Method Article

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

DOI:

10.3791/53611

⸱

March 9th, 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Southern California Costal Water Research Project Authority

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR (EntHF183 dPCR) do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzki marker HF183 związany z kałem. Test dPCR duplex EntHF183 (określany dalej jako EntHF183 dPCR) wykorzystuje te same sekwencje startera i sondy, co jego opublikowane indywidualne ilościowe odpowiedniki PCR (qPCR). Podobnie, przed uruchomieniem dPCR stosuje się te same procedury filtracji wody i ekstrakcji DNA, które zostały wykonane przed qPCR. Jednak test dPCR duplex ma kilka zalet w porównaniu z testami qPCR. Co najważniejsze, test dPCR eliminuje potrzebę prowadzenia krzywej standardowej, a co za tym idzie, związanego z nią odchylenia i zmienności, poprzez bezpośrednią kwantyfikację jego celów. Ponadto, podczas gdy dupleksowanie (tj. jednoczesna kwantyfikacja) Enterococcus i HF183 w qPCR często prowadzi do poważnego niedoszacowania mniej licznego celu w próbce, dPCR zapewnia spójną kwantyfikację obu celów, niezależnie od tego, czy są one określane ilościowo indywidualnie, czy jednocześnie w tej samej reakcji. Test dPCR jest również w stanie tolerować stężenia inhibitorów PCR, które są o jeden do dwóch rzędów wielkości wyższe niż te tolerowane przez qPCR. Te zalety sprawiają, że test dPCR EntHF183 jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ jednocześnie dostarcza dokładnych i powtarzalnych informacji na temat zarówno ogólnego, jak i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach środowiskowych bez konieczności przeprowadzania dwóch oddzielnych testów qPCR. Pomimo zalet w porównaniu z qPCR, górna granica oznaczalności testu dPCR przy użyciu obecnie dostępnego oprzyrządowania jest o około cztery rzędy wielkości niższa niż możliwa do osiągnięcia za pomocą qPCR. W związku z tym rozcieńczenie jest potrzebne do pomiaru wysokich stężeń organizmów docelowych, takich jak te zwykle obserwowane po wyciekach ścieków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody ilościowego PCR (qPCR) są szeroko stosowane do monitorowania jakości wody rekreacyjnej i śledzenia źródeł mikrobiologicznych, ponieważ są szybsze, bardziej elastyczne i specyficzne w porównaniu do tradycyjnych metod opartych na kulturach. W związku z tym qPCR jest zalecany do uzyskania szybkich wyników monitorowania wody pod kątem ogólnych wskaźników kałowych, takich jak Enterococcus spp., w zmienionych kryteriach jakości wody rekreacyjnej USEPA1. Opracowano również i zwalidowano wiele testów qPCR w celu identyfikacji źródeł zanieczyszczenia kałem w wodach środowiskowych2. Wśród nich testy markerów HF183 są jednymi z najczęściej stosowanych do identyfikacji zanieczyszczenia kałem związanego z człowiekiem3.

Jednak wyniki qPCR często mogą być stronnicze, ponieważ opierają się na standardowych krzywych do kwantyfikacji. qPCR określa ilościowo nieznane stężenia celu w próbkach poprzez interpolację ich cyklu kwantyfikacji (Cq) od krzywej standardowej, która opisuje liniową zależność między Cq a wielkością logarytmiczną zestawu seryjnie rozcieńczonych wzorców. Brak wiarygodnego i spójnego wzorcowego materiału referencyjnego może zatem znacznie zniekształcić wyniki qPCR. Badania wykazały, że wyniki qPCR różniły się o około pół logarytmu przy użyciu wzorców od różnych dostawców4 i 2-krotnie przy użyciu różnych partii wzorców od tego samego dostawcy5.

Technologia Digital PCR (dPCR) kwantyfikuje nieznaną próbkę, zliczając częstość dodatnich wyników w dużej liczbie miniaturowych reakcji PCR, które są generowane przez podzielenie masowego qPCR na tysiące lub miliony jednolitych reakcji nanolitrowych lub pikolitrowych6. Jest on określany odpowiednio jako kropelkowy cyfrowy PCR (tj. ten artykuł) lub cyfrowy PCR komorowy, jeśli przegrodami są kropelki wody w oleju (tj. ten artykuł) lub małe komory na chipie. Wyższe stężenie próbki spowoduje obecność docelowego DNA (stąd dodatni PCR) w większym odsetku partycji, zależność przybliżoną przez rozkład Poissona. W związku z tym rejestrowane są wyniki binarne (dodatni lub ujemny PCR), a częstotliwość dodatnich kropel jest wykorzystywana do obliczania nieznanych stężeń próbek bezpośrednio za pomocą przybliżenia Poissona, eliminując potrzebę stosowania krzywej wzorcowej, jak w qPCR.

