuj przez 1 godzinę.
  5. Dodać 1 μM STLC i inkubować przez 1 godzinę, aby umożliwić powstanie monopoli.
  6. Umyj STLC, spłukując szkiełka nakrywkowe 3x za każdym razem 2 ml świeżej pożywki Schneidera.
  7. Inkubuj szkiełka nakrywkowe z pożywką Schneidera jako dodatek do wszelkich leków farmakologicznych (np. inhibitorów kinazy Aurora) lub DMSO jako kontrolę.
    Uwaga: Stężenia inhibitorów są różne, a właściwe stężenia końcowe muszą być określone przez eksperymentatora. Roztwory podstawowe są zwykle przygotowywane w taki sposób, że inhibitor jest rozcieńczany w stosunku 1:1000 do podłoża. W tym przypadku rozcieńczenie DMSO (lub odpowiedniego rozpuszczalnika) w stosunku 1:1 000 służy jako kontrola nośnika. Stosujemy inhibitor Aurora B binukleinę 2 w końcowym stężeniu 40 μM.
  8. Utrwal komórki w różnych punktach czasowych, aby obserwować postęp tworzenia wrzeciona dwubiegunowego i ocenić stany przyczepienia kinetochoru. Rozwiązanie problemu:
    1. Szybko spłucz szkiełka nakrywkowe 2 ml 1x BRB-80.
    2. Napraw komórki, dodając 2 ml 10% paraformaldehydu rozcieńczonego w 1x BRB-80 przez 10 minut. Ostrożnie odpipetuj paraformaldehyd w kapturze chemicznym.
    3. Przepuszczalność komórek za pomocą 2 ml 1x PBS + 1% Triton-X przez 8 min.
    4. Szkiełka myjące 3x z 2 ml 1x PBS + 0,1% Triton-X.
    5. Przenieś szkiełka nakrywkowe stroną komórkową do góry na arkusz Parafilmu (użyj markera, aby odpowiednio oznaczyć Parafilm, aby śledzić szkiełka) na szalce Petriego o średnicy 150 mm.
    6. Przykryj szkiełka nakrywkowe 150 μl gotowanej surowicy osła (BDS) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał.
      Uwaga: W tym przypadku protokół fiksacji można zatrzymać, aby kontynuować go w późniejszym czasie. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C do 24 godzin. Aby wykonać komorę wilgotnościową, wyłóż brzeg naczynia o średnicy 150 mm wilgotną chusteczką laboratoryjną i przykryj pokrywką szalki Petriego.
    7. Usunąć blok i inkubować szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej ze 150 μl przeciwciał pierwszorzędowych odpowiednio rozcieńczonych w BDS w celu wybarwienia kinetochorów i mikrotubul do końcowych stężeń odpowiednio 2 μg/ml (lub zgodnie z zaleceniami producenta) i 1 μg/ml.
      Uwaga: W tym przypadku protokół fiksacji można zatrzymać, aby kontynuować go w późniejszym czasie. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C do 24 godzin.
    8. Szkiełka nakrywkowe umyć 3x 500 μl 1x PBS + 0,1% Triton-X.
    9. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem rozcieńczonymi w BDS.
    10. Szkiełka nakrywkowe umyć 3x 500 μl 1x PBS + 0,1% Triton-X.
    11. Inkubować szkiełka nakrywkowe ze 150 μl BDS o końcowym stężeniu 1 μg/ml DAPI przez 5 minut.
    12. Szkiełka nakrywkowe należy umyć 2x za pomocą 1x PBS + 0,1% Triton-X i zamontować szkiełka nakrywkowe stroną do dołu na szkiełku 3x1" z 8 μl nośnika montażowego. Pomaluj rogi lakierem do paznokci, aby unieruchomić szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.
  9. Komórki obrazu z dwubiegunowymi wrzecionami, które wyrażają Eg5-mCherry. Weź serię Z składającą się z 30 płaszczyzn w odstępach 0,2 μm we wszystkich kanałach za pomocą obiektywu 100X. Dokładnie przeanalizuj kinetochory i mikrotubule, aby określić stany przyłączenia (przyczepy dwukierunkowe lub synteliczne).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klp61F jest wymagany do tworzenia wrzecion dwubiegunowych. Ludzka kinezyna-5, Eg5, może uratować funkcję Klp61F w komórkach Drosophila S2 (Figura 1A i D). Po dodaniu inhibitora kinezyny-5 (STLC) poziomy silnika związane z mikrotubulami spadają (ryc. 1B i E), a wrzeciono zapada się, co powoduje powstanie monopolu (ryc. 1C i F) w komórkach pozbawionych endogennego Klp61F po udanym RNAi (film uzupełniający 1). Warto zauważyć, że wrzeciona dwubiegunowe zapadają się po dodaniu STLC do humanizowanych komórek S2, ponieważ aktywność kinezyny-5 nie jest wymagana do utrzymania dwubiegunowości wrzeciona w komórkach ludzkich. Ta interesująca rozbieżność może wynikać z różnic w nakładaniu się mikrotubul międzypolarnych i/lub stabilności w dwóch układach modelowych14. Hamowanie kinezyny-5 (ryc. 2A i E) można odwrócić poprzez wypłukanie leku, a powrót do zdrowia wrzeciona dwubiegunowego można śledzić z czasem. Po usunięciu inhibitora (Figura 2B i F), Eg5-mCherry ponownie wiąże się z mikrotubulami, gdy gromadzi się wrzeciono bipolarne (Figura 2C i G), a komórki mogą przejść do dwubiegunowej anafazy (Figura 2D i H, film uzupełniający 2).

