Artykuł metodologiczny

DamID-seq: Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów DNA metylowanych adeniną

DOI:

10.3791/53620

⸱

27 stycznia 2016

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj test polegający na sprzężeniu identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (DamID-seq). Ta ulepszona metoda zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki oraz umożliwia analizowanie danych DamID-seq w połączeniu z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq, RNA-seq itp.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) jest potężną metodą wykrywania interakcji białko-DNA zarówno lokalnie, jak i w całym genomie. Jest to alternatywne podejście do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP). Wyrażone białko fuzyjne składające się z białka będącego przedmiotem zainteresowania i metylotransferazy adeninowej DNA E. coli może metylować zasadę adeninową w motywach GATC w pobliżu miejsc interakcji białko-DNA. Fragmenty DNA metylowane adeniną mogą być następnie specyficznie amplifikowane i wykrywane. Oryginalny test DamID wykrywa lokalizacje genomowe metylowanych fragmentów DNA poprzez hybrydyzację z mikromacierzami DNA, co jest ograniczone dostępnością mikromacierzy i gęstością z góry określonych sond. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół integracji wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA z DamID (DamID-seq). Duża liczba krótkich odczytów generowanych przez DamID-seq umożliwia wykrywanie i lokalizowanie interakcji białko-DNA w całym genomie z wysoką precyzją i czułością. Użyliśmy testu DamID-seq do badania interakcji genom-blaszka jądrowa (NL) w komórkach ssaków i zauważyliśmy, że DamID-seq zapewnia wysoką rozdzielczość i szeroki zakres dynamiki w wykrywaniu interakcji genom-NL. Podejście opracowane w ramach projektu DamID-seq umożliwia badanie asocjacji NL w strukturach genów i umożliwia porównywanie map interakcji genom-NL z innymi funkcjonalnymi danymi genomowymi, takimi jak ChIP-seq i RNA-seq.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) 1,2 jest metodą wykrywania interakcji białko-DNA in vivo i stanowi alternatywne podejście do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) 3. Wykorzystuje stosunkowo niewielką liczbę komórek i nie wymaga chemicznego sieciowania białka z DNA lub wysoce specyficznym przeciwciałem. To ostatnie jest szczególnie pomocne, gdy białko docelowe jest luźno lub pośrednio związane z DNA. Projekt DamID został z powodzeniem wykorzystany do mapowania miejsc wiązania różnych białek, w tym białek otoczki jądrowej 4-10, białek związanych z chromatyną 11-13, enzymów modyfikujących chromatynę 14, czynników transkrypcyjnych i kofaktorów15-18 oraz maszynerii RNAi 19. Metoda ma zastosowanie w wielu organizmach, w tym S. cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22, a także w liniach komórkowych myszy i człowieka 6,8,10,23,24.

Rozwój testu DamID opierał się na specyficznym wykrywaniu fragmentów DNA metylowanych adeniną w komórkach eukariotycznych, które nie mają endogennej metylacji adeniny 2. Ekspresja białka fuzyjnego, składającego się z białka wiążącego DNA i metylotransferazy adeninowej DNA E. coli (Dam), może metylować zasadę adeninową w sekwencjach GATC, które znajdują się w przestrzennej bliskości (najbardziej znacząco w zakresie 1 kb i do około 5 kb) do miejsc wiązania białka w genomie 2. Zmodyfikowane fragmenty DNA mogą być specyficznie amplifikowane i hybrydyzowane do mikromacierzy w celu wykrycia genomowych miejsc wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania 1,25,26. Ta pierwotna metoda DamID była ograniczona dostępnością mikromacierzy i gęstością z góry określonych sond. W związku z tym zintegrowaliśmy sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości z DamID 10 i oznaczyliśmy metodę jako DamID-seq. Duża liczba krótkich odczytów generowanych przez DamID-seq umożliwia precyzyjną lokalizację interakcji białko-DNA w całym genomie. Stwierdziliśmy, że DamID-seq zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki niż DamID za pomocą mikromacierzy do badania asocjacji genom-blaszka jądrowa (NL) 10. Ta ulepszona metoda umożliwia sondowanie asocjacji NL w strukturach genów 10 i ułatwia porównania z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq i RNA-seq.

