Dostarczanie za pośrednictwem fagów ukierunkowanych konstruktów sRNA w celu obniżenia ekspresji genów u E. coli

Podsumowanie

Opisujemy metodę obniżania ekspresji genów w rosnącej populacji komórek E. coli za pomocą ukierunkowanych sekwencyjnie kaset ekspresji sRNA dostarczanych przez wektor fagowy M13.

Streszczenie

Knockdowny za pośrednictwem RNA są powszechnie stosowane do kontrolowania ekspresji genów. Ta wszechstronna rodzina technik wykorzystuje krótkie RNA (sRNA), które może być syntetyzowane z dowolną sekwencją i zaprojektowane tak, aby uzupełniać dowolny gen przeznaczony do wyciszenia. Ponieważ konstrukty sRNA mogą być wprowadzane do wielu typów komórek bezpośrednio lub przy użyciu różnych wektorów, ekspresja genów może być tłumiona w żywych komórkach bez pracochłonnej modyfikacji genetycznej. Najpowszechniejsza technologia knockdown RNA, interferencja RNA (RNAi), wykorzystuje endogenny kompleks wyciszający indukowany RNA (RISC) do pośredniczenia w rozpoznawaniu sekwencji i rozszczepianiu docelowego mRNA. Zastosowania tej techniki są zatem ograniczone do organizmów wykazujących ekspresję RISC, głównie eukariontów. Niedawno nowe pokolenie biotechnologów RNA opracowało alternatywne mechanizmy kontrolowania ekspresji genów za pomocą RNA, a tym samym umożliwiło knockdowny genów u bakterii za pośrednictwem RNA. Tutaj opisujemy metodę wyciszania ekspresji genów u E. coli, która funkcjonalnie przypomina RNAi. W tym systemie syntetyczny fagiamid jest przeznaczony do ekspresji sRNA, który może być przeznaczony do celowania w dowolną sekwencję. Konstrukt ekspresji jest dostarczany do populacji komórek E. coli z nielitycznym fagiem M13, po czym jest w stanie stabilnie replikować się jako plazmid. Rozpoznawanie antysensowne i wyciszanie docelowego mRNA odbywa się za pośrednictwem białka Hfq, endogennego wobec E. coli. Protokół ten obejmuje metody projektowania antysensownego sRNA, konstruowania wektora fagowego, pakowania fagi w bakteriofag M13, przygotowania żywej populacji komórek do infekcji i przeprowadzenia samej infekcji. Białko fluorescencyjne mKate2 i gen oporności na antybiotyki acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT) mają na celu wygenerowanie reprezentatywnych danych i ilościowe określenie skuteczności knockdownu.

Wprowadzenie

Eliminacje genów za pośrednictwem RNA przebiegają w dwóch etapach. Najpierw cząsteczka RNA jest wprowadzana do badanej linii komórkowej lub organizmu. Po drugie, endogenne białka wiążące RNA ułatwiają rozpoznawanie celu RNA i wywołują efekt wyciszania. Wszystkie technologie knockdown RNA korzystają z konfigurowalnego charakteru syntetycznych sRNA, które można łatwo wyprodukować w celu dopasowania do określonego celu zainteresowania. Jednak szczegóły molekularne wychwytu i wyciszania RNA różnią się znacznie w zależności od systemu modelowego, ograniczając miejsce i sposób zastosowania knockdownów RNA.

U nicieni, dwuniciowe cząsteczki RNA (dsRNA) mogą być wprowadzane bezpośrednio do pożywki lub poprzez karmienie robaków populacją komórek E. coli wykazujących ekspresję dsRNA^1,2. U Drosophila RNAi można uzyskać poprzez mikroiniekcję zarodków z dsRNA³ lub wdrożyć w liniach komórkowych po prostu dodając dsRNA do pożywki^{hodowlanej 4}. W liniach komórkowych ssaków syntetyczne małe interferujące RNA (siRNA) mogą być dostarczane do żywych komórek przez elektroporację^1,2,5, pakowane w liposomy^3,6 lub wyrażane z wektorów plazmidowych^{DNA 4,7}. Gdy gatunek RNA dotrze do cytozolu, szlak RNAi opiera się na kompleksie RISC do przetwarzania dsRNA, ułatwiania antysensownego rozpoznawania celu i katalizowania represji translacyjnej, degradacji mRNA lub tworzenia heterochromatyny, w zależności od gospodarza.

Ze względu na te wymagania, klasyczne RNAi może być wykonywane tylko w organizmach, które efektywnie pobierają egzogenne RNA i wyrażają aktywność podobną do RISC. W szczególności wyklucza to modelową bakterię E. coli, która nie ma szlaku RNAi. Jednak ostatnie postępy w biologii syntetycznej dostarczają narzędzi do rozwiązania zarówno problemu porodu, jak i problemu wyciszania.