Ta binarna natura cyfrowej kwantyfikacji PCR zapewnia dodatkowe zalety w porównaniu z qPCR7. Ponieważ opóźniona amplifikacja może nadal dawać dodatni wynik PCR, kwantyfikacja dPCR jest bardziej odporna na inhibicję, która zmniejsza wydajność amplifikacji. Podobnie, na kwantyfikację dPCR nie ma wpływu zmienność wartości Cq, tak jak w przypadku qPCR, co prowadzi do większej precyzji dPCR w porównaniu z qPCR8-10.

Ponadto, proces partycjonowania zapewnia bardzo małą ilość docelowego DNA obecnego w każdej kropli, skutecznie minimalizując konkurencję substratów (podczas amplifikacji różnych celów DNA), które są częstymi przeszkodami w osiągnięciu dupleksowania (tj. test jednocześnie mierzy dwa cele DNA) w qPCR. W związku z tym, niezależnie od tego, czy jest prowadzony w trybie dupleksowym, czy jednostronnym (tj. jeden cel jest mierzony w jednym teście), dPCR daje prawie nierozróżnialną kwantyfikację obu celów7,11.

Celem cyfrowego testu PCR (EntHF183 dPCR) opisanego w tym artykule jest uzyskanie jednoczesnej bezpośredniej kwantyfikacji ogólnego wskaźnika kału Enterococcus spp. i ludzko-kałowego markera HF183 z większą precyzją, powtarzalnością i odpornością na inhibicję w porównaniu do jego odpowiedników qPCR. Test ten został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego określenia zanieczyszczenia kałem w środowisku słodkiej wody, wodzie morskiej i różnych materiałach kałowych7, ale może być również stosowany do wszelkich innych rodzajów wód i ścieków. Test ten jest bardzo obiecujący do analizy osadów lub gleb ze względu na wysoką tolerancję na inhibicję, ale wymagane są dalsze badania ze względu na złożoność mieszanin inhibitorów w tego typu próbkach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mieszaniny testowej

  1. Przygotować 100 μmol/l stężenia podstawowe dla wszystkich starterów w wodzie molekularnej i sondach w buforze TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP13].
    Uwaga: Sondy dla dwóch celów są znakowane fluorescencyjnie różnymi fluoroforami7, jak wskazano w Wykazie materiałów/sprzętu.
  2. Przygotować mieszaninę wzorcową, mieszając, zgodnie z planowaną reakcją, 12 μl cyfrowej mieszanki PCR (2x zapas, patrz Lista materiałów/sprzętu), 0,216 μl każdego startera do przodu i do tyłu, 0,06 μl każdej sondy fluorescencyjnej i 5,016 μl wody wolnej od nukleaz (końcowe stężenie: 900 nM każdy starter, 250 nM każda sonda). Pipetować w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu.
  3. Odpipetować 18 μl mieszanki wzorcowej (z kroku 1.2) do zwykłej probówki lub płytki PCR, mieszając z 6 μl matrycy DNA (ekstrahowanej w sposób opisany wcześniej13) w celu uzyskania mieszaniny do oznaczania do wytwarzania kropel. W przypadku pobierania próbek w dwóch egzemplarzach należy odpipetować 36 μl mieszanki wzorcowej i 12 μl matrycy DNA do każdego dołka. Pozostawić odpowiednie studzienki repliki puste na płytce. Uwzględnij kontrole dodatnie (patrz Wykaz materiałów/sprzętu) i nie zawieraj kontroli matrycowych (NTC) (tj. z wodą molekularną użytą jako szablon).
    Uwaga: Kontrola pozytywna jest konieczna, aby upewnić się, że test przebiega prawidłowo, a NTC jest niezbędna, aby upewnić się, że na płytce nie ma zanieczyszczeń i ustalić fluorescencyjną linię bazową w dalszej części analizy danych. Użytkownikom po raz pierwszy zaleca się stosowanie zarówno nierozcieńczonych, jak i rozcieńczonych próbek DNA.

