Artykuł metodologiczny

Metoda kwantyfikacji guza oparta na bioluminescencji do monitorowania progresji guza i efektów leczenia w modelach chłoniaka myszy

22.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53609

⸱

7 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genethon, 2Cordeliers Research Center, INSERM U872, 3Matter and Complex Systems Laboratory, Université Paris Diderot, 4INSERM U951, 5UMR_S951, Université d'Evry Val d'Essonne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie bioluminescencyjne jest dobrze znanym narzędziem do lokalizacji guzów i przerzutów, ale kwantyfikacja tych obrazów często wymaga skomplikowanych obliczeń i specjalnych instrumentów. Opisujemy łatwą w użyciu metodę luminoscore, opartą na precyzyjnych warunkach akwizycji, niewymagającą obliczeń i umożliwiającą monitorowanie obciążenia guzem i odpowiedzi na leczenie w modelach mysich.

Streszczenie

Chociaż obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) jest obiecujące w monitorowaniu obciążenia nowotworem w zwierzęcych modelach raka, te analizy pozostają głównie jakościowe. W tym miejscu opisujemy metodę obrazowania bioluminescencyjnego w celu uzyskania półilościowej analizy obciążenia guzem i odpowiedzi na leczenie. Metoda ta opiera się na obliczeniu luminoscore, wartości, która umożliwia porównanie dwóch zwierząt z tego samego lub różnych eksperymentów. Obecne instrumenty BLI umożliwiają obliczenie tego luminoscore'u, który opiera się głównie na warunkach akwizycji (akwizycje z tyłu i z przodu) oraz na rysunku obszaru zainteresowania (ręczne znaczniki wokół myszy). Korzystając z dwóch wcześniej opisanych modeli chłoniaka myszy opartych na wszczepieniu komórek, pokazujemy, że metoda luminoscore może służyć jako nieinwazyjny sposób weryfikacji udanej inokulacji komórek nowotworowych, monitorowania obciążenia guzem i oceny efektów leczenia raka in situ (CpG-DNA). Na koniec pokazujemy, że ta metoda pasuje do różnych projektów eksperymentalnych. Sugerujemy, aby metoda ta była stosowana do wczesnego oszacowania odpowiedzi na leczenie w przedklinicznych badaniach na małych zwierzętach.

Wprowadzenie

Wczesne wykrywanie komórek nowotworowych pozostaje wyzwaniem i jest kluczowe dla zwiększenia skuteczności leczenia raka. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo (BLI) jest bardzo czułą, nieinwazyjną techniką optyczną, szeroko stosowaną do monitorowania nowotworów u małych zwierząt. Komórki eksprymujące lucyferazy świetlika są powszechnie używane do takich eksperymentów1,2. Ta oksygenaza utlenia D-lucyferynę tlenem cząsteczkowym, ale wymaga dwóch kofaktorów - Mg2 + i trifosforanu adenozyny3. Lucyferazy świetlików są bardziej odpowiednie do obrazowania in vivo niż lucyferazy renilla4, ponieważ ich wydajność kwantowa jest wyższa.

Utleniony substrat - oksylucyferyna - spontanicznie emituje foton, aby powrócić do swojego podstawowego stanu, a następnie staje się nieaktywny. Emitowane fotony mają maksymalną długość fali około 530 nm. Kamera o wysokiej czułości może wykryć luminescencyjne fotony z wnętrza małego zwierzęcia i dostarczyć obrazy, które umożliwiają zlokalizowanie komórek nowotworowych.

Możliwość dokładnego ilościowego określenia obciążenia guzem za pomocą liczby fotonów może służyć jako potężne i czułe narzędzie do ilościowego określania skuteczności leczenia. Ponieważ efekty leczenia można wykryć wcześniej, ta czułość może umożliwić określenie dokładnego momentu, w którym leczenie staje się skuteczne.

Bezwzględna kwantyfikacja całkowitej ilości wyemitowanych fotonów jest bardzo złożona. Liczba zebranych fotonów zależy od głębokości guza i narządów, przez które fotony są emitowane. Współczynniki korekcyjne oparte na współczynnikach absorpcji tkankowej można obliczyć5, ale bezwzględna kwantyfikacja liczby komórek nowotworowych wymaga znajomości liczby fotonów emitowanych przez każdą komórkę nowotworową. Co więcej, ekspresja lucyferazy, podobnie jak w przypadku wielu genów reporterowych (np. białek fluorescencyjnych) nie jest jednorodna, nawet w populacji komórek pochodzących z pojedynczego klonu6. Nie można dokładnie obliczyć liczby białek lucyferazy w komórkach. Ustalenie znormalizowanych warunków eksperymentalnych wydaje się zatem kluczowe dla wiarygodnej analizy półilościowej.

Zastosowaliśmy metodę luminoscore do dwóch różnych modeli chłoniaka myszy7,8,9. W tych modelach syngeniczne komórki nowotworowe są wstrzykiwane do oka lub pod skórę w celu uzyskania odpowiednio modelu pierwotnego chłoniaka wewnątrzgałkowego (PIOL) i modelu chłoniaka podskórnego (SCL). W każdym z tych modeli ortotopowych leczenie podaje się in situ, siedem dni po inokulacji guza w kierunku PIOL i gdy guz osiągnie od 0,5 do 0,7 cm największej średnicy dla SCL.

