Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53619

⸱

24 lutego 2016

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę przygotowania zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło z dostępnymi na rynku materiałami. Pokazuje również, jak zmierzyć proces kawitacji mikropęcherzyków zsyntetyzowanych liposomów po leczeniu laserem impulsowym.

Streszczenie

Nanocząstki reagujące na światło (NPs) zyskały znaczną uwagę ze względu na ich potencjał w zapewnianiu przestrzennej, czasowej i dawkowanej kontroli nad uwalnianiem leku. Jednak większość odpowiednich technologii jest nadal w fazie rozwoju i nie mogą być dostępne w przypadku klinik. Tutaj opisujemy łatwe wytwarzanie tych światłoczułych nanocząsteczek za pomocą dostępnych na rynku nanocząsteczek złota i liposomów termoczułych. Kalceina jest stosowana jako lek modelowy do oceny skuteczności enkapsulacji i profilu kinetycznego uwalniania po stymulacji cieplnej/świetlnej. Na koniec pokazujemy, że to wyzwalane światłem uwolnienie jest spowodowane rozerwaniem błony spowodowanym kawitacją mikropęcherzyków, którą można zmierzyć za pomocą hydrofonu.

Wprowadzenie

Możliwość wywołania uwalniania leku za pomocą bodźców zewnętrznych jest atrakcyjnym sposobem dostarczania leków w sposób kontrolowany przestrzennie, czasowo i dawkowo, z maksymalną swoistością i minimalnymi skutkami ubocznymi. Spośród szerokiej gamy egzogennych systemów reagujących na bodźce (światło, pole magnetyczne, ultradźwięki, promieniowanie mikrofalowe), platformy wyzwalane światłem są atrakcyjne ze względu na ich nieinwazyjność, prostotę i zdolność adaptacji w klinikach. 1 Szeroko zakrojone badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady dostarczyły wielu technologii platformowych, takich jak złote nanokaże (Au) odpowiedzialne za działanie w bliskiej podczerwieni pokryte inteligentnymi polimerami,2 fotolabilne, polimerowe nanocząstki (NP) sprzężone z lekami,3 oraz samoorganizujące się nanopęcherzyki porfisomowe. 4 Technologie te znajdują się jednak nadal w przedklinicznej fazie rozwoju i wymagają jasnego zrozumienia i optymalizacji parametrów związanych z procesem inicjowania i kontrolowania uwalniania leku.

Jedną z najprostszych i łatwo dostępnych metod przygotowania takiego systemu jest integracja Au NPs z termicznie wrażliwymi liposomami5,6, które są powszechnie dostępne na rynku i zostały dokładnie zbadane w badaniach przedklinicznych, a nawet klinicznych. Pomimo ograniczenia aktywacji nanocząsteczek Au w głębokich tkankach przy ich plazmonicznej długości fali, w porównaniu z nanostrukturami Au aktywowanymi w bliskiej podczerwieni (np. nanoklatkami), system ten jest nadal bardzo obiecujący, gdy jest stosowany u małych zwierząt lub do miejscowego podawania u ludzi. 7 Istnieją pewne wczesne próby łączenia Au NPs z liposomami w celu uwolnienia wyzwalanego światłem. 8-11 Podczas gdy większość z nich skupia się na nowościach w materiałach, należy zająć się kwestiami dostępności i skalowalności. Co więcej, doniesienia na temat mechanizmów uwalniania z wykorzystaniem tych nanonośników są nadal ograniczone.