2. Generacja kropel i konfiguracja płytki PCR

  1. Wymieszać mieszaniny testowe, pipetując w górę w dół około 15 razy za pomocą pipety wielokanałowej. Upewnij się, że końcówka pipety pozostaje w cieczy, aby uniknąć tworzenia się nadmiaru pęcherzyków w mieszaninie.
  2. Włóż wkład 1 (zawierający 8 dołków) do białego uchwytu na wkład i zatrzasnij uchwyt wkładu. Kartridż 1 jest teraz mocno osadzony i nie można go wysunąć z uchwytu podczas generowania kropel. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie przenieść 20 μl mieszaniny testowej do środkowego położenia wkładu oznaczonego "Próbka", nie wprowadzając pęcherzyków powietrza.
  3. Odmierzyć pipetą 70 μl oleju wytwarzającego kropelki na lewą stronę wkładu (oznaczonego "Olej").
  4. Przykryj wkład uszczelką, upewniając się, że uszczelka jest płaska i równomiernie trzymana przez 4 kleszcze w kierunku krawędzi wkładu. Naciśnij podświetlony na zielono przycisk na generatorze kropel, aby otworzyć i umieścić wkład. Naciśnij ponownie przycisk z zielonym światłem, aby zamknąć generator.
    Uwaga: Po zamknięciu drzwi przycisk jest przyciemniony, drzwi nie można ponownie otworzyć, a wytwarzanie kropel rozpoczyna się natychmiast, trwając przez około 1 minutę.
  5. Jeśli wykonujesz więcej niż 8 reakcji, umieść wkład 2 w drugim białym uchwycie na wkład i przygotuj go w taki sam sposób, jak wkład 1, podczas gdy trwa wytwarzanie kropli, aby zaoszczędzić całkowity czas konfiguracji.
  6. Otwórz drzwiczki generatora kropel, gdy przyciemniony podświetlony przycisk zmieni kolor na zielony, wskazując zakończenie generowania kropel. Wyjmij biały uchwyt wkładu zawierającego wkład 1, odłóż na bok i umieść wkład 2 na generatorze kropel.
  7. Usuń uszczelkę z wkładu 1 i wyrzuć. Delikatnie przenieść całkowitą objętość (około 40 μl) wytworzonych kropel z trzeciej kolumny wkładu (oznaczonej "Kropelkami") na końcową płytkę PCR (utrzymywaną w temperaturze pokojowej) w celu przeprowadzenia cykli termicznych.
    Uwaga: Nie odznaczaj białego uchwytu na wkład, ponieważ może to spowodować przerwanie nowo wygenerowanych kropel; Uchwyt wkładu należy otwierać dopiero po przeniesieniu kropelek na ostateczną płytkę.
  8. Powtórzyć kroki 2.1-2.7 dla dodatkowych próbek.
  9. Gdy wszystkie kropelki znajdą się na końcowej płytce do PCR, umieść na niej foliową osłonę z możliwością przekłuwania i umieść ją na uszczelniarce do płytek. Ustaw zgrzewarkę na 180 °C, naciśnij przycisk "Play" na zgrzewarce i pozostaw na 10 sekund.