Użyliśmy metody luminoscore do monitorowania efektów terapii CpG in situ, która wcześniej okazała się skuteczna7,10,11. CpG to sekwencja oligonukleotydowa i ligand TLR9, który z kolei jest receptorem wewnątrzkomórkowym wyrażanym przez liczne komórki układu odpornościowego, w tym komórki dendrytyczne, limfocyty B, monocyty i komórki NK . CpG-DNA to 20-merowa sekwencja DNA, która zawiera motyw immunostymulujący CpG (CG); kontrola (kontrola ODN) to ta sama 20-merowa sekwencja DNA, z wyjątkiem tego, że immunostymulująca sekwencja CG jest odwrócona (GC). Zaangażowanie TLR9 w badanym przez nas chłoniaku mysim indukuje apoptozę10, aktywuje układ odpornościowy12, a tym samym znacznie zmniejsza obciążenie guza7,11.

Tutaj opisujemy ustandaryzowaną metodę ilościowego określania obciążenia guzem i odpowiedzi na leczenie za pomocą obrazów bioluminescencyjnych. Metoda ta opiera się na różnych aspektach procedury obrazowania, od akwizycji po analizę, w celu optymalizacji wiarygodności, odtwarzalności, zależności od użytkownika i istotności statystycznej. Każdemu myszowi przypisuje się wskaźnik kwantyfikacji bioluminescencji; Ta wartość, którą nazywamy Luminoscore, może być porównywana nie tylko między zwierzętami, ale także między eksperymentami.

W tej pracy skupiamy się na procedurze obrazowania bioluminescencyjnego, jak również na kwantyfikacji obrazu metodą luminoscore. Pokazujemy skuteczność tej metody w weryfikacji iniekcji, monitorowaniu obciążenia guzem i ocenie skuteczności leczenia raka in situ. Każdy z tych punktów jest zilustrowany reprezentatywnymi wynikami eksperymentów z wykorzystaniem różnych modeli myszy, aby podkreślić zdolność adaptacyjną metody luminoscore.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem myszy były zgodne z wytycznymi Unii Europejskiej, francuskimi przepisami dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach (ustawa Ministerstwa Rolnictwa nr 2001-464 z maja 2001 r.) oraz wytycznymi Komitetu ds. Badań na Zwierzętach Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) i zostały zatwierdzone przez odpowiednią komisję lokalną (Komitet Etyki Karola Darwina ds. Doświadczeń na Zwierzętach, Paryż, Francja; Numer zezwolenia: p3/2009/004).

1. Przygotowanie komórek

  1. Hoduj linię komórkową chłoniaka B myszy A20. IIA-luc2 w pożywce RPMI-1640 Glutamax uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 mM pirogronianu sodu, 50 μM 2-merkaptoetanolu i 0,50 mg/ml higromycyny B.
  2. Utrzymuj hodowlę komórkową w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni. Zebrać 5 ml zawiesiny komórkowej za pomocą pipety jeden dzień po zmianie podłoża.
  3. Obracać komórki w temperaturze 300 × g przez 10 minut i zawiesić je w 3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powtórz ten krok dwukrotnie, aby umyć komórki.
  4. Zmieszać 15 μl zawiesiny komórek z 30 μl etykiety Trypan Blue przed załadowaniem komory liczącej Malassez. Oblicz stężenie komórek za pomocą wzoru: Stężenie (komórki/ml) = Liczba komórek w siatce zliczającej * 3 * 1000.
  5. Obracać komórki jeszcze raz w masie 300 x g przez 10 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety. Przy stężeniu C obliczonym w kroku 1.4), liczba komórek wynosi N = C*3.
  6. Obliczyć objętość sterylnego PBS 1x wymaganą do otrzymania zawiesiny komórek A o stężeniu 5 x 107 komórek/ml według następującego wzoru: Objętość PBS (ml) = N / (5 x 107). Zawiesić osad komórkowy (od kroku 1.5)) w objętości sterylnego PBS 1x obliczonej w poprzednim zdaniu. Zawiesinę komórkową A stosuje się w modelu SCL (in vivo wstrzyknięta objętość wynosi 100 μl: 5 x 106 komórek).
  7. Pobrać pipetą 10 μl zawiesiny komórek A i dodać 90 μl sterylnego PBS do probówki o pojemności 1,5 ml, aby otrzymać 100 μl zawiesiny komórek B przy 5 x 106 komórek na ml. W modelu PIOL należy użyć zawiesiny komórek B (in vivo wstrzyknięta objętość wynosi 2 μl: 1 x 104 komórki).

