Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje prostą i szybką metodę izolowania i charakteryzowania mysich antralnych oocytów GV (Germinal Vesicle) jako zdolnych (SN, Surrounded Nucleolus) lub niezdolnych (NSN, Not Surrounded Nucleolus) do rozwinięcia się do stadium blastocysty po dojrzewaniu in vitro (IVM) i zapłodnieniu in vitro (IVF). Wykorzystuje Hoeschst33342 (lub dowolny inny barwnik interkalacyjny DNA) zdolny do wiązania się z heterochromatyną jąderka pokazującego pierścień w oocytach SN lub nie, jak w oocytach NSN. Jest to najłatwiejszy i najszybszy sposób sortowania obu oocytów antralnych, które mogą być ostatecznie wykorzystane do procedur IVM lub IVF.
Krótko mówiąc, protokół składa się z następujących kroków: wstrzyknięcie hormonu w celu stymulacji wzrostu pęcherzyków; izolacja oocytów w stadium GV od przedziału antralnego poprzez nakłucie jajnika sterylną igłą; przygotowanie cienkich szklanych pipet do pipetowania oocytów do ust; sortowanie oocytów za pomocą Hoechst33342 przygotowanych w stężeniu supravitalnym; IVM, IVF lub jakakolwiek inna analiza molekularna/komórkowa.
Niestety, wciąż niewiele jest dowodów na sortowanie oocytów SN i NSN przy użyciu mniej inwazyjnych technik. Jeśli i kiedy zostaną zidentyfikowane, mogą być potencjalnie zastosowane w technologiach wspomaganego rozrodu u ludzi, chociaż z kilkoma aspektami, które powinny zostać zmodyfikowane. Do tej pory technika ta ma potencjalne implikacje dla znacznego zwiększenia liczby udanych procedur IVM i IVF zarówno u gatunków zagrożonych, jak i o znaczeniu ekonomicznym.
Wprowadzenie
W pełni rozwinięte oocyty antralne (GV, pęcherzyki rozrodcze) wyizolowane z przedziału antralnego jajnika są rutynowo wykorzystywane do różnych celów, takich jak na przykład badanie molekularnych i komórkowych mechanizmów stojących za dojrzewaniem in vitro do etapu Metafazy II.
Pomimo pięknego wyglądu, większość oocytów antralnych, ale nie wszystkie, są w stanie zakończyć mejozę i osiągnąć stadium blastocysty; w rzeczywistości, u wielu gatunków ssaków, w tym ludzi1,2, około 30% z nich zatrzymuje swój rozwój na etapie 2-komórkowym, jeśli zapłodnienie nastąpi3-5. Do tej pory stosuje się niewiele parametrów do odróżnienia oocytów zdolnych do podtrzymania rozwoju embrionalnego od tych, które nie są w stanie tego zrobić.
Na przykład, barwienie błękitem krezylu (BCB) jest prawidłową metodą sortowania oocytów na podstawie aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, chociaż użyteczność tej metody sortowania związana z barwieniem BCB+ lub BCB- jest nadal zależna laboratoryjnie6-8.
Inna sprawdzona metoda tkwi w organizacji ich chromatyny: jeśli są barwione jakimikolwiek barwnikami interkalacyjnymi DNA (jak Hoechst33342), 70% oocytów antralnych wykazuje pierścień barwnikowo-dodatni wokół jąderka i nazywane są Otoczonymi Jąderkami (SN), podczas gdy pozostałe 30% wykazują bardziej zauważone pozytywne sygnały i nazywane są Nieotoczonymi Jąderkami (NSN)3-5. Niedawno wykazaliśmy, że brak sieci cytoplazmatycznych9 (CPL, ważne miejsca magazynowania mRNA i rybosomów pochodzących od matki zarówno w oocytach, jak i zarodkach ssaków)10 oraz regulacja w dół MATER (niezbędnej do tworzenia CPL11), wraz z obecnością kropelek lipidów w ich cytoplazmach9,12, mogą być innymi przyczynami związanymi z niezdolnością oocytów NSN do wyjścia poza stadium 2-komórkowe.
Niestety, niewiele technik można zastosować do sortowania antralnych oocytów SN i NSN i z tego powodu opracowanie mniej inwazyjnej metody (bez barwienia jądrowego, procedur fiksacji lub manipulacji za pomocą pipet doustnych) może stać się bardzo ważne dla zwiększenia tempa rozwoju zarówno ludzkich, jak i zwierzęcych embrionów.