W tym protokole, konstrukty sRNA są wyrażane w E. coli z wektora DNA dostarczonego do żywych komórek za pomocą systemu M13 phagemid/helper. Fagimid to dowolny plazmid o pochodzeniu replikacji f1 pochodzącym z faga. Plazmid pomocniczy, w tym przypadku M13KO, przenosi całą maszynerię wymaganą do produkcji cząsteczek wirusa, ale sam w sobie nie jest kompetentny do replikacji i pakowania. Kiedy fagim i plazmid pomocniczy są jednocześnie przekształcane, sam jest replikowany w punkcie początkowym f1, pakowany i wydzielany. Wektoryzowany fagiamid jest następnie kompetentny do infekowania żywych E. coli za pośrednictwem pilusa F.

W tym systemie, efekt wyciszania jest wytwarzany przez niestandardowe kasety sRNA łączące sekwencję rusztowania z sekwencją wiążącą cel. Sekwencja wiążąca cel to 24 pary zasad antysensowne do celu mRNA, zwykle w miejscu wiązania rybosomów (RBS). Sekwencja rusztowania, opracowana przez Na i współpracowników⁸, zawiera motyw wiążący Hfq wyekstrahowany z MicC, małego regulatorowego RNA endogennego do E. coli. Białko Hfq stymuluje wiązanie RNA-RNA i degradację mRNA, pełniąc rolę w tym systemie podobną do RISC w RNAi. Rysunek 1 przedstawia pełny schemat knockdownów sRNA za pośrednictwem fagów, w tym strukturę kasety sRNA, wektoryzację fagów i mechanizm wyciszania.

Jako metoda modulowania ekspresji genów u E. coli, wyciszanie sRNA jest proste, szybkie i wszechstronne. Docelowa E. coli nie jest obciążona poza propagacją fagimidu i ekspresją sRNA. Może to być istotne w kontekście biologii syntetycznej lub badań podstawowych, w których ekspresja większych konstruktów heterologicznych może obciążać zasoby komórkowe⁹. Fagimidy z nowymi celami mogą być wytwarzane za pomocą pojedynczego PCR i zbierane jeden dzień po transformacji fagowej. Wreszcie, prawie każde mRNA może być celowane. Wykazano, że kaseta regulacji sRNA (na standardowym plazmidzie) działa na różne cele w metabolizmie z typowymi poziomami represji >90%⁸.

Ten protokół odtwarza i rozszerza wcześniejsze prace przy użyciu kaset sRNA urodzonych przez fagi¹⁰. Po pierwsze, pakowany fagiamid jest wprowadzany do hodowli okresowej komórek E. coli i używany do wyciszenia ekspresji białka fluorescencyjnego mKate2. Kolejne zmiany fluorescencji są monitorowane w czasie rzeczywistym. Po drugie, wykazano, że strącenie genu CAT zmniejsza fenotypową oporność na chloramfenikol na płytkach agarowych. W obu przypadkach sam jest nosicielem markera GFP, co pozwala na pomiar częstości infekcji niezależnie od skuteczności knockdownu.