Opisany tutaj protokół DamID-seq został początkowo opracowany do mapowania asocjacji genomu-NL 10. Wygenerowaliśmy białko fuzyjne poprzez przywiązanie mysiej lub ludzkiej laminy B1 do metylotransferazy adeninowej DNA E. coli i przetestowaliśmy protokół na mysich fibroblastach embrionalnych 3T3, mysich mioblastach C2C12 10 i ludzkich płodowych fibroblastach płuc IMR90 (dane nieopublikowane). W tym protokole zaczynamy od konstruowania wektorów i ekspresji białek fuzyjnych na uwięzi Dam przez infekcję lentiwirusową w komórkach ssaków 24. Następnie opisujemy szczegółowe protokoły amplifikacji fragmentów DNA metylowanych adeniną i przygotowania bibliotek sekwencjonowania, które powinny mieć zastosowanie w innych organizmach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie i ekspresja białek fuzyjnych i wolnych białek matek

  1. Sklonować interesujące białko do wektora DamID.
    1. Amplifikuj cDNA białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) przy użyciu pożądanej polimerazy DNA o wysokiej wierności i odpowiednich starterów zgodnie z protokołem producenta. Eksperymentalnie określ optymalne warunki amplifikacji, aby zapewnić prawidłowe wzmocnienie wkładek.
    2. Uruchom żel agarozowy i oczyść amplifikowane cDNA z POI za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
    3. Sklonować cDNA POI do wektora pDONR201 za pomocą klonazy BP II zgodnie z protokołem producenta.
    4. Sklonuj cDNA POI z wektora dawcy do wektora docelowego pLGW-RFC1-V5-EcoDam lub wektora docelowego pLGW-EcoDam-V5-RFC1 27 za pomocą LR Clonase II zgodnie z protokołem producenta, w zależności od pożądanego kierunku fuzji POI z N-końcem lub C-końcem metylotransferazy adeninowej DNA E. coli (EcoDam) 27.
    5. Sprawdź, sekwencjonując, czy sklonowane cDNA ma prawidłową sekwencję i tworzy fuzję w ramce z EcoDam.
  2. Generowanie zapasów lentiwirusów.
    1. Generowanie stad lentiwirusowych wykazujących ekspresję Dam-V5-POI i V5-Dam (z wektora pLGW-V5-EcoDam 27) przy użyciu systemów ekspresji lentiwirusów. Postępuj zgodnie z procedurą transfekcji do przodu zgodnie z protokołem producenta.
      1. Użyj komórek 293T i lipofekcji do wygenerowania zapasów lentiwirusa zgodnie z protokołem transfekcji producenta.
      2. Dołącz stopień filtra PVDF 0,45 μm.
  3. Zainfekuj komórki lentiwirusem.
    1. Dzień przed zakażeniem (dzień 0) należy przekazać przylegające komórki hodowane w pożywce odpowiedniej dla tego typu komórek do 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej przy użyciu tej samej pożywki wzrostowej bez antybiotyków, aby osiągnąć 50% zbieżność w dniu zakażenia. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. W dniu zakażenia (dzień 1) należy wyjąć 2 kriowiale supernatantów lentiwirusowych Dam-V5-POI i V5-Dam z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrożenia.
      1. Usuń pożywkę wzrostową z komórek i zastąp ją 0,5 ml świeżej pożywki wzrostowej bez antybiotyków.
      2. Dodać 1 ml rozmrożonego lentiwirusa do każdej studzienki (2 studzienki z V5-Dam i 2 studzienki z Dam-V5-POI). Dodaj 1 ml pożywki wzrostowej bez antybiotyków do pozostałych 2 studzienek - posłuży to jako kontrola negatywna. Delikatnie wstrząsnąć płytką 6-dołkową, aby wymieszać i umieścić z powrotem w inkubatorze O/N o temperaturze 37 °C.
    3. Dzień po zakażeniu (dzień 2) usunąć zawiesiny wirusa z komórek i zastąpić je 2 ml pożywki wzrostowej bez antybiotyków. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 48 godzin.
  4. Wyizoluj gDNA.
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki i odłączyć komórki za pomocą 250 μl 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
    2. Zmyć komórki z płytki za pomocą 1 ml pożywki wzrostowej i pipetować komórki z każdego dołka do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Komórki osadu przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przemyć granulowane komórki 500 μl PBS i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Zawiesić granulowane komórki w 200 μl PBS.