Tutaj opisano wytwarzanie liposomów reagujących na światło, jednocześnie naładowanych lekami i hydrofilowymi Au NPs. Kalceina jest stosowana jako związek modelowy do oceny skuteczności enkapsulacji i profilu uwalniania systemu. Ponadto w tym systemie światło pochłaniane przez Au NPs rozprasza się do otaczającego mikrośrodowiska w postaci ciepła, co skutkuje wzrostem lokalnej temperatury. Podczas nagrzewania laserowego powstają mikropęcherzyki powietrza, które powodują mechaniczne rozerwanie liposomów (ryc. 1). Mechanizm kawitacji mikropęcherzyków potwierdzają pomiary hydrofonu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Wyczyść kolby okrągłodenne o pojemności 100 ml za pomocą wody królewskiej (1 część stężonego kwasu azotowego (HNO3) i 3 części stężonego kwasu solnego (HCl)), a następnie opłucz kolby wodą dejonizowaną. Poddaj kolby autoklawowaniu i wysusz je w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 100 °C przez 15 min. Zawiń i przechowuj sterylne kolby do momentu użycia.
  2. Zdezynfekuj zestaw ręcznego mini-ekstrudera za pomocą 70% etanolu.
  3. Włącz rotacyjny ewaporator i ustaw temperaturę kąpieli wodnej oraz chłodnicy odpowiednio na 37 °C i 4 °C.
  4. Przygotuj roztwór zapasowy kalceiny o stężeniu 60 mM, rozpuszczając 374 mg kalceiny w 10 ml 0,1 mM fosforanowego buforu solnego (PBS) (pH 7,4). Dostosuj pH do wartości 7,4 za pomocą 1 M roztworu wodorotlenku sodu (NaOH).

2. Synteza liposomów

  1. Wyjąć lipidy (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) oraz 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[carboxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)) z zamrażarki (-20 °C) i rozmrozić je do temperatury pokojowej (RT).
  2. Odważyć 15,9 mg DPPC, 1,3 mg MPPC oraz 2,8 mg DSPE-PEG2000. Rozpuścić je razem w 2 ml chloroformu.
  3. Przenieść roztwór chloroformu do sterylnej kolby okrągłodennej i odparować rozpuszczalnik za pomocą wirówki rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem, aby utworzyć cienką, suchą warstwę lipidową.
  4. Hydratować warstwę lipidową w temperaturze 45 °C przez 30 min za pomocą 2 ml roztworu wodnego zawierającego 1,95 ml 60 mM kalceiny przygotowanej w kroku 1.4 oraz 50 µl Au NPs (3,36 × 1016 cząsteczek/ml).
  5. Rozgrzać blok grzejny do 45 °C. Umieścić membranę filtracyjną z poliwęglanu o porach 200 nm pomiędzy wspornikami filtra i złożyć zestaw do mini-ekstruzji. Sprawdzić szczelność układu za pomocą wody dejonizowanej (DI water).
  6. Napełnić jedną z strzykawek 1 ml roztworu liposomów z kroku 2.4 i przeprowadzić ekstruzję próbki, przepuszczając roztwór do strzykawki znajdującej się po drugiej stronie złożonego mini-ekstrudera. Powtórzyć czynność 11 razy.
  7. Przepuścić zsyntetyzowane liposomy przez kolumnę odsalającą PD-10, aby usunąć wolne Au NPs, lipidy i kalceinę, używając PBS jako eluentu zgodnie z protokołem producenta.
  8. Próbki przechowywać w sterylnych probówkach w temperaturze 4 °C i wykorzystać w ciągu 2 dni.

3. Uwalnianie kalceiny z liposomów pod wpływem ogrzewania

  1. Oblicz molalność lipidów w roztworze stokowym, sumując molalności DPPC, MPPC oraz DSPE-PEG2000 z kroku 2.2. Rozcieńcz roztwór stokowy liposomów do stężenia lipidów 5 mM, używając buforu PBS 0,1 mM (pH 7,4). Przenieś próbki do probówki wirówkowej (2 ml).
  2. Umieść probówkę w łaźni wodnej i stopniowo podnoś temperaturę od 25 do 70 °C. Zwiększaj temperaturę w tempie 1 °C/min.
  3. Pobieraj aliquoty (10 µl) w różnych punktach temperaturowych (27, 32, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 57, 62, 67 i 70 °C).
  4. Dodaj 10 µl 2% Triton X-100 do 2 ml aliquoty roztworu liposomalnego, aby przeprowadzić trawienie liposomów przez 10 min w RT i uzyskać całkowite uwolnienie kalceiny.
  5. Przenieś 200 µl roztworu liposomalnego do każdego dołka w mikropłytce 96-dołkowej i zmierz intensywność fluorescencji pobranych próbek za pomocą mikro forecastszytowego czytnika fluorescencji. Długości fal wzbudzenia i emisji kalceiny wynoszą odpowiednio 480 i 515 nm.
  6. Przyjmując intensywność fluorescencji próbek traktowanych Triton X-100 za 100% uwolnienia, oblicz procent uwolnionej kalceiny w każdym punkcie czasowym, korzystając z wzoru:
    Wzór równowagi statycznej. Równanie na procent uwolnienia, potencjalnie stosowane w analizie chemicznej.
    Ft to intensywność fluorescencji roztworu w danym punkcie czasowym. Fi oraz Fx to odpowiednio znormalizowane początkowa i końcowa intensywność fluorescencji roztworu.