Protokół

1. Projektowanie i budowa wektorów fagowych zawierających kasety wyciszające sRNA

1. De novo projekt kaset wyciszających sRNA⁸
   1. Zidentyfikuj pełną sekwencję mRNA, która ma zostać wyciszona, korzystając z bazy danych sekwencji DNA. Aby wygenerować sekwencję DOCELOWĄ, zanotuj pierwsze 24 pz sekwencji kodującej, od pozycji +1 do +24, zaczynając od kodonu start (np. ATG).
      Uwaga: Wyciszanie jest mniej skuteczne, gdy celem są inne miejsca lub segmenty mRNA⁸.
   2. Weź odwrotne uzupełnienie sekwencji TARGET, aby wytworzyć sekwencję GUIDE dla kasety sRNA. Tabela 1 zawiera przykłady sekwencji TARGET i GUIDE dla acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT).
   3. Aby zaprojektować pełną kasetę ekspresji sRNA 292 pz, należy ułożyć szeregowo promotor pR, sekwencję GUIDE, domenę wiążącą białko Hfq i sekwencje terminatora transkrypcji T1 / TE (Tabela 2).
   4. Dodaj dodatkowe wybrane miejsca klonowania, aby ułatwić klonowanie kasety sRNA do wektora docelowego.
   5. Uzyskaj kompletną kasetę sRNA poprzez komercyjną syntezę genów lub podobną metodę i sklonuj ją do dowolnego wektora fagowego o funkcjonalnym pochodzeniu replikacji f1¹¹. Zobacz Informacje pomocnicze, aby uzyskać pełną sekwencję końcowego wektora faga.
2. Zmiana sekwencji docelowej przez istniejącą kasetę ekspresji sRNA przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce opartej na PCR¹²
   1. Zidentyfikuj sekwencję GUIDE 24 pz w istniejącej kasecie ekspresji sRNA. Uwaga: Plazmid pAB.001 z adnotacjami, użyty w tej pracy, jest dostępny jako uzupełniający plik sekwencyjny.
   2. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu z krótkimi obszarami homologii do istniejącej kasety sRNA, flankujące nową sekwencję GUIDE 24 pz. Otrzymaj startery poprzez komercyjną syntezę oligonukleotydów.
      Uwaga: Projekt podkładu dla mutagenezy ukierunkowanej na miejsce przedstawiono na rysunku 2. Dokładne sekwencje matryc starterów przedstawiono w tabeli 3.
   3. Przygotować 5 ml kultury E. coli z matrycą fagmidu ekspresji sRNA. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, w pożywce LB z odpowiednimi antybiotykami.
   4. Ekstrahować i oczyszczać matrycę fagamidu wyrażającego sRNA z 5 ml kultury bakteryjnej za pomocą zestawu do miniprzygotowania DNA lub podobnej metody¹².
   5. Przygotować dwie reakcje PCR przy użyciu matrycowego fagenu ekspresji sRNA i polimerazy o wysokiej wierności, jedną ze starterem do przodu, a drugą ze starterem odwrotnym (Tabela 4). Należy stosować warunki PCR zgodnie z zaleceniami dostawcy polimerazy (Tabela 5). Zwiększ stężenie matrycy do 10-50 razy wyższe niż w reakcji standardowej, aby uwzględnić fakt, że reakcja pojedynczego startera nie powoduje wykładniczego amplifikacji.
   6. Połącz dwie powyższe reakcje PCR w probówce mikrowirówkowej. Wyżarzać produkty przez podgrzanie do 98 °C we wrzącej łaźni wodnej. Natychmiast po umieszczeniu probówki mikrowirówkowej w łaźni wodnej należy usunąć źródło ciepła i pozostawić kąpiel powoli do temperatury pokojowej w ciągu 1-2 godzin.
   7. Aby wyeliminować niezmutowany famid ekspresji sRNA, należy dodać 1 μl. enzymu restrykcyjnego DpnI do mieszaniny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub czas zalecany przez producenta do całkowitego roztrawienia.
      Uwaga: DpnI trawi tylko metylowane miejsca docelowe, które są obecne na fagach replikowanych przez gospodarza, ale nie na produktach PCR.
   8. Przekształć zakupione lub przygotowane¹³ chemicznie kompetentnych bakterii E. coli za pomocą 1-5 μl wyżarzonego produktu PCR. Wyizolować pojedyncze kolonie przekształconego szczepu poprzez selektywne posiew na płytkach agarowych LB zawierających odpowiednie antybiotyki.
   9. Aby zweryfikować włączenie prawidłowej sekwencji GUIDE, należy przebadać powstałe kolonie za pomocą PCR kolonii. Używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl, zbierz niewielką ilość komórek z pojedynczej przekształconej kolonii. Oznaczyć i zachować oryginalną kolonię do dalszego wykorzystania po weryfikacji.
   10. Zebrane komórki dodać do 50 μl wody wolnej od nukleaz w probówce do mikrowirówki. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
   11. Za pomocą termocyklera laboratoryjnego lub wrzącej łaźni wodnej poddać komórki lizie, podgrzewając je do temperatury 95 °C przez 2 minuty.
   12. Amplifikacja PCR regionu fagowego przy użyciu 1 μl komórek poddanych lizie termicznej jako matrycy DNA. Warunki PCR i protokoły termocyklera przedstawiono w tabelach 6 i 7. Zapoznaj się z uzupełniającym plikiem sekwencji pAB.001, aby zapoznać się z sekwencjami starterów weryfikacyjnych.
   13. Zsekwencjonuj produkt PCR, aby sprawdzić, czy zawiera się prawidłowa sekwencja GUIDE.
   14. Zaszczepić 5 ml kultury klonu E. coli przenoszącego fagemid o zweryfikowanej sekwencji ekspresji sRNA. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, w selektywnych pożywkach LB.
   15. Przygotować zapas glicerolu z klonu zweryfikowanego pod kątem sekwencji. Dodać 750 μl nocnej hodowli do 250 μl 60% glicerolu w zakręcanej krioprobówce.
   16. Przechowywać zapas glicerolu w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Pozostała część nocnej hodowli może być wykorzystana jako źródło fagamidu wyrażającego sRNA w kroku 2.