W tym artykule szczegółowo opisujemy prosty i szybki protokół używany do izolowania i sortowania oocytów antralnych SN i NSN od samic myszy i jest on skierowany do wszystkich naukowców zainteresowanych badaniem żeńskiej gametogenezy, dojrzewania oocytów i rozwoju zarodka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół ten jest sporządzany zgodnie z zasadami przewodnimi europejskich (UE 63/2010) i włoskich (26/2014) przepisów chroniących zwierzęta wykorzystywane do badań naukowych. Eutanazja zwichnięcia szyjki macicy służy do izolacji jajników i jest wykonywana przez ekspertów i przeszkolone osoby wymienione w zatwierdzonym protokole obejmującym to badanie.
1. Zwierzęta
- Dorosłe samice myszy w wieku od 3 do 6 tygodni należy utrzymywać w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (z fazami 12L:12D i karmione ad libitum).
- Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 2,5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w celu stymulowania wzrostu pęcherzyków poprzez naśladowanie działania hormonu folikulotropowego (FSH). Odizoluj jajniki do pobrania antralnych oocytów 48 godzin później. Poddaj eutanazji samicę myszy, której wcześniej wstrzyknięto PMSG, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Szybko usunąć jajniki z jamy ciała i umieścić je na szalce Petriego zawierającej pożywkę M2 w celu późniejszej izolacji oocytów (patrz punkt 3).
- Wykonaj nacięcie na skórze pokrywającej ścianę brzucha, a następnie nacięcie w otrzewnej za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. Otwórz nacięcie, aby odsłonić brzuch, przesuń wnętrzności na jedną stronę za pomocą sterylnej pęsety i zlokalizuj jajowody, tworząc kształt litery V, zaczynając od pęcherza.
- Obserwuj jajniki znajdujące się poniżej nerek. Przytrzymaj każdą rurkę sterylną pęsetą i wykonaj małe nacięcie na dnie jajników, aby je uwolnić. Przenieść oba jajniki na dno szalki Petriego zawierającej wstępnie zrównoważoną pożywkę.
2. Przygotowanie hormonów
- Rozcieńczyć PMSG (dostępny w różnych stężeniach podstawowych) sterylnym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie robocze 2,5 hormonu I.U. na 0,1 ml dla odpowiedniej objętości iniekcji.
UWAGA: Roztwory hormonów muszą być porcjowane w probówkach o pojemności 0,5 ml i przechowywane w temperaturze -20 °C do dnia użycia. Nie przechowywać rozcieńczonych podwielokrotności dłużej niż trzy miesiące w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu, jeśli wykonywane są seryjne wstrzyknięcia, porcje roztworów hormonów należy przechowywać w temperaturze +4 °C i zużyć je w ciągu 4 dni.
3. Izolacja oocytów antralnych
Dla prawidłowej izolacji komórek jajowych:
- Zrównoważyć pożywkę M213 (M2) przy 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem procedury izolacji oocytów. Przygotować dwie szalki Petriego (35 mm x 10 mm), jedną z 1 ml M2 do nakłucia jajników, a drugą z małymi kroplami (20 μl) M2 pokrytymi olejem mineralnym (~1,5 ml) do transferu oocytów po wyizolowaniu z jajnika (patrz 3.4-3.6). Obie szalki Petriego należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
- Podczas zabiegów izolacji oocytów należy używać mikroskopu stereoskopowego.
- Przygotuj cienkie szklane pipety do ust w celu pobrania oocytów, rozciągając szklane pipety Pasteura trzymane poziomo (trzymając końce pipety obiema rękami), nad pionowym płomieniem pochodzącym z palnika Bunsena (ryc. 1).
- Gdy szkło zacznie się topić, wyjmij pipetę z płomienia i wykonaj szybki ruch ciągnący, aby uzyskać żądaną pipetę. Mocno odetnij nadmiar szkła w pobliżu wąskiego punktu pipety paznokciami, aby wyregulować długość i średnicę wewnętrznej kapilary. Upewnij się, że cienka kapila ma średnicę wewnętrzną ~100 μm, nieco większą niż średnica oocytu (~80 μm).
- Aby dodać pipetę do ust, podłącz jeden koniec rurki aspiratora do wyciągniętej pipety za pomocą odpowiedniej końcówki, a drugi koniec umieść w jamie ustnej, zabezpieczając go zębami.
- Zbierz jajniki za pomocą sterylnej pęsety i umieść je na dnie szalki Petriego do hodowli komórkowych (35 mm x 10 mm). Przykryć je 1 ml M2 uprzednio zrównoważonego w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (rysunek 2).