4. Uwalnianie kalceiny z liposomów za pomocą lasera impulsowego

  1. Przenieś 100 µl roztworu liposomów do kuwety kwarcowej i umieść ją w uchwycie na kuwetę. Jako źródło światła zastosuj impulsowy laser Nd:YAG o czasie trwania impulsu 6 nsec i długości fali 532 nm. Użyj następujących parametrów lasera — Częstotliwość repetycji: 1 Hz; Gęstość energii lasera: 1 mJ/cm2; Średnica wiązki: 0.5 mm.
  2. Kieruj skolimowaną wiązkę lasera przez kuwetę w taki sposób, aby światło przechodziło przez roztwór liposomów, a następnie pobieraj aliquoty po określonej liczbie impulsów.
  3. Do 2 ml aliquoty roztworu liposomalnego dodaj 10 µl 2% Triton X-100, aby przeprowadzić trawienie liposomów przez 10 min w RT i uzyskać całkowite uwolnienie kalceiny.
  4. Biorąc pod uwagę, że kalceina jest wrażliwa na światło i może ulec fotowybieleniu podczas eksperymentu laserowego, zmierz wcześniej efekt wybielania wywołany przez laser impulsowy w roztworze kalceiny, aby znormalizować dane dotyczące uwalniania z liposomów.
    1. W szczególności poddaj roztwór kalceiny (60 mM) działaniu lasera impulsowego o częstotliwości 1 Hz dla różnych liczb impulsów (0, 25, 50 i 100). Zmierz intensywność fluorescencji kalceiny przy długościach fal wzbudzenia 480 nm i emisji 515 nm odpowiednio przed i po naświetlaniu laserowym.
    2. Oblicz stopień wybielenia (intensywność fluorescencji kalceiny przed naświetlaniem laserowym / intensywność fluorescencji kalceiny po określonej liczbie impulsów). Wykorzystaj ten współczynnik do normalizacji wartości uzyskanych z próbek liposomów, mnożąc intensywność fluorescencji liposomów przez ten współczynnik.
  5. Zmierz intensywność fluorescencji pobranej próbki za pomocą mikroczytnika płytek fluorescencyjnych przy długościach fal wzbudzenia 480 nm i emisji 515 nm.
  6. Przyjmując intensywność fluorescencji próbek traktowanych Triton X-100 jako 100% uwalniania, oblicz procent uwolnionej kalceiny dla każdej liczby impulsów, korzystając ze wzoru:
    Wzór równowagi statycznej. Równanie na procent uwalniania, potencjalnie stosowane w analizie chemicznej.
    Ft to intensywność fluorescencji roztworu dla danej liczby impulsów po normalizacji. Fi i Fx to odpowiednio znormalizowane początkowa i końcowa intensywność fluorescencji roztworu.