figure-results-1
Rysunek 1. Dodanie 1 μM STLC prowadzi do powstania wrzecion monopolarnych w komórkach Drosophila S2. Reprezentatywne obrazy z obrazowania poklatkowego komórki Drosophila S2 eksprymującej Eg5-mCherry (AC) i GFP-α-tubulinę (D-F) podczas dodawania 1 μM STLC. Inhibitor Eg5 dodawano po 3 minutach. Podziałka = 5 μm. Znacznik czasu = min:sek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Wrzeciono dwubiegunowe reformuje się po usunięciu STLC. Reprezentatywne obrazy z obrazowania poklatkowego komórki Drosophila 2 wykazującej ekspresję Eg5-mCherry (A-D) i GFP-α-tubuliny (E-H) podczas eksperymentu wymywania STLC. STLC wypłukano po 5 minutach. Wrzeciono bipolarne reformuje się w ciągu 1 godziny od wyjęcia STLC. Podziałka = 5 μm. Znacznik czasu: min:sec. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Film uzupełniający 1. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać). Obrazowanie fluorescencyjne szerokokątne reprezentatywnego przykładu komórki Drosophila S2 z ekspresją Eg5-mCherry (po lewej) i GFP-α-tubuliny (po prawej). 1 μM STLC dodano po 2 minutach, a wrzeciono tworzy monopol w ciągu 10 minut po dodaniu inhibitora. Obrazy były rejestrowane co 1 minutę i odtwarzane z szybkością 10 klatek na sekundę. Podziałka = 5 μm.

figure-results-4
Film uzupełniający 2. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać). Obrazowanie fluorescencyjne szerokokątne reprezentatywnego przykładu komórki Drosophila S2 z ekspresją Eg5-mCherry (po lewej) i GFP-α-tubuliny (po prawej). Pożywkę zawierającą 1 μM STLC usunięto i przepłukano po 5 minutach. Wrzeciono dwubiegunowe reformuje się w ciągu 1 godziny od usunięcia inhibitora. Obrazy były rejestrowane co 1 minutę i odtwarzane z szybkością 10 klatek na sekundę. Podziałka = 5 μm.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja korekcji błędów jest cenną techniką do badania etapów związanych z tym ważnym i złożonym procesem komórkowym. W tym celu za pomocą odwracalnych inhibitorów generowane są błędne przyłączenia, a po wypłukaniu leku obserwuje się korekcję błędów. Test ten został pierwotnie opracowany przy użyciu komórek hodowli tkankowych ssaków5. Jednak obecność dużej liczby kinetochorów w wielu modelowych typach komórek ssaków stanowi wyzwanie w obserwacji poszczególnych zdarzeń korekcji błędów. Drosophila Komórki S2 posiadają zaledwie 4 pary kinetochorów, co czyni je bardziej preferowaną linią komórkową do obserwacji korekcji błędów. Jednak główną wadą jest to, że wiele inhibitorów jest nieskutecznych w komórkach Drosophila S2. Tak więc zdolność do generowania humanizowanej linii komórkowej Drosophila S2 eksprymującej ludzką kinezynę-5 stanowi cenne narzędzie do badania korekcji błędów.