    5. Wyizoluj gDNA za pomocą zestawu krwi i tkanek zgodnie z protokołem producenta. Eluować gDNA w buforze AE o pojemności 200 μl i oznaczyć stężenie, mierząc OD260 za pomocą spektrofotometru.
      Uwaga: gDNA z niezakażonych lub pozorowanych zakażonych komórek można wyizolować jako kontrolę negatywną. Wytrącić gDNA do wyższych stężeń w celu długotrwałego przechowywania.
      1. Dodaj 3 objętości 100% etanolu i 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,5) i wymieszaj, odwracając probówki 4-6 razy.
      2. Przechowywać w temperaturze -20 °C O/N.
      3. Wirować przy 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Ostrożnie usunąć supernatant. Płucz granulki etanolem o stężeniu 70% (objętość/objętość) i odwirowuj przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Ostrożnie usuń etanol i pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
      6. Rozpuścić gDNA w T10E0,1 (pH 7,5) do około 1 μg/μl. Zebrać gDNA z każdej próbki doświadczalnej lub kontroli ujemnej i zmierzyć stężenie. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Amplifikacja fragmentów DNA metylowanych adeniną

  1. Trawi gDNA za pomocą DpnI, który tnie tylko GATC metylowane adeniną.
    1. Ustaw reakcję na lodzie z 2,5 μg gDNA, 1 μl 10x buforu, 0,5 μl DpnI (20 U/μl) i wypełnij H2O do całkowitej objętości 10 μl. Dla każdej próbki gDNA należy przygotować trzy reakcje — jedną bez DpnI ("no DpnI"), zastąpić DpnI 0,5 μlH2O) i dwie z DpnI ("z DpnI").
    2. Wytrawić O/N w temperaturze 37 °C i dezaktywować DpnI w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
  2. Adaptery Ligate DamID.
    1. Przygotuj adaptery DamID.
      1. Zawiesić ponownie każdy z dwóch łączników DamID 24 w H2O do końcowego stężenia 100 μM.
      2. Połączyć równe objętości dwóch oligonukleotyków adaptera DamID, wymieszać i umieścić w szczelnie zamkniętej tubie. Uszczelnić probówkę folią Parafilm, umieścić ją na stojaku i umieścić w zlewce wypełnionej wodą o temperaturze 90 °C. Utrzymywać poziom wody poniżej nakrętki probówki (aby zapobiec przedostawaniu się wody do probówki), ale powyżej powierzchni mieszanki oligocytów.
      3. Pozwól wodzie ostygnąć do temperatury RT, aby adaptery wyżarzały się powoli.
      4. Podzielić na części wyżarzane adaptery (50 μM) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Ustaw reakcję na lodzie. Do każdej probówki z ppkt 2.1.2 dodać 6,2 μlH2O, 2 μl buforu do ligacji 10x, 0,8 μl adapterów DamID 50 μM (rozmrożonych na lodzie) i 1 μl ligazy DNA T4 (5 U/μl). Całkowita objętość wynosi 20 μl. W jednej z dwóch probówek "z DpnI" zastąp ligazę 1 μlH2O("bez ligazy"). Należy zauważyć, że każda próbka gDNA ma dwie kontrole ujemne - " brak DpnI " i " brak ligazy".
    3. Związać O/N w temperaturze 16 °C i dezaktywować ligazę w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
  3. Trawić DNA za pomocą DpnII, aby zniszczyć fragmenty zawierające niemetylowane GATC.
    1. Ustaw reakcję na lodzie. Do każdej probówki z ppkt 2.2.3 dodać 24 μlH2O, 5 μl buforu 10x DpnII i 1 μl DpnII (10 U/μl). Całkowita objętość wynosi 50 μl.
    2. Trawić w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny i dezaktywować DpnII w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
  4. Amplifikacja fragmentów DNA metylowanych adeniną.
    1. Przygotuj reakcję na lodzie z 5 μl trawienia DpnII z 2.3.2, 5 μl 10x buforu PCR, 12,5 μl 5 μM startera DamID PCR 24, 4 μl 10 mM mieszanki dNTP, 1 μl 50x mieszaniny polimerazy i 22,5 μl H2O. Całkowita objętość wynosi 50 μl.