2. Produkcja i zbiór zapasów fagenów w opakowaniach M13

1. Przygotować 5 ml kultury E. coli przenoszącej fagemid wyrażający sRNA. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, w pożywce LB z odpowiednimi antybiotykami. Uwaga: Famid wyrażający sRNA można uzyskać poprzez klonowanie de novo, jak opisano w kroku 1.1.5, lub zmodyfikowany z istniejącego fagi i zebrany w kroku 1.2.16.
2. Podobnie przygotuj 5 ml kultury E. coli przenoszącej plazmid pomocniczy M13KO7. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, w selektywnych pożywkach LB.
3. Ekstrahuj i oczyść famid ekspresji sRNA i plazmid pomocniczy za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA lub podobnej metody¹².
4. Kotransformacja zakupiona lub przygotowana¹³ chemicznie kompetentnych E. coli z 1 μl fagimidem ekspresji sRNA i plazmidem pomocniczym. Wybierz kotransformanty przez posiew na agarze LB z selektywnymi antybiotykami dla obu konstruktów.
5. Przygotować 10 ml kultury z pojedynczej kolonii współprzekształconego szczepu w LB z selektywnymi antybiotykami. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 8-12 godzin lub przez noc.
6. Odwirować kulturę o stężeniu 3 300 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant i przefiltrować przez filtr 0,2 μm. Uwaga: W przypadku rozlania pożywki należy oczyścić obszar rozcieńczonym wybielaczem (0,5%), aby zniszczyć zakaźne cząsteczki fagów.
7. Przechowywać zapakowany filtrat fagowy w temperaturze 4 °C. Uwaga: Próbki można przechowywać przez kilka dni lub tygodni bez utraty aktywności.

3. Przygotowanie komórek docelowych F⁺ do wyciszenia

1. Określ, czy komórki, które mają być przeznaczone do wyciszenia, wyrażają pilus F¹⁴. Jeśli pilus F jest już obecny, przejdź do kroku 4.
   Uwaga: Typowe laboratoryjne szczepy E. coli są oznaczone jako F⁺ lub F', aby wskazać obecność pilusa F w ich genomie lub na plazmidzie.
2. Uzyskaj szczep F+ E. coli, taki jak TOP10F'.
   Uwaga: Upewnij się, że szczep docelowy ma unikalny marker oporności, aby mógł zostać oddzielony od dawcy plazmidu F po koniugacji.
3. Aby wprowadzić pilus F przez koniugację ze szczepem F⁺, należy przygotować 5 ml kultur zarówno szczepu docelowego, jak i dawcy plazmidu F¹⁴. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, w pożywce LB z odpowiednimi antybiotykami.
4. Następnego dnia rozcieńczyć oba szczepy w stosunku 1:100 w 5 ml selektywnego LB i kontynuować hodowlę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
5. Określić fazę wzrostu komórek, mierząc gęstość optyczną kultury przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) za pomocą spektrofotometru laboratoryjnego. Hodować komórki przez około 2 godziny, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ 0,3, co wskazuje na wzrost w fazie logarytmicznej¹⁵.
6. Przygotować 3 reakcje koniugacji w probówkach do mikrowirówek: 0,5 ml dawcy plazmidu F + 0,5 ml szczepu docelowego, 0,5 ml dawcy plazmidu F + 0,5 ml pożywki LB (kontrola ujemna) i 0,5 ml szczepu docelowego + 0,5 ml pożywki LB (kontrola ujemna). Pozostawić koniugację na 2 godziny w temperaturze 37 °C z wstrząsem.
7. Umieścić 100 μl każdej reakcji koniugacji na selektywnym agarze LB z antybiotykami specyficznymi dla plazmidu F (zwykle tetracykliny) i szczepu docelowego. Na płytce należy przeprowadzić reakcje kontroli ujemnej, aby potwierdzić, że ani szczep dawcy, ani biorcy nie wyrażają obu oporności na antybiotyki.