2. Lucyferyna

  1. Rozcieńczyć 1 g soli potasowej D-lucyferyny w proszku w 30 ml sterylnego PBS 1x w probówce o pojemności 50 ml i wstrząsać przez kilka sekund w celu rozpuszczenia agregatów.
    UWAGA: Ponieważ lucyferyna jest wrażliwa na światło, przygotuj 500 μl porcji w ciemnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Podwielokrotności mogą być przechowywane przez kilka miesięcy.
    Po rozmrożeniu podwielokrotności nie mogą być przechowywane dłużej niż 1 dzień w temperaturze + 4 °C. Cykle zamrażania i rozmrażania są lepsze niż przechowywanie w temperaturze 4 °C.
  3. Wstrzyknąć 100 μl roztworu soli potasowej D-lucyferyny dootrzewnowo do każdego testu obrazowego.
    UWAGA: Roztwór ten odpowiada 3,3 mg na mysz dla dawki 150 mg/kg.

3. Mieszanina znieczulająca i znieczulenie

  1. Przygotować roztwór znieczulający, mieszając ketaminę 120 mg/kg i ksylazynę 6 mg/kg w sterylnym PBS 1x.
  2. Wstrzyknąć dootrzewnowo 60 μl mieszaniny znieczulonej do każdego testu obrazowego za pomocą igły 25 G. W przypadku zabiegu chirurgicznego (z modelem PIOL lub SCL) wstrzyknąć 80 μl mieszaniny w celu uzyskania głębszego znieczulenia. Umieść mysz z powrotem w klatce.
  3. Gdy mysz wydaje się nieruchoma, wyjmij ją z klatki i delikatnie ściśnij nogę myszy między palcami. Jeśli mysz zareaguje odruchem ucieczki, odczekaj kilka minut. Czynność należy powtarzać do momentu, aż mysz przestanie reagować, co potwierdza zadowalające znieczulenie.
  4. Umieść mysz na płycie grzewczej lub pod ogrzewającym światłem.
  5. Zastosuj maść do oczu, aby uniknąć suchości oka podczas znieczulenia do testu obrazowego lub do operacji SCL. Nałożyć maść do oczu po zabiegu na model PIOL.

4. Chirurgia i inokulacja komórek

UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać na płycie grzewczej lub w ogrzewającym świetle, w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego typu 1 w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego zwierząt 2. Wszystkie narzędzia chirurgiczne używane w tej sekcji zostały autoklawizowane przed użyciem.

  1. Model chłoniaka podskórnego:
    1. Przygotować 100 μl zawiesiny komórek otrzymanej w kroku 1.6 w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą 25 G. Delikatnie ścisnąć skórę myszy na boku między palcami, w miejscu wstrzyknięcia. Wbić igłę dokładnie w fałd skórny. Aby zapewnić wstrzyknięcie podskórne, nie należy umieszczać igły głęboko w tkance.
      1. Wstrzyknąć komórki do fałdu skórnego. Należy obserwować, czy pod skórą nie pojawiła się mała kulka płynu, aby upewnić się, że wstrzyknięcie zostało wykonane prawidłowo.
  2. Model PIOL:
    UWAGA: Ta procedura wymaga 2 operatorów, nazywanych tutaj operatorem 1 i operatorem 2.
    1. Usunięcie spojówki:
      1. Niech Operator 1 umieści mysz pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie naciśnij palcami po obu stronach oka, aby je oczyścić. Utrzymaj tę pozycję.
      2. Niech Operator 2 look przepuści mikroskop preparacyjny. Chwyć spojówkę małą parą szczypiec jedną ręką; Drugą ręką przetnij spojówkę tuż pod szczypcami za pomocą małych nożyczek chirurgicznych.
      3. Niech Operator 1 zwolni oko myszy wciśnięte w kroku 4.2.1.1)
    2. Wstrzyknięcie komórki:
      1. Przygotuj 10 μl strzykawki precyzyjnej. Umyj go, pompując przez niego sterylną wodę dejonizowaną. Powtórzyć dwa lub trzy razy, aby upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków. Następnie należy przygotować 2 μl zawiesiny komórek do wstrzykiwań.
      2. Poproś Operatora 2, aby delikatnie nacisnął palcami jednej ręki po obu stronach oka, aby je oczyścić. Utrzymaj tę pozycję.
      3. Poproś operatora 1, aby chwycił krawędź oka małymi szczypcami w jedną rękę i delikatnie pociągnął ją do tyłu, aby rozciągnąć tkankę.
      4. Niech Operator 2 look przepuści mikroskop preparacyjny. Drugą ręką zrób mały otwór w dolnej gałce ocznej myszy za pomocą igły 32 G.
      5. Poproś Operatora 2, aby odłożył igłę i podniósł (tą samą ręką) precyzyjną strzykawkę i włożył igłę do otworu wykonanego w kroku 4.2.2.4.
      6. Poproś operatora 1, aby drugą ręką nacisnął tłok strzykawki.
      7. Niech Operator 2 stwierdziza pomocą mikroskopu preparacyjnego, że zawiesina komórek w strzykawce została prawidłowo wstrzyknięta do gałki ocznej (przepływ cieczy jest łatwo widoczny).
      8. Poproś operatora 2 owyjęcie strzykawki precyzyjnej.
      9. Proszę zmusić operatora 1 do uchwyceniakrawędzi oka zwierzęcia w kroku 4.2.2.3)
      10. Zlecić operatorowi 2 przyciśnięcieboków ucha w kroku 4.2.2.2)
      11. Natychmiast nałóż maść na oczy.
        UWAGA: Jeśli wszystkie kroki zostały wykonane poprawnie, mysz nie powinna w ogóle krwawić podczas tej procedury.