    2. Uruchomić PCR w następujący sposób: 68 °C przez 10 min; 94 °C przez 1 min, 65 °C przez 5 min, 68 °C przez 15 min; 4 cykle po 94 °C przez 1 min, 65 °C przez 1 min, 68 °C przez 10 min; 17 cykli po 94 °C przez 1 min, 65 °C przez 1 min, 68 °C przez 2 min.
    3. Przeanalizuj 5 μl produktów PCR z każdej reakcji na 1% żelu agarozowym. Produkty PCR powinny pojawiać się jako rozmaz w zakresie od 0,2 do 2 kb (ryc. 2). Kontrole "bez DpnI" i "bez ligazy" powinny nie mieć wzmocnienia lub powinny być wyraźnie mniejsze.
    4. Jeżeli wynik z etapu 2.4.3 jest zadowalający, należy powtórzyć kroki 2.4.1-2.4.3 z dwiema lub trzema reakcjami dla próbki doświadczalnej i jedną reakcją dla każdej z dwóch kontroli ujemnych.
    5. Połącz i oczyść produkty PCR z tej samej próbki eksperymentalnej za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek odwracalnej immobilizacji w fazie stałej (SPRI) zgodnie z protokołem producenta. Nie oczyszczaj kontroli "bez DpnI" lub "bez ligazy". Elute DNA za pomocą buforu EB.
    6. Zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA, mierząc OD260 za pomocą spektrofotometru, które powinno wynosić około 0,1 μg/μl lub więcej. Pobrać co najmniej 10 μg DNA dla każdej próbki. W przypadku korzystania z zestawów do oczyszczania PCR, należy oczyścić każde 50 μl produktów PCR za pomocą jednej kolumny, wymyć w 30 μl buforu EB i połączyć eluaty.
  5. Trawić DNA za pomocą DpnII, aby zapobiec sekwencjonowaniu starterów DamID PCR.
    1. Przeprowadzić reakcję na lodzie z 5 μg oczyszczonego DNA z 2.4.6, 5 μl 10x buforu DpnII, 1 μl DpnII (10 U/μl) i wypełnićH2Odo całkowitej objętości 50 μl. Przygotować dwie lub trzy reakcje dla każdej próbki.
    2. Trawić w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny i dezaktywować DpnII w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
    3. Zebrać i oczyścić strawy z tej samej próbki za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek SPRI zgodnie z protokołem producenta. Elute DNA za pomocą buforu EB.
    4. Zmierz stężenie oczyszczonego DNA, które powinno wynosić około 0,06 μg/μl lub więcej. Pobrać co najmniej 6 μg DNA z każdej próbki. W przypadku stosowania zestawów do oczyszczania PCR, należy oczyścić każde 50 μl roztworu trawiącego za pomocą jednej kolumny, wymyć w 30 μl buforu EB i połączyć eluaty.

3. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

  1. Fragment DNA
    1. Eksperymentalnie określ odpowiedni czas trawienia dla każdej nowej partii fragmentazy dsDNA. Ponieważ aktywność enzymu może z czasem spadać, powtórz test przed wykonaniem nowego eksperymentu. Aby zachować DNA z 2.5.4 do rzeczywistej fragmentacji, na tym etapie należy użyć oczyszczonych produktów metylowego PCR z 2.4.6 lub dodatkowego DNA z poprzednich eksperymentów.
      1. Przygotuj mieszankę wzorcową z 6 μg DNA, 12 μl 10x buforem fragmentazy i wypełnijH2Odo całkowitej objętości 114 μl.
      2. Wirować fiolkę z preparatem Fragmentaza przez 3 sekundy, dodać 6 μl do mieszanki wzorcowej i mieszać mieszankę główną przez 3 sekundy. Całkowita objętość wynosi 120 μl.
      3. Porcję 20 μl mieszanki wzorcowej do każdej z 5 nowych probówek. Inkubować wszystkie 6 probówek w temperaturze 37 °C przez 5–55 minut z dokładnością co 10 minut. Dodać 5 μl 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję.
      4. Przeanalizuj 12,5 μl trawienia (0,5 μg DNA) każdej reakcji, a także 0,5 μg niestrawionego DNA na żelu agarozowym (ryc. 3). Określ minimalny czas (T0,2 kb) potrzebny do strawienia większości rozmazu do około 0,2 kb. Wybierz 6 czasów trwania od 5 min do T0.2kb (w tym 5 min i T0.2kb) z równymi przyrostami dla rzeczywistej fragmentacji.