4. Zakażenie pakowanymi fagimidami w celu wyciszenia

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię komórek docelowych F⁺ w 5 ml kultury pożywki LB odpowiednimi antybiotykami. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
2. Następnego dnia rozcieńczyć komórki docelowe F⁺ w stosunku 1:100 w 5 ml selektywnej pożywki LB i kontynuować hodowlę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
3. Określić fazę wzrostu komórek, mierząc gęstość optyczną kultury przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) za pomocą spektrofotometru laboratoryjnego. Hodować komórki przez około 2 godziny, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ 0,3, co wskazuje na wzrost w fazie logarytmicznej¹⁵. Uwaga: Ekspresja pilusa F i skuteczność infekcji jest najwyższa w fazie logarytmicznej.
4. Dodaj fagimidy w pakiecie M13 (z kroku 2.6) do komórek docelowych w stosunku objętościowym 1:100, aby osiągnąć prawie 99% zakażenie populacji docelowej. Pozostawić infekcję do postępu w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez 30-60 min.
5. Oznacz fenotyp wyciszający sRNA zgodnie z wybraną metodą.
   Uwaga: W przypadku docelowego białka fluorescencyjnego efekt wyciszenia można określić ilościowo bezpośrednio za pomocą fluorometrii¹⁰. Alternatywnie, testy fenotypowe mogą być stosowane do obserwacji fenotypowych konsekwencji knockdownu genu⁸.
6. Przygotuj zapas glicerolu dla gospodarza fagowego wykazującego ekspresję sRNA, wykonując kroki 1.2.14-1.2.16. Uwaga: fagimid będzie się rozmnażał w szczepie gospodarza w nieskończoność i może być utrzymywany za pomocą antybiotyku podobnego do konwencjonalnego plazmidu.

Wyniki

Wyciszanie fluorescencji mKate2 w mediach płynnych

Rycina 1 przedstawia schemat wyciszania genów za pomocą sRNA opisany w niniejszej pracy, w tym konstrukcję kasety sRNA, wektoryzację fagemidową oraz mechanizm wyciszania. Zgodnie z protokołem 1.2, kasetę wyciszającą sRNA plazmidu pAB.001 zmodyfikowano tak, aby była skierowana przeciwko mKate. Kasetę sRNA zsyntetyzowano i sklonowano do fagemidu Litmus28i_J23115-B0032-GFP, przekazanego przez Monicę Ortiz i Drew Endy¹¹. Fagemid ten niesie markery ekspresji GFP oraz oporności na kanamycynę, co pozwala na monitorowanie pomyślnych infekcji. Zapakowane zapasy fagemidów przygotowano zgodnie z protokołem 2.

Przygotowano pochodną szczepu E. coli K12 MG1655 z konstytutywnie ekspresowanym, zintegrowanym chromosomalnie markerem mKate2 do infekcji fagiem poprzez koniugację ze szczepem donorem plazmidu F zgodnie z protokołem 3. Komórki hodowano do środkowej fazy logarytmicznej, a następnie wprowadzono fagemid zgodnie z protokołem 4. Po infekcji fagemidem 200 μl kultur przeniesiono do fluorescencyjnego czytnika płytek i stale monitorowano fluorescencję przez 24 hr.

Rycina 3 przedstawia wpływ wyciszania za pośrednictwem sRNA na ekspresję mKate2. Szczep zainfekowany fagemidem anty-mKate2 nie wykazał mKate2 fluorescencji powyżej poziomu tła. W przeciwieństwie do tego, szczep ten eksponował marker GFP, co wskazuje na pomyślne pobranie fagemidu. Niezinfekowane komórki kontrolne wykazywały fluorescencję mKate2, ale nie GFP. Dodatkowa kontrola, w której domena celująca anty-mKate2 została zastąpiona sekwencją celującą w CAT, nie miała wpływu na fluorescencję mKate2.

Wyciszanie oporności na chloramfenikol na płytkach agarowych

Zgodnie z protokołem 1.1 przygotowano kasetę wyciszającą sRNA nakierowaną na CAT. Derivat E. coli K12 MG1655 zawierający konstytutywnie ekspresowany, zintegrowany chromosomowo marker CAT przygotowano do infekcji fagowej poprzez koniugację ze szczepem donorem plazmidu F zgodnie z protokołem 3. Komórki hodowano do średniej fazy logarytmicznej, a następnie wprowadzono phagemid zgodnie z protokołem 4. Po 1 hr inkubacji w 37 °C zainfekowane komórki poddano rozcieńczeniom seryjnym i wysiano na podłoża z różnymi stężeniami chloramfenikolu. Płytki inkubowano przez noc, a proporcję komórek opornych przy każdym stężeniu chloramfenikolu określono poprzez zliczenie jednostek tworzących kolonie (CFUs) następnego dnia.

Rycina 4 przedstawia wpływ wyciszania pośredniczonego przez sRNA na fenotyp oporności na chloramfenikol. Komórki niezakażone lub komórki zakażone fagemidem celującym w mKate2 były oporne na chloramfenikol we wszystkich badanych stężeniach. W przeciwieństwie do nich, komórki zakażone fagemidem celującym w CAT wykazały obniżoną przeżywalność przy niskich stężeniach chloramfenikolu oraz niemal 99% śmiertelności przy wyższych stężeniach. Dodanie ampicyliny, w celu wyselekcjonowania wyłącznie bakterii niosących fagemid, zredukowało przeżywalność w obecności chloramfenikolu do poziomów niewykrywalnych. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że uniknięcie infekcji fagowej jest powszechną drogą ucieczki przed wyciszaniem¹⁰.