3. Cykl termiczny i odczyt kropelek

  1. Umieść zapieczętowaną płytkę na termocyklerze, kompatybilną z końcową płytką PCR użytą w kroku 2.7 i prędkość narastania temperatury 2.0 °C/s.
  2. Uruchomić program termiczny w następujący sposób: 10 minut w temperaturze 95 °C, następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 °C i 60 sekund w temperaturze 60 °C, a następnie 10-minutowe zatrzymanie w temperaturze 98 °C (opcjonalnie: końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 lub 15 °C).
  3. Po zakończeniu cyklu przenieś płytkę do czytnika kropel w celu automatycznego pomiaru fluorescencji w każdej kropli w każdym dołku. Alternatywnie, należy przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do 3 dni przed odczytem kropli. Upewnij się, że kropelki mają temperaturę pokojową przed przystąpieniem do czytania.
    1. Otwórz dołączone oprogramowanie, aby skonfigurować odczyt kropli. W domyślnym menu "Ustawienia" zawierającym schemat pustej płytki 96-dołkowej, kliknij dwukrotnie na basenik A1, aby otworzyć menu zawierające trzy sekcje: "Próbka", "Test 1" i "Test 2".
    2. W sekcji "Próbka" wpisz identyfikator próbki w polu oznaczonym "Nazwa" i naciśnij enter lub zaznacz pole po prawej stronie oznaczone jako "Zastosuj". Następnie kliknij menu rozwijane oznaczone "Eksperyment" i wybierz "CZERWONY" (wykrywanie rzadkich zdarzeń) i kliknij enter.
    3. Przejdź do sekcji oznaczonej jako "Test 1". W sekcji "Nazwa" wpisz test (np. Enterococcus) i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 1 nieznany" i kliknij Enter.
    4. Przejdź do sekcji oznaczonej jako "Test 2". W sekcji "Nazwa" wypełnij test (np. HF183) i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 2 nieznany" i kliknij Enter. Wszystkie informacje z kroków 3.3.2 do 3.3.4 są teraz obecne w studzience A1.
    5. Nazwij wszystkie kolejne studzienki zawierające kropelki. Aby zaoszczędzić całkowity czas instalacji, kliknij "Shift" lub "Ctrl", aby wybrać wiele dołków jednocześnie.
    6. Gdy cyfrowy obraz tablicy odzwierciedla fizyczną tablicę, naciśnij przycisk "OK" w prawym dolnym rogu menu. W nowym menu, które pojawi się w górnej części schematu płyty, w sekcji "Szablon" wybierz "Zapisz jako" oraz nazwij i zapisz płytę.
    7. Po lewej stronie ekranu kliknij "Uruchom" i wybierz odpowiedni zestaw barwników w wyskakującym oknie "Opcje uruchamiania". Rozpoczyna się zbieranie danych, które są wyświetlane w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu.