    2. Skonfiguruj rzeczywistą fragmentację zgodnie z opisem w sekcjach 3.1.1.1-3.1.1.3. Reakcje inkubować w temperaturze 37 °C przez czas określony w ppkt 3.1.1.4.
    3. Pula 6 reakcji i oczyść strawy za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek SPRI zgodnie z protokołem producenta. Eluować DNA w buforze 51 μl EB. Końcowy eluat wynosi ~50 μl.
  2. Naprawa końców rozdrobnionego DNA
    1. Ustawić reakcję na lodzie z eluatem z 3.1.3, 25 μlH2O, 10 μl 10x bufor ligazy DNA T4 z 10 mM ATP, 4 μl 10 mM mieszanina dNTP, 5 μl polimerazy DNA T4 (3 U/μl), 1 μl polimerazy DNA Klenowa (5 U/μl), i 5 μl kinazy polinukleotydowej T4. Całkowita objętość wynosi 100 μl. Dobrze wymieszać pipetą. Unikaj piany i bąbelków.
    2. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 min.
    3. Oczyść DNA za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek SPRI zgodnie z protokołem producenta. Eluować DNA w 33 μl buforze EB. Końcowy eluat wynosi ~32 μl.
  3. Dodawanie zwisów "A"
    1. Przeprowadzić reakcję na lodzie z eluatem z 3.2.3, 5 μl 10x bufor Klenowa, 10 μl 1 mM dNTP i 3 μl Klenowa (3'→5' egzo-) (5 U/μl). Całkowita objętość wynosi 50 μl. Dobrze wymieszać pipetą. Unikaj piany i bąbelków.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    3. Oczyść DNA za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek SPRI zgodnie z protokołem producenta. Eluować DNA w 22 μl buforze EB. Końcowy eluat wynosi ~21 μl.
  4. Adaptery do sekwencjonowania Ligate
    1. Przygotuj adaptery sekwencjonowania 28.
      1. Zawiesić każdy oligo adaptora do stężenia 100 μM w 10 mM Tris-Cl (pH 7,8), 0,1 mM EDTA (pH 8,0) i 50 mM NaCl.
      2. Wymieszaj równe objętości adaptera uniwersalnego 28 i adaptera indeksowanego 28.
      3. Wyżarzać adaptery w termocyklerze w następującym programie: 95 °C przez 2 minuty; 140 cykli przez 30 sekund, zaczynając od 95 °C i zmniejszając o 0,5 °C co cykl; przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
      4. Adaptery do porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Ustawić reakcję na lodzie z eluatem z 3.3.3, 25 μl buforu do ligacji 2x, 1,5 μl 50 μM wyżarzonymi adapterami sekwencjonowania (rozmrożonymi na lodzie) z 3.4.1.4 i 2,5 μl ligazy DNA T4. Dobrze wymieszać pipetą. Unikaj piany i bąbelków. Jeśli wymagane jest sekwencjonowanie multipleksowe, należy użyć innego adaptera indeksowanego dla każdej próbki.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Oczyść DNA za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek SPRI zgodnie z protokołem producenta. Eluować DNA w buforze 24 μl EB. Końcowy eluat wynosi ~23 μl.
  5. Zamień adaptery w kształcie litery Y na dsDNA, aby umożliwić dokładne określenie rozmiarów fragmentów DNA 28
    1. Przeprowadzić reakcję na lodzie z eluatem z 3.4.4, 12,5 μl H2O, 1 μl 25 μM starter 1 28, 1 μl 25 μM starter 2 28, 1,5 μl 10 mM dNTP, 10 μl 5x bufor PCR i 1 μl polimerazy DNA (1 U/μl).
    2. Uruchom PCR w następujący sposób: 95 °C przez 3 minuty; 5 cykli po 98 °C przez 15 sekund, 63 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund; 72 °C przez 1 minutę; 4 °C wstrzymane.
    3. Oczyść DNA za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek SPRI zgodnie z protokołem producenta. Eluować DNA w 11 μl buforu EB. Końcowy eluat wynosi ~10 μl.