- Delikatnie nakłuć pęcherzyki antralne jajników sterylną igłą strzykawki insulinowej, aby uwolnić antralne oocyty w M2 (ryc. 3).
- Delikatnie przetrzeć oocyty przez wąską pipetę Pasteura w celu usunięcia komórek pęcherzykowych i wszelkich innych możliwych resztek tkanek (ryc. 4A), a następnie umieścić je na dnie małych kropelek (20 μl) M2 pokrytych olejem mineralnym odpowiednim do hodowli zarodków (wcześniej przygotowanym; Rysunek 4B).
UWAGA: Ważne jest, aby usunąć wszystkie komórki wzgórka przyczepione do osłonki przejrzystej oocytów poprzez ciągłe pipetowanie przez kilka różnych kropli M2. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zmian pH pożywki.
4. Barwienie oocytów antralnych za pomocą Hoechst33342
UWAGA: Oocyty antralne można rozróżnić w SN (Surrounded Nucleolus), NSN (Not Surrounded Nucleolus) lub w dowolnej innej formie pośredniej, na podstawie ich organizacji chromatyny po barwieniu supravitalnym stężeniem Hoechst33342 (lub dowolnymi innymi markerami specyficznymi dla zasad AT)14. W rzeczywistości oocyty SN wykazują pierścień Hoechst-dodatni wokół jąderka, podczas gdy NSN nie, stąd jego nazwa.
Dla prawidłowego barwienia oocytów:
- Przenieść oocyty za pomocą pipety doustnej do kropli Hoechst33342 (20 μl) rozcieńczonych w M2 w stężeniu supravital 50 ng/μl przez 10 minut w ciemności.
- Po inkubacji z Hoechst33342 przenieść każdy pojedynczy oocyt za pomocą pipety doustnej na dnie małych kropli (5 μl) M2 pokrytych olejem mineralnym, do sortowania na podstawie organizacji chromatyny (SN lub NSN). Użyj dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr Hoechst33342 (długość fali emisji 486 nm), aby zobrazować konfigurację chromatyny oocytów.
UWAGA: W zależności od rodzaju używanego mikroskopu fluorescencyjnego może okazać się konieczne użycie płytki Petriego ze szklanym dnem do akwizycji obrazu. Mikroskopia konfokalna Olympus Fluoview Fv10i, wyposażona w uchwyt na próbkę 35 mm, wymaga jedynie szklanych naczyń dolnych do akwizycji obrazu, o standardowej grubości 0,17 mm i dopuszczalnym zakresie od 0,13 do 0,21 mm. - Pobudzaj oocyty nie dłużej niż 5-10 sekund, prawdopodobnie wystarczająco długo, aby uwidocznić obecność lub brak pierścienia wokół jąderka (ryc. 5).
- Po sortowaniu hodować antralne oocyty SN i NSN w M2 w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C w celu wywołania dojrzewania in vitro lub przechowywać je w odpowiednich do analiz molekularnych lub komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poniższe zdjęcia przedstawiają metodę izolacji oocytów antralnych z jajników myszych, począwszy od przygotowania pipet, aż po sortowanie oocytów za pomocą Hoechst33342. Metoda ta jest dość prosta i może być wykonana w każdym laboratorium wyposażonym w inkubator CO2, stereomikroskop oraz mikroskop fluorescencyjny z odpowiednim filtrem do obserwacji Hoechst33342. Rycina 1 pokazuje wstępny etap przygotowania pipety: w momencie gdy szkło zaczyna się topić i mięknąć...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę stosowaną do izolacji i klasyfikacji antralnych oocytów GV myszy. Nie ma żadnych szczególnych krytycznych kroków, które należy podkreślić, z kilkoma wyjątkami. Po pierwsze: zabieg ten należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby: a) utrzymać witalność oocytów i b) uniknąć zmian pH w użytej pożywce. Po drugie: oocyty powinny być krótko wzbudzone (5-10 sekund) do Hoechst33342, aby uniknąć uszkodzenia chromatyny i późniejszej śmierci oocytów, zwłaszcza jeśli IVM i IVF są następującymi krokami. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia
Podziękowania
M.M. i C.A.R. dziękują za wsparcie finansowe Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M i C.A.R. pragną podziękować Mariannie Longo za pomoc w przygotowaniu zdjęć.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Olej mineralny | Sigma | M8410 | |
| Naczynie do hodowli komórkowych 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, wysokie szklane dno | Ibidi | 81158 | |
| Pipeta Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikropilarnych | Sigma | A5177 |
Bibliografia
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