5. Obrazowanie bioluminescencyjne – Dzień 0

UWAGA: Wszystkie produkty wstrzykiwane do myszy muszą mieć temperaturę RT przed wstrzyknięciem. Po zaszczepieniu komórek nowotworowych i gdy zwierzę jest nadal znieczulone, przejdź do tych kroków w celu obrazowania.

  1. Włącz imager i otwórz oprogramowanie do akwizycji. Zainicjuj kamerę, sceny i obiektywy, klikając przycisk "Zainicjuj". Inicjalizacja potrwa od 10 do 15 minut.
  2. Wstrzyknąć 100 μl roztworu soli potasowej D-lucyferyny dootrzewnowo za pomocą igły 25 G. Nie należy podawać go dożylnie. Jeśli z jakiegokolwiek powodu wymagane jest podanie dożylne, należy użyć soli sodowej D-lucyferyny zamiast soli potasowej D-lucyferyny.
    UWAGA: Lucyferyna jest nadmiarem reagenta w tym stężeniu; Dlatego sygnał bioluminescencji osiąga plateau po 3 do 7 minutach i utrzymuje się przez ponad 30 minut.
  3. 10 minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny13 umieść badaną mysz w imagerze. Ustaw mysz w naturalnej pozycji, tyłem do aparatu, w jak najbardziej płaskiej pozycji. Ta pozycja jest naturalna i łatwa do powtórzenia.
  4. Zaznacz funkcję automatycznej ekspozycji i kliknij Uzyskaj, aby uzyskać tylne (tylne) zdjęcie zwierzęcia za pomocą funkcji automatycznej ekspozycji.
    UWAGA: Funkcja automatycznej ekspozycji optymalizuje czas ekspozycji, obliczając go na podstawie obrazu z 1-sekundową ekspozycją. Jeśli sygnał bioluminescencji myszy jest ujemny lub bardzo niski, optymalny czas ekspozycji może zostać automatycznie ustawiony na ponad 20 minut. W takim przypadku czas naświetlania od 8 do 10 minut może być dobrym kompromisem. Czas naświetlania można ustawić ręcznie, ale obrazy nie mogą zawierać nasyconych pikseli.
  5. Odwróć mysz, aby odsłonić przód myszy przed kamerą. Spróbuj spłaszczyć mysz i rozłożyć jej przednie kończyny, aby nie blokowały klatki piersiowej.
  6. Zdobądź zdjęcie zwierzęcia z przodu. Sprawdź, czy pole wyboru automatycznej ekspozycji jest nadal zaznaczone i ponownie kliknij przycisk "Pobierz".
    UWAGA: Obraz z przodu można uzyskać przed obrazem z tyłu i odwrotnie. Czas naświetlania przednich i tylnych obrazów może się różnić w zależności od względnej intensywności każdej strony myszy. Jest on obliczany automatycznie podczas korzystania z funkcji automatycznej ekspozycji. Kwantyfikacja wykorzystuje tylko strumień fotonów (fotony na sekundę) i nie zależy od czasu ekspozycji.
  7. Umieść mysz na płycie grzewczej lub pod ogrzewającym światłem, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu, a następnie umieść ją z powrotem w klatce.

6. Obrazowanie bioluminescencyjne – po dniu 0

  1. Włącz wywoływarkę, zainicjuj kamerę, stoliki i obiektywy, jak w kroku 5.1).
  2. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 60 μl mieszaniny ketaminy (120 mg/kg) / ksylazyny (6 mg/kg) (patrz kroki 3.1 do 3.5).
    UWAGA: Ta metoda znieczulenia umożliwia obrazowanie co 5 dni. Do wykonywania codziennego obrazowania wymagana jest metoda, która wykorzystuje izofluran jako środek znieczulający oraz obrazownik bioluminescencyjny odpowiedni do stosowania z tym środkiem znieczulającym.
  3. Zrób zdjęcia zwierzęcia z przodu i z tyłu, korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji, jak w krokach 5.5) i 5.6). Obchodź się z myszą jak w kroku 5.7).

7. Kwantyfikacja bioluminescencji i analiza obrazu

UWAGA: Metoda luminoscore opiera się na analizie obrazu. Po uzyskaniu obrazów zgodnie z powyższymi krokami, kwantyfikacja może zostać przeprowadzona w dowolnym momencie (w tym bezpośrednio po akwizycji), aby powiązać luminoscore z każdą myszą w każdym punkcie czasowym.