Chociaż komórki Drosophila S2 mogą być lepszą linią komórkową do badania korekcji błędów, wiele etapów związanych z uzyskaniem linii komórkowej i zniszczeniem niezbędnych genów stanowi pewne wyzwanie dla tej techniki. Na przykład wydajność transfekcji może być dość niska. Jeśli mniej niż 20% komórek wykazuje ekspresję Eg5-mCherry, transfekcję należy powtórzyć, ponieważ proces selekcji potrwa dłużej. Również odsetek komórek wykazujących ekspresję obu białek fluorescencyjnych może z czasem ulec zmniejszeniu. Można to przezwyciężyć poprzez podział komórek w obecności blastycydyny S HCl i higromycyny B w celu wyselekcjonowania komórek wykazujących ekspresję odpowiednio Eg5-mCherry i GFP-α-tubuliny. Ważne jest również, aby pamiętać, że komórki Drosophila S2 mają ortologie do wielu ludzkich białek i; Dlatego tak ważne jest zoptymalizowanie warunków knockdown dla białek endogennych. Optymalne warunki knockdown mogą różnić się ilością dsRNA i długością leczenia. Biorąc pod uwagę pojawienie się i szybki postęp technologii CRISPR-Cas915-17, generacja linii komórkowej Drosophila z genem Klp61F zastąpionym ludzkim Eg5 stanowi potężną alternatywę, która pokonałaby ograniczenia podejścia opartego na transfekcji i knockdown. Nasza praca pokazuje, że wymiana genów z muchy na człowieka powinna być w tym przypadku realną opcją, chociaż obecnie opracowywane są niezbędne odczynniki do tego w komórkach Drosophila S2.

Procedura ta nie ogranicza się do Eg5, ale może być stosowana do badania funkcji innych interesujących białek. W przypadku stosowania inhibitorów, które wcześniej okazały się nieskuteczne w komórkach Drosophila S2, protokół ten można zmodyfikować w celu zbadania bezpośredniego wpływu inhibitorów na żywe komórki bez obaw o efekty niepożądane. Linia komórkowa wytworzona przy użyciu tego protokołu może być również wykorzystana w wysokoprzepustowych analizach przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnych leków ukierunkowanych na białka zaangażowane w korekcję błędów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Patricii Wadsworth za dar w postaci konstruktu kinesin-5. Praca ta była wspierana przez grant NIH (5 R01 GM107026) dla T.J.M. oraz przez grant badawczy nr 5-FY13-205 od Fundacji March of Dimes dla T.J.M., a także wsparcie od Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. do T.J.M.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik do transfekcji EffectineQiagen301425
Klp61F cDNADrosophila Genomic Resource Center13690Nazwa genu LD15641
Schneider' s MediaInvitrogen21720-024
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowanaInvitrogen10082-147Inaktywowana termicznie, pochodzący z USA
siarczan miedzi(II) (CuSO4)SigmaC8027-500G500  mM kolba
S-trytyl-L-cysteinaSigma164739-5G1  Zapasy mM w DMSO
Blasticidin HClInvitrogenR210015  mg / ml zapas w 1x PBS
Hygromycyna BInvitrogen10687010
T7 System do produkcji RNA na dużą skalęPromegaP1320Przybliżone stężenie dsRNA z każdej reakcji wynosi około 5-15  &mikro; g/&mikro; l
Klp61F RNAi F primerInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R primerInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATGAAAC
PCR clean-up kitMo Bio Laboratories, Inc1250
Concanavalin ASigmaC52750.5  mg/ml roztwór sporządzony przez rozpuszczenie w 1x PBS.
Gotowana surowica osłaJackson ImmunoResearch Labs017-000-1215% roztwór podstawowy w 1x buforze PHEM, doprowadzić roztwór do wrzenia. Przechowywane w 4  °C.
Nośniki montażowe20  mM Tris pH 8,0,0,  0,5% galusanu N-propylu, 90% glicerolu. Przechowywane w 4  °C.
1x BRB-8080 mM RURY pH 6,9; 1  mM EGTA; 1 mM MgCl2
Źródło światła białegoLumencor Inc
ET EGFP Filtr CubeChroma49002
DSRed Filter CubeChroma49005
anty-NDC80 Wykonane na zamówienie przez Maresca Lab
DM1α (anty-&alfa;-tubulina)Przeciwciało anty-CID SigmaT6199
AbCamab10887
przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheeseman, I. M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).
  2. Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
  4. Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
  5. Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
  6. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
  7. Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
  8. Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
  9. Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2(2006).
  10. Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
  11. Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187(2013).
  12. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
  13. Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
  14. Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
  15. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  16. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  17. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki Drosophila S2hamowanie kinezyny 5test korekcji b d whumanizowana linia kom rkowawyciszenie KLP61Fekspresja Eg5 mCherrytraktowanie lekiem STLCobrazowanie ywych kom rekmikroskopia fluorescencyjnazapadanie si wrzeciona

Powiązane artykuły