  6. Rozmiar, wybierz bibliotekę
    1. Przygotuj 2% żel agarozowy z 1x buforem TAE. Dodać bromek etydyny (UWAGA!) do końcowego stężenia 500 ng/ml, gdy stopiony roztwór TAE-agarozy ostygnie, aby uniknąć wdychania bromku etydyny. Upewnij się, że masz wystarczająco dużo pasów dla wszystkich próbek, drabiny DNA i pustych pasów.
    2. Dodać 8 μl 6x ładującego barwnika do eluatu z 3.5.3.
    3. Przygotować drabinkę DNA, mieszając 1 kb plus drabinkę DNA (1,0 μg/μl), 6x barwnik ładujący i H2O w stosunku 1:1:4.
    4. Załadować drabinkę o pojemności 6 μl DNA, próbki z ppkt 3.6.2 i kolejną drabinkę DNA o pojemności 6 μl, z których każda znajduje się na oddzielnym torze i z co najmniej jednym pustym pasem z sąsiednich próbek/drabinek.
    5. Uruchom żel pod napięciem 120 V przez 60 minut.
    6. Zobacz żel na transiluminatorze UV (zminimalizuj czas ekspozycji na promieniowanie UV). Nosić okulary ochronne i osłonę twarzy. Upewnij się, że co najmniej jedna z drabinek DNA przebiega dobrze z odpowiednimi odstępami (wystarczającymi do wycięcia 3 plastrów żelu) między pasmami od 300 pz do 400 pz. Wąskie odstępy zwiększają trudności w wycinaniu wielu plastrów żelu, podczas gdy szerokie odstępy zwiększają objętość wycinanych plastrów żelu.
    7. Użyj nowego skalpela lub żyletki dla każdej alei. Wyciąć trzy cienkie plasterki żelu o objętości od 300 do 400 pz z każdego pasa (rysunek 4) i umieścić je w probówce do mikrowirówki. Utrzymuj objętość każdego plastra żelu na jak najniższym poziomie (< 100 μl).
    8. Zmierzyć objętość każdej cząstki żelu (1 μl żelu waży około 1 mg), dodać 6 razy więcej objętości buforu QG i inkubować w temperaturze 50 °C.
    9. Mieszaj mieszaninę żelu QG co 2-3 minuty, aż plasterek żelu całkowicie się rozpuści. Dodaj 2x objętości żelu izopropanolu i wymieszaj.
    10. Od tego kroku postępuj zgodnie z protokołem z zestawów do ekstrakcji żelu. Eluować DNA w buforze 51 μl EB. Końcowy eluat wynosi ~50 μl.
  7. Wzbogacenie zmodyfikowanych fragmentów DNA za pomocą adaptora sekwencjonowania
    1. Zoptymalizuj liczbę cykli PCR 29.
      1. Przeprowadzić reakcję na lodzie za pomocą 1 μl eluatu z 3.6.10, 1 μl 25 μM startera 1 28, 1 μl 25 μM startera 2 28, 7 μl H2O i 10 μl SYBR Green Supermix. Całkowita objętość wynosi 20 μl.
      2. Uruchomić qPCR w następujący sposób: 95 °C przez 3 minuty; 20 cykli 95 °C przez 30 sekund, 63 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund, odczyt na płytce.
      3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy qPCR i określ cykl kwantyfikacji (Cq) lub cykl progowy (Ct) dla każdej próbki przy użyciu protokołu producenta. Kontynuuj z próbkami, które mają Cq/Ct ≤ 14. Użyj maksymalnej wartości Cq (Cq0) minus 1 (zaokrąglonej w górę do następnej wyższej liczby całkowitej) jako końcowego numeru cyklu PCR (NPCR).
      4. Dostosuj ilość matryc DNA tak, aby różne próbki były amplifikowane do mniej więcej równych ilości po przeprowadzeniu tej samej liczby cykli PCR. Dla próbki o najwyższym Cq (Cq0) należy użyć matrycy o objętości 8 μl i obliczyć objętość matrycy innych próbek za pomocą następującego wzoru:
        Tomi = 8 x 1,8Cq i-Cq 0
    2. Ustawić reakcje PCR na lodzie z objętościami matrycy obliczonymi z 3.7.1.4: 1 μl 25 μM starter 1 28, 1 μl 25 μM starter 2 28, 1,5 μl 10 mM dNTP, 10 μl 5x bufor, 1 μl polimerazy DNA (1 U/μl) i wypełnić H2O do całkowitej objętości 50 μl.