  1. Wyświetl "Paletę narzędzi", klikając menu "Widok", a następnie kliknij "Paleta narzędzi", jeśli nie jest jeszcze wyświetlana. Kliknij zakładkę "Narzędzie ROI" w palecie narzędzi. Wybierz przycisk "Kontur", a następnie wybierz "Swobodne rysowanie".
  2. Ręcznie oznacz obszar zainteresowania (ROI) wokół myszy, podążając za krawędziami myszy w widoku z przodu. Zamknij kontur za pomocą kliknięcia prawym przyciskiem myszy komputera.
  3. Kliknij menu "Widok", a następnie "Pomiary ROI". Upewnij się, że "Promieniowanie (fotony)" jest wybrane w przewijanym menu "Typy pomiarów" w lewym dolnym rogu okna "Pomiary ROI". Jeśli nie, wybierz go. Następnie zmierz strumień fotonów (ph/s), zapisując wartość w polu "Strumień całkowity [p/s]".
    UWAGA: Nie używaj promieniowania ani żadnej innej jednostki, która jest względna w stosunku do powierzchni ROI.
  4. Powtórz kroki 7.2) i 7.3) dla widoku z tyłu.
  5. Zsumuj dwie wartości strumienia fotonów uzyskane z przodu i z tyłu. Rezultatem jest luminoscore.
  6. Porównaj wartości dla każdej grupy za pomocą odpowiedniego testu statystycznego (na przykład nieparametrycznego dwustronnego testu Manna-Whitneya)14.

Wyniki

Metoda Luminoscore może służyć do weryfikacji iniekcji komórek nowotworowych

W modelach obejmujących wstrzyknięcie niewielkiej liczby komórek nowotworowych lub w sytuacjach, gdy miejsce wstrzyknięcia nie pozwala na wizualną weryfikację zabiegu, zapewnienie wysokiej jakości iniekcji może być bardzo trudne. Metoda luminoscore służy jako szybkie i wygodne narzędzie do weryfikacji jakości procedury oraz łatwego i natychmiastowego potwierdzenia prawidłowego przebiegu procesu. W obu modelach guz jest wykrywalny już 10 min po wstrzyknięciu (Rysunek 1A). Same obrazy wystarczają, aby potwierdzić obecność komórek nowotworowych w odpowiednim miejscu. Niemniej jednak, kwantyfikacja obrazów pozwala ocenić heterogeniczność wstrzyknięcia. Wykres punktowy (Rysunek 1B) wyraźnie pokazuje różnicę między zwierzętami, które otrzymały iniekcje (czarne kropki), a tymi, które ich nie otrzymały (czerwona linia). Co ciekawe, sygnał uzyskany w modelu SCL jest 100 razy wyższy niż w modelu PIOL; wynik ten jest zgodny z liczbą wstrzykniętych komórek (odpowiednio 5 x 106 i 1 x 104 komórek).

Mysi model chłoniaka; obrazowanie bioluminescencyjne i wykres luminscore guza podczas analizy w dniu 0.
Rysunek 1. Weryfikacja iniekcji w różnych mysich modelach chłoniaka. Wartości luminscore zmierzone 10 min po inokulacji komórek nowotworowych w różnych modelach chłoniaka. (A) Reprezentatywne obrazy obu modeli. (B) Luminscore każdego zwierzęcia w różnych modelach. Czerwona linia odpowiada średniemu szumowi tła zmierzonemu u 10 zwierząt przed inokulacją komórek nowotworowych; linie przerywane oznaczają średnią +/- odchylenie standardowe. W każdym modelu wszystkie zwierzęta można odróżnić od szumu tła. W modelu PIOL do ciała szklistego prawego oka wstrzyknięto 1 x 104 komórek, a w modelu SCL 5 x 106 komórek podskórnie w każdy bok myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Monitorowanie obciążenia nowotworowego i odpowiedzi na leczenie

Luminoscore jest również potężnym narzędziem do badania wzrostu guza i skuteczności leczenia. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywne obrazy monitorowania wzrostu guza w grupach kontrolnej i leczonej CpG w modelu PIOL. Myszy zaszczepiono dawką 1 x 104 komórek nowotworowych każda, a leczenie podano in situ w 7. dniu. Obrazy pokazują, że po odpowiednim czasie (28 dni) w grupie kontrolnej zaczęły pojawiać się przerzuty. Chociaż guz pierwotny nie wydawał się wrażliwy na leczenie, w grupie leczonej CpG zaobserwowano mniej przerzutów (Tabela 1). Analiza ilościowa obciążenia nowotworowego w każdej grupie (Rysunek 2B) wykazuje, że CpG spowolniło rozwój guza, co spowodowało statystycznie istotną różnicę między grupą leczoną a grupą kontrolną po 28 dniach (nieparametryczny dwustronny test Mann-Whitneya p = 0,0079). Niemniej jednak guzy nadal rosły u myszy leczonych i żadna z nich nie przeżyła (dane nie zostały przedstawione). Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami: CpG nie wykazuje istotnego wpływu na pierwotne guzy oka10. Istotny efekt zaobserwowany tutaj między grupą ODN a grupą CpG wynika z zahamowania wzrostu przerzutów.