4. Analiza danych i raportowanie

  1. Gdy czytnik zakończy pracę i pojawi się pole z napisem "Uruchom zakończono", kliknij "OK".
    Uwaga: Oprogramowanie wyświetla ostateczny plik danych w sekcji "Analizuj" oprogramowania. W tym widoku oprogramowanie wybiera wszystkie studzienki w płycie i domyślnie ustawia wykres danych "Amplituda 2D".
  2. Sprawdź separację między kroplami dodatnimi i ujemnymi. Upewnij się, że fluorescencja we wszystkich kropelkach w studzienkach NTC jest bliska linii podstawowej.
  3. Kliknij przycisk "Zdarzenia". Po prawej stronie prezentowanego histogramu kliknij pole o nazwie "Łącznie" i pole o nazwie "pojedyncze" na dole, aby wyświetlić całkowitą liczbę zaakceptowanych kropel na studzienkę. Wyklucz wszystkie studzienki zawierające <10 000 kropel7, przytrzymując Ctrl i klikając studzienkę, która ma zostać wykluczona.
  4. Kliknij przycisk oznaczony jako "Amplituda 1D", aby ustawić próg fluorescencyjny na około jedno odchylenie standardowe (500-700 jednostek fluorescencji) powyżej ujemnych kropelek w studzienkach NTC dla obu celów. Po lewej stronie ekranu pod "Automatyczną analizą" pokazującą dwa przyciski progowe wybierz ikonę po prawej stronie, przez którą przebiega ciągła różowa pozioma linia.
  5. Kliknij pole po lewej stronie opcji "Ustaw próg" pod każdym z wykresów amplitudy i wprowadź odpowiednie wartości progu fluorescencji. Następnie automatycznie obliczane są stężenia docelowe w kopii na μl reakcji.
    Uwaga: progi nie muszą być identyczne dla różnych wartości docelowych.
  6. Wyeksportuj wyniki do pliku .csv, klikając przycisk "Eksportuj" w lewym górnym rogu ekranu Amplituda 1D. W pliku .csv pomnóż wyeksportowane stężenie docelowe przez 4, aby przeliczyć je z kopii celu (gen 23S Enterococcus spp. lub marker HF183) na reakcję μl na kopię matrycy DNA na cel na μl.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dobry przebieg dPCR duplex EntHF183 powinien skutkować stosunkowo dużą liczbą akceptowanych kropel (ok. 10 000-17 000) i stosunkowo dużą różnicą (ok. 5 000) między wartościami fluorescencji dla kropli ujemnych i dodatnich7. Niezwykle niska liczba kropel prawdopodobnie wskazuje na problemy w procesie generowania kropel, a granica 10 000 kropel jest sugerowana na podstawie danych empirycznych z systemu dPCR kropel użytego w tym artykule. Słabsza separacja (t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, mieszanie mieszanin testowych może być trudne, ponieważ mieszanka wzorcowa jest bardziej lepka niż konwencjonalne mieszanki wzorcowe qPCR. Proste wirowanie może prowadzić do niewystarczającego wymieszania, co z kolei prowadzi do nierównomiernego rozmieszczenia matryc DNA w mieszaninach testowych, a następnie w kropelkach. Aby zapewnić dokładne oznaczanie ilościowe dPCR, należy postępować zgodnie z techniką mieszania przez pipetowanie opisaną w protokole. Po drugie, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroprobówki o niskim poziomie wiązaniaCostar3207Do przechowywania odczynników, próbek/produkcji mieszanek głównych
Woda wolna od nukleazFisherSciBP2484-50
TE bufor pH 8FisherSciBP2473-100
Hardshell 96 Płytka dołkowaBioRadHSP-9601Do wstępnej mieszanki głównej i inokulacji próbki
Aluminiowa foliauszczelniającaBioRad359-0133Do uszczelnienia płytki próbki
Generator kropelBioRad186-3002
Olej do wytwarzania kropelBioRad186-3005
DG8 Uchwyt wkładuBioRad186-3051
UszczelkaBioRad186-3009
20 μ l końcówki do pipetRaininGP-L10FDo tansferring sample/master mix do cartidge
200 μ l Końcówki do pipetRaininGP-L200FDo przenoszenia kropel do końcowej płytki Twin.Tec
Płytka studzienkowa Twin.Tec 96Eppendorf951020320Do końcowych kropel Cykl termiczny i odczyt
Folia termozgrzewalna do przekłuwaniaBioRad181-4040Do uszczelniania płytki Twin.Tec przed cyklem termicznym
Uszczelniarka do płytek PCR PX1BioRad181-4000
CFX96 ThermalcyclerBioRadCFX96 i C1000Potrzebny jest tylko termocykler, brak optyki
QX100 Czytnik kropelBioRad186-3001
Czytnik kropel OlejBioRad186-3004
Kroplowy PCR Supermix BioRad186-3024i.e. cyfrowa mieszanka PCR w rękopisie
oprogramowania QuantaSoft (v1.3.2)Quantasoft QX100 Do przeglądania, analizowania i eksportowania danych ddPCR
Entero Forward Primer (Ent F1A)OperonGAGAAATTCCAAACGAACTTGMożna użyć alternatywnego dostawcy
Entero Reverse Primer (Ent R1)OperonCAGTGCTCTACCTCCATCATTMożna użyć alternatywnego dostawcy
Entero Probe (GPL813TQ)Operon[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]Można użyć alternatywnego dostawcy, ale floroforem musi być FAM
HF183 Forward Primer ( HF183-1)OperonATCATGAGTTCACATGTCCGMożna użyć alternatywnego
dostawcy HF183 Reverse Primer (BthetR1)OperonCGTAGGAGTTTGGACCGTGTGTAlternatywnego dostawcy można użyć
sondy HF183 (BthetP1)Operon[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC
ACATTGGA-[BHQ1]		Można użyć alternatywnego dostawcy, ale florofor musi być HEX (jeśli używasz VIC, należy wybrać odpowiednią kompensację matrycową.  
KontrolaMieszanina genomowego DNA E. faecalis i standardowego plazmidu HF183 (zamówionego w IDT). Szczegółowe metody hodowli E. faecalis oraz sekwencje uporządkowanego plazmidu HF183 można znaleźć w Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Dostępne na rynku wzorce DNA Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) mogą być również stosowane w kontroli pozytywnej zamiast genomowego DNA E. faecalis
Wkład BioRad 186-4008 pozytywna .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
  2. Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
  3. Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
  4. Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
  5. Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
  6. Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
  7. Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
  8. Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
  9. Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
  10. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  11. Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583(2013).
  12. Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
  13. Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Duplex Digital PCREnterococcus sppHF183 MarkerFecal ContaminationWater QualityDroplet GenerationPCR Inhibitor ToleranceStandard Curve EliminationSimultaneous QuantificationDigital PCR Assay

Related Articles