    3. Uruchom PCR w następujący sposób: 95 °C przez 45 sekund; N cykliPCR (oznaczone w ppkt 3.7.1.3) w temperaturze 98 °C przez 15 sekund, 63 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund; 72 °C przez 1 min; 4 °C w stanie wstrzymania.
    4. Przeanalizuj 5 μl produktów PCR w 2% żelu agarozowym (ryc. 5A). Wyraźne "pojedyncze" prążki wskazują, że amplifikowane fragmenty DNA znajdują się w wąskim zakresie długości i że biblioteka DNA może być poddana dalszej analizie.
    5. Powtórz jedną reakcję dla wybranych próbek i połącz amplifikowane biblioteki DNA z tej samej próbki.
    6. Oczyść wybrane biblioteki DNA do sekwencjonowania.
      1. Jeśli dimery startera/adaptera nie są widoczne w 3.7.4, należy oczyścić biblioteki DNA za pomocą zestawów do oczyszczania PCR lub kulek SPRI zgodnie z protokołem producenta. Elutować DNA w 21 μl buforze EB. Końcowy eluat wynosi ~20 μl. Jeśli urządzenie do sekwencjonowania użytkownika posiada szczegółowe instrukcje dotyczące buforu elucyjnego, końcowej objętości itp., należy odpowiednio przygotować próbki.
      2. Jeśli dimery starterów/adapterów są wyraźnie widoczne w 3.7.4, wyczyść biblioteki w następujący sposób.
        1. Załaduj DNA z 3.7.5 i drabinkę DNA w 2% prefabrykowanym żelu agarozowym. Próbki mogą być oczyszczane zgodnie z opisem w ppkt 3.7.6.1 w celu zmniejszenia objętości lub mogą być ładowane do wielu studzienek. Umieść żel agarozowy w odpowiednim systemie zasilania. Pozostaw żel na 15 minut.
        2. Za pomocą odpowiedniego transiluminatora wytnij żądane pasmo czystym skalpelem/brzytwą dla każdej próbki i umieść plasterek żelu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
        3. Wyizolować DNA za pomocą zestawów do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta z dwiema modyfikacjami: inkubować mieszaninę buforu QG i żelu w termomikserze w temperaturze 37 °C i 1 000 obr./min przez 30 minut i dodać 2 objętości żelu izopropanolu.
  8. Prześlij oczyszczone biblioteki DNA do zakładu sekwencjonowania. Postępuj zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi obiektu.
    Uwaga: Przed sekwencjonowaniem należy przeprowadzić analizę jakości za pomocą bioanalizatora (ryc. 5B) w celu określenia dokładnego zakresu wielkości i stężenia biblioteki DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zweryfikowano, że białko fuzyjne Dam-V5-LmnB1 jest kolokalizowane z endogennym białkiem Laminy B przez barwienie immunofluorescencyjne (Rysunek 1).

Udana amplifikacja PCR fragmentów DNA metylowanych adeniną jest kluczowym krokiem dla DamID-seq. Próbki doświadczalne powinny amplifikować rozmaz 0,2 - 2 kb, podczas gdy kontrole ujemne (bez DpnI, bez ligazy lub bez matrycy PCR) powinny skutkować brakiem lub wyraźnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To, czy białka znakowane przez Dam zachowują funkcje białek endogennych, powinno zostać zbadane przed eksperymentem DamID-seq. Należy zawsze określić subkomórkową lokalizację białek otoczki jądrowej znakowanych zaporą i porównać ją z lokalizacją białek endogennych. W celu zbadania czynników transkrypcyjnych sugeruje się zbadanie, czy białko fuzyjne Dam może uratować funkcje endogennego białka w regulacji ekspresji genów. Ten test funkcjonalny można przeprowadzić w organizmach, w których dostępne są mutanty nokautujące en...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Basowi van Steenselowi za dostarczenie wektorów ekspresji ssaków DamID. Dziękujemy Yale Center for Genome Analysis oraz Genomics Core w Yale Stem Cell Center za porady dotyczące przygotowania bibliotek NGS i wdrożenia wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA. Prace te były wspierane przez fundusze start-upu z Yale School of Medicine, grant na rozwój naukowców z American Heart Association (12SDG11630031) oraz grant zalążkowy z Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ViraPower Lentiviral Expression SystemsLife TechnologiesK4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 i K371-20
Brama BP Clonase II Enzyme MixLife Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme MixLife Technologies11791-020
DNeasy Blood & Zestaw chusteczek higienicznych (250)QIAGEN69506 lub 69504   
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
Komórki 293TKolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-11268
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaLife Technologies25300-054
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianLife Technologies11995-065
Surowica bydlęcapłodu SigmaF4135
Tris Markanie jest krytyczna
EDTAjest krytyczna Marka
200 Proof EtOHnie jest krytyczna
Marka izopropanolunie jest krytyczna
Marka octanunie jest krytyczna
DpnINew England BiolabsR0176dostarczany z adapterami buforowymi
DamID "AdRt" i "AdRb"Zintegrowane sekwencje DNA Technologiesdostępne w ref. 24; brak fosforylacji końca 5' lub 3', aby zapobiec samoligatacji.