Eksperyment obrazowania bioluminescencyjnego u myszy; wykres danych luminescencyjnych; analiza CpG-DNA; kontrola ODN.
Rysunek 2. Monitorowanie obciążenia nowotworowego i odpowiedzi na leczenie. (A) Reprezentatywne obrazy dwóch grup myszy z wszczepionymi komórkami PIOL (grupa kontrolna ODN i grupa leczona CpG). (B) Monitorowanie obciążenia nowotworowego za pomocą wskaźnika luminoscore. Jak wynika z wykresu punktowego, wpływ CpG na luminoscore jest istotny w 28. dniu. W tych dwóch grupach metoda ta umożliwiła monitorowanie obciążenia nowotworowego oraz pomiar niewielkich, lecz istotnych (p = 0,0079) efektów działania CpG-DNA, których nie można było wykryć za pomocą samych obrazów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

GrupyMyszObecność przerzutówLokalizacjaStrumień fotonów (ph/s)
CpG1NieXX
2TakWęzeł chłonny drenujący oko9,32E+05
3NieXX
4NieXX
5TakWęzeł chłonny drenujący oko2,21E+07
ODN1TakWęzeł chłonny drenujący oko1,06E+07
2TakWęzeł chłonny odwadniający oko7,25E+07
3TakWęzeł chłonny drenujący oko + przeciwstronny7,64E+08
4TakWęzeł chłonny odtoku z oka + przeciwstronny1,74E+09
5TakWęzeł chłonny drenujący oko + przeciwstronny9,76E+07

Tabela 1. Metoda Luminoscore może być dostosowana do różnych podejść

Metoda luminoscore nie jest ograniczona do jednego typu modelu mysiego. Rysunek 3 pokazuje, że można ją dostosować do różnych modeli mysich. W modelu SCL dwa guzy są wszczepiane po obu stronach ciała myszy. Leczenie jest podawane in situ po jednej stronie w dniu 0, a guz po stronie przeciwległej służy jako kontrola (Rysunek 3A). W związku z tym dla każdej myszy wyznaczono dwa obszary ROI: po jednym dla każdej strony (Rysunek 3C). Stosunek luminoscore strony leczonej do strony kontrolnej opisuje wzglębny przebieg rozwoju każdego guza. Stosunek ten ustalono na poziomie 1 w dniu 0, kiedy podano leczenie. Zaobserwowano istotny spadek tego stosunku 13 dni po podaniu leczenia (Rysunek 3D; nieparametryczny dwustronny test Mann-Whitneya p = 0.004). Spadek ten wskazuje na resorpcję guza po stronie leczonej, co przedstawiono na reprezentatywnych obrazach bioluminescencji (Rysunek 3B).

Obrazowanie bioluminescencyjne myszy wykazujące efekty leczenia ODN w porównaniu do CpG na schemacie i wykresie.
Rycina 3. Adaptacja metody Luminoscore do modelu z dwoma miejscami guza pierwotnego. (A) Projekt eksperymentalny testu SCL. Myszy otrzymały dwa wstrzyknięcia guzów pierwotnych w każdy bok. Po jednej stronie wstrzyknięto CpG-DNA lub kontrolne ODN, a po drugiej stronie PBS, aby służył jako kontrola. (B) Reprezentatywne obrazy myszy leczonych CpG i myszy kontrolnych w dniu 0 i 13. Leczenie zastosowano w dniu 0. Wzrost guza został zahamowany po stronie myszy leczonej CpG. (C) Ręcznie zaznaczone obszary zainteresowania (ROI) dla każdego zwierzęcia w dwóch miejscach guza pierwotnego. (D) Stosunek wartości luminoscore strony leczonej CpG lub kontroli ODN do strony kontrolnej PBS jest wskaźnikiem odzwierciedlającym względny wzrost każdego guza u tego samego zwierzęcia. Stosunek ten ustalono na 1 w dniu 0. W dniu 13 stosunek w grupie leczonej CpG uległ znacznemu obniżeniu (p = 0,004), co wskazuje na zahamowanie wzrostu guza poprzez podanie in situ CpG-DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Absorpcja światła przez narządy i tkanki pozostaje ograniczeniem obrazowania bioluminescencyjnego, chociaż ograniczenie to jest nieodłącznym elementem każdej metody obrazowania optycznego. W kontekście naszego podejścia oczekuje się, że wpływ struktur anatomicznych na luminoscore będzie miał niską zmienność, pod warunkiem, że badania są wykonywane w danym modelu (lokalizacja i nić myszy), co pozwala na porównania. Bioluminescencja nie potrzebuje światła wzbudzającego, a zatem jest bardziej przystosowana do obrazowania całego ciała in vivo niż fluorescencja.

Ograniczeniem obrazowania bioluminescencyjnego jest również rozdzielczość przestrzenna, a dokładna lokalizacja narządu, z którego emitowane są fotony bioluminescencyjne, pozostaje trudna. Jednak dobra znajomość modelu może pomóc w jakościowej lokalizacji miejsc guza. Jedynym wyjściem w tej metodzie opartej na bioluminescencji jest luminoscore. Lokalizacja nie ma wpływu na luminoscore, ponieważ ręczny znacznik Region of Interest (ROI) obejmuje całą mysz. Wreszcie, lucyferazy świetlików wymaga tlenu. W związku z tym obrazowanie bioluminescencyjne zwykle nie docenia guzów martwiczych. Po raz kolejny wymagana jest dobra znajomość tego aspektu modelu.