Rycina 1: Wyciszanie genów w E. coli za pomocą kaset ekspresyjnych sRNA dostarczanych przez fagi M13. Kaseta sRNA składa się z 4 modułów: promotora pR (konstytutywnego promotora pochodzącego z bakteriofaga lambda), 24 bp domeny celującej, domeny wiążącej Hfq wyodrębnionej z MicC oraz terminatora transkrypcji⁸. Kaseta jest włączana do fagmidu posiadającego miejsce inicjacji replikacji M13 f1 i pakowana do kapsydu M13 przy użyciu faga pomocniczego M13KO7. Spakowane fagmidy są zdolne do infekowania E. coli wykazujących obecność pilusa F, gdzie rozpoczyna się ekspresja sRNA. Następnie sRNA rekrutuje białko Hfq (przedstawione na czerwono) i wiąże antysensowny cel mRNA w pobliżu miejsca wiązania rybosomu, co prowadzi do represji translacji i degradacji mRNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Projektowanie starterów i mutageneza celowana miejsca docelowego sRNA. Zaprojektowano dwa startery z częściową homologią do istniejącej kasety sRNA. Starter forward zawiera na końcu 5' 20 bp homologicznych do promotora pR, następnie 24 bp reprezentujące nową sekwencję GUIDE, a na końcu 3' 18 bp homologicznych do domeny wiążącej Hfq. Starter reverse stanowi dokładne odwrócone dopełnienie startera forward, z regionami homologii do istniejącej kasety sRNA flankującymi odwrócone dopełnienie nowej sekwencji GUIDE. Dokładne sekwencje starterów podano w Tabeli 3. Oddzielne reakcje PCR z pojedynczym starterem (forward i reverse) prowadzą do otrzymania liniowego, jednoniciowego DNA z pożądaną zmodyfikowaną sekwencją. Wyżarzanie produktów reakcji forward i reverse, po oczyszczeniu opisanym w protokole, prowadzi do uzyskania dwuniciowego plazmidowego DNA zawierającego pożądaną zmodyfikowaną kasetę sRNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Knockdown chromosomowo zintegrowanego reportera fluorescencyjnego mKate2. E. coli MG1655 K12 ekspresyjące mKate2 pozostawiono bez obróbki (czerwone linie i słupki), zainfekowano fagmidem anty-mKate2 (zielone linie i słupki) lub zainfekowano fagmidem kontrolnym celującym w CAT (niebieskie linie i słupki). (A) Niepoddane obróbce E. coli osiągnęły wyższe gęstości nasycenia, co wskazuje na koszt metaboliczny infekcji fagowej. Linie przerywane oznaczają odchylenia standardowe z 3 powtórzeń. (B) Sygnał mKate2 został zredukowany niemal do poziomu tła w szczepie traktowanym anty-mKate2, ale nie w szczepach kontrolnych. (C) Fluorescencja GFP, również niesiona przez fagmid, była wykrywalna tylko w kontrolach traktowanych fagmidem. (D, E) Końcowe odczyty fluorescencji po 24 h wzrostu znormalizowano do OD. Sygnał GFP, wskazujący na infekcję fagmidową, był nieobecny w niepoddanych obróbce kontrolach, lecz był również znacznie zredukowany po traktowaniu fagmidem anty-CAT. Może to wskazywać na efekty off-target fagmidu. Sygnał mKate2 został zredukowany przez traktowanie fagmidem anty-mKate2 w porównaniu do niepoddanych obróbce kontroli. Kontrolny fagmid celujący w CAT nie wykazał wpływu na fluorescencję mKate2. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z 3 powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Wyciszenie genu CAT przywraca wrażliwość na chloramfenikol w populacji genetycznie opornej. E. coli MG1655 K12 z chromosomalnie zintegrowanym genem CAT pozostawiono bez opracowania (słupki czerwone), potraktowano fagmidem kontrolnym nakierowanym na mKate2 (słupki zielone) lub potraktowano fagmidem ekspresyjnym anty-CAT sRNA (słupki niebieskie). Po 1 hr infekcji oceniono żywotność na wskazanych antybiotykach za pomocą seryjnych rozcieńczeń i wysiewu na płytki. Szczepy potraktowane fagmidem anty-CAT zostały w znacznym stopniu wyeliminowane (>90%) przez chloramfenikol w wyższych stężeniach, podczas gdy opracowania kontrolne nie wykazały zmian. Dodanie ampicyliny do płytek hodowlanych umożliwia pozytywną selekcję infekcji fagmidem i eliminuje komórki niezainfekowane. W tych warunkach po opracowaniu anty-CAT nie zaobserwowano kolonii opornych na chloramfenikol. Wskazuje to, że większość przeżywających komórek reprezentuje brak infekcji, a nie brak wyciszenia. Słupki błędu przedstawiają odchylenie standardowe z 3 powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

sekwencja docelowa CAT	5' - ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3'
sekwencja CAT GUIDE	5' - ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3'