Ligaza DNA T4Roche Life Science10481220001dostarczana z buforem
DpnIINew England BiolabsR0543dostarczany z buforem
startera DamID PCR "AdR_PCR"Zintegrowane sekwencje DNA Technologiesdostępne w ref. 24
Zestaw roztworów deoksynukleotydów (dNTP)New England BiolabsN0446po 100 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP
Zaleta 2  Polymerase MixClontech639201dostarczany z buforem
1Kb Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 i mikro; g/&mikro; l
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQIAGEN28104 lub 28106
Zestaw do oczyszczania MinElute PCRQIAGEN28004 lub 28006dla objętości elucji mniejszej niż 30 &mikro; l
Koraliki SPRI / Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880zastosuj dodatkowe mieszanie i dłuższy czas elucji, jeśli jest mniejszy niż 40 &mikro; l Używany jest bufor elucyjny
Bufor EBQIAGEN19086
NEBNext dsDNA FragmentazaNew England BiolabsM0348dostarczany z buforem
T4 DNA Ligaza Reakcyjna BuforNew England BiolabsB0202
T4 DNA PolimerazaNew England BiolabsM0203
Polimeraza DNA I, duży (Klenow) FragmentNew England BiolabsM0210
T4 Kinaza polynuleotydowaNew England BiolabsM0201
Fragment Klenowa (3' → 5' egzo-)New England BiolabsM0212dostarczany z
adapterami do sekwencjonowaniaDNA Technologiesdostępne w ref. 28
Zestaw do szybkiego ligowaniaNew England BiolabsM2200stosowane w ppkt 3.4.3; dostarczany z buforem reakcyjnym szybkiej ligacji i starterem do sekwencjonowania ligazy DNA Quick T4
i 2sekwencjami Integrated DNA Technologiesdostępnymi w ref. 28
Zestaw KAPA HiFi PCRKapa BiosystemsKK2101 lub KK2102dostarczany z polimerazą DNA KAPA HiFi, 5x buforem KAPA HiFi Fidelity i mieszanką agarozy 10 mM dNTP
Sigma AldrichE1510-10ML10 mg / ml
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu QIAGEN28704 lub 28706
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725121 lub 1725122
Marka spektrofotometrunie jest krytyczna
0,45 i #956; m Marka filtraniekrytyczna
Marka 25 ml Seringeniekrytyczna
10 cm Płytki do kultur tkankowych Markaniekrytyczna
6-dołkowe Płytki do kultur tkankowych Markanie jest krytyczna
Termocykler S1000Bio-Rad Laboratories
C1000 Dotykowy termocyklerBio-Rad Laboratoriesdla qPCR
Marka mikseranie jest krytyczna
Marka suchego bloku lub termomikseraMarka
mikrowirówkinie jest krytyczna
System elektroforezy żelowej z marką zasilaczanie jest krytyczny
Stojakmagnetycznydo oczyszczania DNA za pomocą kulek SPRI; powinien pomieścić probówki o pojemności 1,5-2 ml; marka nie jest krytyczna
transiluminatoranie jest krytyczna
System elektroforezy e-żelowejLife TechnologiesG6400, G6500, G6512ST
Marka nie sodu buforowego Zintegrowane sekwencje 1 Bromek etydyny Sigma Aldrich A4679 PVDF Vortex Marka UV marka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21(2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591(2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028(2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399(2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178(2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046(2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110(2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452(2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcje laminy j drowejlentiwirulowy system ekspresjifragmentacja DNAelektroforeza w eluanaliza Bioanalyzerem

Powiązane artykuły