5. Pomiar impulsów ciśnienia

  1. Nanieś 100 µl próbki na szkiełko mikroskopowe i ustaw ostrość lasera na próbce.
  2. Zanurz hydrofon igłowy (średnica 1 mm i czułość 450 nV/Pa) w roztworze.
    Uwaga: Hydrofon nie może być naświetlany światłem lasera, aby uniknąć uszkodzenia.
  3. Naświetl próbkę impulsem lasera, stosując różną liczbę impulsów (0-100) oraz energię impulsu (20-160 µJ/pulse).
  4. Zarejestruj sygnały ciśnienia za pomocą oscyloskopu cyfrowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Liposomy przygotowano przy użyciu konwencjonalnej techniki hydratacji cienkiej warstwy z DPPC, MPPC i DSPE-PEG2000 w stosunku molowym 86:10:4 lub stężeniach 7,95:0,65:1,39 mg/ml.12 Rozmiar nanocząsteczek Au (Au NPs) ma kluczowe znaczenie dla określenia wydajności konwersji światła na ciepło podczas następnego eksperymentu z wzbudzeniem laserowym. Im mniejszy rozmiar Au NPs, tym wyższa wydajność transdukcji.13 W związku z tym do enkapsulacji wybrano 5 nm Au NPs, będąc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hydratacja cienkowarstwowa to konwencjonalna metoda przygotowania liposomów. Rozpuszczalniki organiczne (w tym przypadku chloroform) najpierw użyto do rozpuszczenia lipidów, a następnie usunięto je w wyparce obrotowej w temperaturze 37 °C w celu wytworzenia cienkiego filmu lipidowego na kolbie. Ten film lipidowy uwodniono roztworem wodnym zawierającym 60 mM kalceiny i 5 nm Au NPs. Podczas procesu hydratacji temperatura była utrzymywana na poziomie około 50 °C, a kolba była stale mieszana poprzez obracanie kolby. Kluczowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Fundusze Badań Akademickich Tier-1 Ministerstwa Edukacji Singapuru (RG 64/12 do CX) oraz NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)850355PProszek, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
1-palmitoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (MPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)855675PProszek, przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)880120PProszek, przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
Nanocząstki złotaSigma Aldrich752568-100mL5  cząstki nm, stabilizowane na poziomie 0,1  mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60  mM, pH 7,4 (skorygowane za pomocą NaOH)
fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Sigma AldrichP54930,1 mM, pH 7,4
Woda podwójnie destylowanaSystem
Triton X100   Sigma, Nauki PrzyrodniczeX-100Aby zakłócić liposomy w celu obliczenia całkowitej enkapsulacji
Rotavapor   Buchi (Szwajcaria)R 210Używany do przygotowania lipososmu
Kąpiel grzewczaBuchi (Szwajcaria)B 491Używany do przygotowania lipososmu
Regulator próżni   Buchi (Szwajcaria)V-850Używany do przygotowania lipososmu
Pompa próżniowaBuchi (Szwajcaria)V-700Używany do przygotowania lipososmu
Kąpiel recyrkulacyjna z regulatorem temperaturyPolyscienceUżywany do przygotowania lipososmu
Zespół mini-ekstrudera z blokiem grzewczym Avanti Polar Lipids (Alabama, USA)610000Używany do wytłaczania
strzykawek liposomów, 1,000 i #956; lAvanti Polar Lipids (Alabama, USA 610017Służy do wytłaczania liposomów
Membrana filtracyjna z poliwęglanu, 200  nmWhatmann800281Służy do wytłaczania liposomów
Wsparcie filtraAvanti Polar Lipids (Alabama, USA)610014Służy do wytłaczania liposomów
PD 10 Odsalanie kulumów, Sephadex G-25 mediumGE Healthcare, Nauki przyrodnicze17-0851-01Służy do oczyszczania liposomów
Wirówka   Wirówki laboratoryjne Sigma3K30Służy do zagęszczania roztworu liposomalnego 
RotorSigma19777-HSłuży do zagęszczania roztworu liposomalnego 
Zetasizer   Nano ZS MalvernSłuży do oznaczania wielkości liposomów i potencjału zetapotencjału
Spektrofotometr UV-VisibleShimadzuUV-2450Służy do pomiaru absorbancji próbek
Spektrofluorometr fluorescencyjny   Urządzenia molekularneSpectraMax M5Służy do pomiaru emisji fluorescencji próbek
Nd:YAG LaserNewWave Research532 nm; Moc maksymalna: 17  Mj; Szerokość: 406  Nsec; Służy do naświetlania próbki
Hydrofon HNRONDAHNR-1000o średnicy 1 mm i czułości 450 nV/Pa, Właściwy zakres częstotliwości pracy: 0,25-10  Mhz; Kalibracja: 50  mV/bar; Służy do pomiaru sygnałów akustycznych
Oscyloskop cyfrowyLECORY - Wave Runner 64Xi-ACzęstotliwość: 600 MHz; Maksymalna częstotliwość próbkowania: 10  Gs/s (na dwóch kanałach); Służy do nagrywania mierzonych sygnałów akustycznych
sól oczyszczania wody Millipore Milli-DI

Bibliografia

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796(2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza liposom wnanocz stki foto responsywneuwalnianie kalceinypomiar fluorescencjidetekcja hydrofonemekstruzja liposom wstymulacja temperaturowa
Synteza zintegrowanych z nanocząstkami złota liposomów reagujących na światło i pomiar ich kawitacji mikropęcherzyków po wzbudzeniu laserem impulsowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.