Tabela 1: Przykład sekwencji TARGET i GUIDE dla genu CAT. Zwróć uwagę na relację komplementarności odwrotnej.

promotor pR	TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC
sekwencja GUIDE	ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT
domena wiążąca Hfq	TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG
terminator T1/TE	CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA

Tabela 2: Składniki sekwencji kasety sRNA. Każda sekwencja jest zapisana w kierunku 5'-3'. Kompletna kaseta stanowi konkatenację tych 4 elementów w podanej kolejności i obejmuje 292 bp.

Starter Forward	5' - CTGGCGGTGATAATGGTTGC[GUIDE]TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3'
Starter Reverse	5' - GCAATGGCCCAACAGAAA[TARGET]GCAACCATTATCACCGCCAG - 3'

Tabela 3: Projektowanie starterów w celu modyfikacji istniejących elementów GUIDE. Starter forward obejmuje ostatnie 20 bp promotora pR, nową sekwencję GUIDE oraz pierwsze 18 bp domeny wiążącej Hfq. Sekwencja TARGET stanowi dokładny rewersyjny komplement sekwencji GUIDE. Starter reverse jest dokładnym rewersyjnym komplementem startera forward.

Komponent	Objętość
Plazmid matrycowy	500 ng
10 µStarter M	2.5 μl
10 mM dNTP	0.4 μl
Polimeraza o wysokiej wierności (2 U/μl)	0.5 μProszę o dostarczenie tekstu źródłowego do przetłumaczenia.
Bufor do PCR 5x	10 μL
Objętość całkowita	50 μl

Tabela 4: Sugerowane warunki dla mutagennej PCR z jednym starterem.

Krok	Temp.	Czas
Denaturacja początkowa	98 °C	30 sec
30 cykli	98 °C	10 sec
	55 °C	30 sec
	72 °C	120 sec
Wydłużanie końcowe	72 °C	300 sec
Przechowywanie	10 °C

Tabela 5: Sugerowany protokół termocyklera dla mutagennej PCR z jednym starterem.

Komponent	Tom
Matryca DNA	1 μl
10 µStarter bezpośredni M	0.5 μl
10 µodwrócony starter M	0.5 μl
Taq 2X Master Mix	25 μl
Woda wolna od nukleaz	23 μl
Objętość całkowita	50 μl

Tabela 6: Sugerowane warunki dla PCR weryfikacji sekwencji.

Krok	Temp.	Czas
Denaturacja wstępna	95 °C	30 sec
30 cykli	95 °C	30 sec
	55 °C	30 sec
	68 °C	30 sec
Ekstensja końcowa	68 °C	300 sec
Przechowywanie	10 °C

Tabela 7: Sugerowany protokół termocyklera dla PCR weryfikacji sekwencji.

Dyskusja

Obecna metoda pozwoliła osiągnąć 80% redukcję poziomu fluorescencji mKate w porównaniu z nieukierunkowanymi kontrolami. Jest to zgodne z innymi metodami knockdown RNA, w których nie obserwuje się całkowitego wyciszenia, a typowa jest 50-90% sprawność^16,17. Na poziomie fenotypowym knockdowny ukierunkowane na CAT były w stanie znacznie osłabić oporność na chloramfenikol i wyeliminować ją w pewnych warunkach.

Fenotyp knockdown był wykrywalny na poziomie populacji już po kilku godzinach po infekcji (Figura 3B). Ilustruje to ważną cechę dostarczania opartego na fagach: wysoką częstotliwość knockdown można uzyskać bezpośrednio w hodowli okresowej bez wcześniejszej modyfikacji genetycznej. W przeciwieństwie do konwencjonalnych modyfikacji genetycznych wykorzystujących transformację plazmidową lub integrację genomową, zakażenie fagami nie wymaga ponownego wyhodowania populacji z pojedynczej izolowanej kolonii. Pozwala to na badanie skutków infekcji fagowej w populacjach o złożonej dynamice przestrzennej¹¹, z wcześniej istniejącymi strukturami przestrzennymi, takimi jak biofilmy¹⁸, lub w genetycznie mieszanych populacjach naturalnych¹⁹.