W niniejszej pracy nie mamy na celu oceny skuteczności CpG jako leku przeciwnowotworowego (co zostało już wykazane7,9,11), ale opisanie metody pozwalającej na porównanie zbiorów danych bioluminescencyjnych. Rzeczywiście opisujemy metodę ilościowego określania obciążenia nowotworem, która ma pomóc w standaryzacji protokołu akwizycji w celu porównania różnych testów w różnych miejscach w różnym czasie i która nie wymaga obliczeń komputerowych. Aby zapewnić odtwarzalność i prawidłową kwantyfikację strumienia fotonów, urządzenie do obrazowania musi być skalibrowane za pomocą światła odniesienia dla urządzeń wyprodukowanych w domu lub zgodnie z zaleceniami dostawcy dla wyrobów komercyjnych.

Nasz protokół wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na kilka krytycznych punktów: (i) Po pierwsze, jakość znieczulenia myszy ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wyraźnych obrazów, szczególnie w przypadkach z długim czasem naświetlania. (ii) Jednostką kwantyfikacyjną musi być zawsze strumień fotonów, ponieważ promieniowanie zależy od powierzchni każdej myszy i może być nieistotne dla porównywania różnych myszy. (iii) Obrazy bioluminescencyjne nie mogą zawierać nasyconych pikseli, ponieważ zakrzywiłyby one luminoscore. (iv) Akwizycja z tyłu i z przodu jest wymagana do zebrania wszystkich fotonów emitowanych z miejsca guza (tj. Akwizycja z przodu niekoniecznie musi wykrywać fotony z tyłu guza). Podczas opracowywania metody luminoscore przetestowano różne rysunki ROI. Tylko ręczne narzuty przyniosły zadowalające wyniki, które z większym prawdopodobieństwem będą istotne statystycznie (dane nie pokazane).

Inoue i wsp. zalecają dawkę lucyferyny 75 mg/kg13. Stosując zamiast tego dawkę 150 mg/kg, czas obrazowania po podaniu lucyferyny pozostaje niezmieniony i zapewniamy, że plateau utrzymuje się przez cały okres długotrwałej ekspozycji. Lucyferyna musi być nadmiarem reagenta w całym procesie nabywania. W zależności od modelu, obszar zainteresowania może być dostosowany, jak pokazaliśmy w modelu SCL, w którym narysowaliśmy dwa ROI na zwierzę. W modelu SCL lek jest wstrzykiwany, gdy guz osiąga 0,5 cm największej średnicy, aby ograniczyć zmienność wszczepienia. W zależności od myszy guz mógł rosnąć w różny sposób. Aby ustandaryzować i porównać myszy, zdecydowaliśmy się użyć stosunku między stroną leczoną i nieleczoną, który ujawnia względny wzrost guzów po obu stronach.

Jeżeli nie zaobserwuje się żadnego sygnału od myszy, której wstrzyknięto wstrzykiwanie, oczekuje się, że będzie pozytywny, (i) liczba komórek jest bardzo niska, a sygnał jest poniżej progu wykrywalności; lub (ii) mysz nie ma tlenu i wymaga natychmiastowej opieki.

Kilka ilościowych analiz bioluminescencji opisanych przez różnych autorów wymaga złożonych obliczeń i instrumentów (np. tomografii bioluminescencyjnej 3D), aby zbliżyć się do bezwzględnej kwantyfikacji emitowanych fotonów bioluminescencyjnych5,15. Nie ma zgody co do metody powtarzalnego ilościowego określania bioluminescencji, zwłaszcza w modelach nowotworowych, za pomocą obrazowania bioluminescencji 2D. Naszym celem było ujednolicenie protokołu pozyskiwania obrazów, aby ograniczyć zależność od użytkowników.

Wstrzyknięcie CpG in situ po inokulacji guza zmniejszyło obciążenie guza w obu modelach. Metoda luminoscore może służyć jako narzędzie do monitorowania obciążenia guzem w innych modelach immunoterapii nowotworów. Monitorowanie obciążenia guzem zapewnia nieinwazyjną metodę, która może poprawić naszą wiedzę na temat wzrostu guza i mechanizmów przerzutów bez ingerencji w mikrośrodowisko guza. Identyfikacja zwierząt, które reagują i nie reagują na leczenie tą metodą, jest wzmocniona weryfikacją udanego wstrzyknięcia komórek nowotworowych na początku eksperymentu.

Pokazaliśmy tutaj zdolność adaptacyjną metody luminoscore w modelu SCL przy użyciu A20. Komórki IIA-luc2. Jednak metoda ta może być dostosowana do dowolnego innego modelu guza przy użyciu innych linii komórkowych, pod warunkiem, że wyrażają one lucyferazy lub w kontekście badań komórek T (cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla nowotworu, regulatorowe limfocyty T itp.). Monitorowanie transferu genów in vivo w kontekście terapii genowej chorób rzadkich można również przeprowadzić za pomocą metody luminoscore.