Krytycznym etapem w tej metodzie jest produkcja pakowanego fagamidu o wysokim mianie. Obciążenie metaboliczne związane z produkcją cząstek fagów może prowadzić do wysokiego tempa mutacji lub utraty plazmidu w szczepie produkującym fagi. Zaleca się, aby szczep produkcyjny fagimidów był hodowany bezpośrednio z pojedynczej współprzekształconej kolonii, a nie chłodzony, mrożony lub subhodowlany przed pobraniem fagów. Niską efektywność kotransformacji można również zaobserwować przy jednoczesnym wprowadzaniu fagimidu i plazmidu pomocniczego do E. coli . W tym przypadku wyższą wydajność można uzyskać, przekształcając najpierw plazmid pomocniczy, a następnie przygotowując kompetentne komórki zawierające plazmid pomocniczy do późniejszej transformacji za pomocą fagimidu.

Zakażenie fagenmidem lub ekspresja sRNA również nakłada wykrywalne obciążenie metaboliczne na komórki docelowe i może powodować pewne zaburzenia fenotypowe. Na przykład zmniejszenie fluorescencji mKate2 zaobserwowano nawet wtedy, gdy komórki były zakażone fagiem ukierunkowanym na CAT (Figura 3). Uważa się, że zakażenie M13 nie wywołuje ogólnoustrojowych reakcji na stres u E. coli²⁰, ale może pośrednio zmieniać wzorce transkrypcyjne. Alternatywnie, markery GFP lub ampicyliny zawarte w fagimidze mogą konkurować o zasoby komórkowe, zmniejszając ekspresję i wzrost mKate2⁹. Wreszcie, sama kaseta sRNA może globalnie zmieniać profile ekspresji genów poprzez miareczkowanie białka Hfq lub wyciszanie mRNA poza celem. Efekty niepożądane są powszechne w przypadku RNAi in vivo ukierunkowanego na^21-23, ale nie zostały jeszcze systematycznie zbadane dla tego systemu.

Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że skuteczność infekcji jest mniejsza niż 100%, co pozwala niektórym niezakażonym bakteriom przetrwać w populacji. Wyniki tej pracy i wcześniejszych prac¹⁰ sugerują, że niezakażone komórki stanowią 1-10% końcowej populacji i są odpowiedzialne za większość obserwowanych fenotypów niewyciszonych. Znane są różne drogi do oporności na M13, z których najczęstszą jest mutacja utraty ekspresji pilusa²⁴. W świetle tych ograniczeń należy stosować kontrole w celu potwierdzenia wysokich wskaźników infekcji i skuteczności powalania.

Innym potencjalnym ograniczeniem w przypadku niektórych zastosowań jest sporadyczne przenoszenie zanieczyszczającego faga pomocniczego. Chociaż M13K07 zawiera zmutowany sygnał pakowania, może być pakowany do kapsydu fagowego z niską częstotliwością i przenoszony do zakażonych populacji, co skutkuje komórkami kompetentnymi do produkcji fagów i ciągłym rozprzestrzenianiem się faga po początkowym zdarzeniu infekcji²⁵. Modyfikacje faga pomocniczego okazały się skuteczne w zmniejszaniu ilości niespecyficznych opakowań, choć czasami kosztem zmniejszonej produkcji fagów²⁶.

Zmodyfikowane bakteriofagi stały się nieodzownym narzędziem biologii syntetycznej E. coli , umożliwiając szybkie dostarczanie nowych genów do rosnącej populacji. Niedawne prace doprowadziły do powstania międzykomórkowych obwodów komunikacyjnych¹¹ lub czynników transkrypcyjnych wyrażających się w celu tłumienia szlaków oporności na antybiotyki²⁷. Przedstawiony tutaj protokół uzupełnia rosnącą kolekcję narzędzi, które umożliwiają kontrolę fizjologii bakterii za pomocą zaprogramowanych RNA. Wykazano, że nukleazy CRISPR-Cas, gdy są zmutowane w celu wyeliminowania aktywności nukleazy, hamują transkrypcję w celach genowych kierowanych przez RNA^17,28. Natomiast wyciszanie sRNA działa na poziomie translacyjnym i nie wymaga ekspresji białek egzogennych. Biotechnologie nowej generacji mogą połączyć kontrolę transkrypcyjną i translacyjną z dostarczaniem za pośrednictwem fagów, aby programować złożone fenotypy w czasie rzeczywistym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do miniprzygotowania plazmidu	Qiagen	27104
DpnI Enzym	NEB	R0176S
Phusion Polimeraza o wysokiej wierności	NEB	M0530S
Taq 2x Master Mix	NEB	M0270L
M13KO7 pomocniczy	NEB	N0315S
DH5α Competent	Cells Life Technologies	18265-017
TOP10F' Cells	Life Technologies	C3030-03
LB Bulion	Sigma	L3022-250G
Ampicillin	Sigma	A9393-5G
Kanamycyna	Sigma	60615-5G
Chloramfenikol	Sigma	C0378-5G
Tetracyklina	Sigma	87128-25G