Wreszcie, dane pokazują, że metoda luminoscore oparta na bioluminescencji umożliwia porównania między eksperymentami, oferuje elastyczność i możliwość dostosowania do konkretnych potrzeb eksperymentalnych oraz jest użytecznym narzędziem w nieinwazyjnych podłużnych badaniach przedklinicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy obiektom do badań nad zwierzętami w Cordelier Research Center (CEF, Paryż, Francja), Genethon (Evry, Francja) i Genopole (CERFE, Evry, Francja). Dziękujemy Jo Ann Cahn za uważne przeczytanie manuskryptu. Badania były wspierane przez Institut National de la Santé Et de la Rechercher Médicale, Uniwersytet Kartezjusza w Paryżu, Uniwersytet Pierre'a i Marii Curie, Association pour la Recherche contre le Cancer, tunezyjski Direction Générale de la Recherche Scientifique, francusko-tunezyjski projekt CMCU oraz fundusze Actions Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE). J.C był wspierany przez szkołę doktorską Frontiers in Life Science oraz przez stypendium INCA (Institut National du Cancer). R.B.A. był beneficjentem grantów z DGRS-INSERM i CMCU. S.D. otrzymał stypendium od Institut National du Cancer.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CpG 1826Sekwencja Invivogen: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT
Numer katalogowy: tlrl-1826
ODN 1826 controlSekwencja Invivogen: 5_-TCCATGAGCTTCCTCTCTT
Numer katalogowy: tlrl-1826c
Sól potasowa D-lucyferynyInterchimNumer katalogowy: FP-M1224D
KetaminVirbac, Francja
XylazinBayer HealthcareRompun 2%
A20. LiniaA20. IIA transfekowany pGL4.50[luc2/CMV/higro]7
(Promega E1310)
MyszyBalb/cByjSześciotygodniowe samice z Charles River
IVIS lumina Obrazownik biolumienscencyjnyPerkin Elmer
Oprogramowanie Living ImagePerkin ElmerSłuży do pomiaru strumienia fotonów na obrazach i rysowania ROIs
Oprogramowanie R (opensource)R-projectUżywany do testów
Hamilton Precision Serynge 10 µ l HamiltonNumer produktu 7642-01100
Maść do oczuLacrinorm
Mikroskop preparacyjnyZEISSStemi 305
komórkowa IIA-luc2 statystycznych

Bibliografia

  1. Rehemtulla, A., et al. Rapid and Quantitative Assessment of Cancer Treatment Response Using In Vivo Bioluminescence Imaging. Neoplasia. 2 (6), New York, N.Y. 491-495 (2000).
  2. Edinger, M., et al. Advancing animal models of neoplasia through in vivo bioluminescence imaging. European Journal of Cancer. 38 (16), Oxford, England. 2128-2136 (2002).
  3. Hastings, J. W., Gibson, Q. H. The Role of Oxygen in the Photoexcited Luminescence of Bacterial Luciferase. Journal of Biological Chemistry. 242 (4), 720-726 (1967).
  4. Inouye, S., Shimomura, O. The Use of Renilla Luciferase, Oplophorus Luciferase, and Apoaequorin as Bioluminescent Reporter Protein in the Presence of Coelenterazine Analogues as Substrate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (2), 349-353 (1997).
  5. Pesnel, S., et al. Quantitation in Bioluminescence Imaging by Correction of Tissue Absorption for Experimental Oncology. Molecular Imaging and Biology. 13 (4), 646-652 (2010).
  6. Corre, G., et al. Stochastic Fluctuations and Distributed Control of Gene Expression Impact Cellular Memory. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
  7. Ben Abdelwahed, R., et al. Lymphoma B-cell responsiveness to CpG-DNA depends on the tumor microenvironment. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research CR. 32 (1), 18(2013).
  8. Abdelwahed, R. B., et al. Preclinical Study of Ublituximab, a Glycoengineered Anti-Human CD20 Antibody, in Murine Models of Primary Cerebral and Intraocular B-Cell Lymphomas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3657-3665 (2013).
  9. Donnou, S., Galand, C., Touitou, V., Sautès-Fridman, C., Fabry, Z., Fisson, S. Murine Models of B-Cell Lymphomas: Promising Tools for Designing Cancer Therapies. Advances in Hematology. 2012, (2012).
  10. Qi, X. -F., et al. CpG oligodeoxynucleotide induces apoptosis and cell cycle arrest in A20 lymphoma cells via TLR9-mediated pathways. Molecular Immunology. 54 (3-4), 327-337 (2013).
  11. Houot, R., Levy, R. T-cell modulation combined with intratumoral CpG cures lymphoma in a mouse model without the need for chemotherapy. Blood. 113 (15), 3546-3552 (2009).
  12. Krieg, A. M. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer. Oncogene. 27 (2), 161-167 (2008).
  13. Inoue, Y., Kiryu, S., Watanabe, M., Tojo, A., Ohtomo, K. Timing of Imaging after D-Luciferin Injection Affects the Longitudinal Assessment of Tumor Growth Using In Vivo Bioluminescence Imaging. International Journal of Biomedical Imaging. 2010, (2010).
  14. Mann, H. B., Whitney, D. R. On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other. Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
  15. Darne, C., Lu, Y., Sevick-Muraca, E. M. Small animal fluorescence and bioluminescence tomography: a review of approaches, algorithms and technology update. Physics in Medicine and Biology. 59 (1), 1(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie bioluminescencyjnemetoda Luminoscorewstrzykiwanie D lucyferynyanaliza obszaru zainteresowania ROImonitorowanie masy guzaocena odpowiedzi na leczenieterapia CpG DNAprzedkliniczne modele ma ych zwierz t

Powiązane artykuły