Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, jednak istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D z wykorzystaniem fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Najnowsze osiągnięcia w inżynierii tkankowej oferują innowacyjne rozwiązania dla wielu chorób. Na przykład inżynieria tkankowa z wykorzystaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) pojawiła się jako nowa metoda w medycynie regeneracyjnej. Chociaż ta regeneracja tkanek jest obiecująca, zanieczyszczenie niechcianymi komórkami podczas hodowli tkankowych jest poważnym problemem. Ponadto istnieje obawa dotycząca bezpieczeństwa dotyczącego rakotwórczości po przeszczepie. Dlatego istnieje pilna potrzeba eliminacji określonych komórek bez uszkadzania innych komórek, które muszą być chronione, zwłaszcza w ustalonej tkance. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórkowej 3D in vitro z fotoimmunoterapią w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) bez uszkadzania komórek niedocelowych. Technika ta umożliwia eliminację określonych komórek z mieszanych kultur komórkowych lub tkanek.
Wprowadzenie
Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, i istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. Obecnie w dziedzinie medycyny regeneracyjnej obiecującym materiałem są hodowle tkankowe z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych (ES), pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) 1-3.
Chociaż ta regeneracja tkanek jest obiecująca, zanieczyszczenie niechcianymi komórkami jest poważnym problemem. Ponadto istnieje obawa dotyc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Poniższy protokół opisuje niezbędne kroki w celu wyeliminowania określonych komórek za pomocą NIR-PIT. Kontrole i inne szczegóły dotyczące NIR-PIT i żywotności komórek można znaleźć w innym miejscu18.
1. Koniugacja IR700 z przeciwciałami monoklonalnymi (mAb)
- Przygotować interesujące nas mAb w dawce 2-5 mg/ml w roztworze 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6).
- Zmieszać 6,8 nmol mAb z 30,8 nmol 10 mM IR700 w roztworze 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) w probówce mikrowirówkowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przykryte folią aluminiową.
- Przemyć kolumnę PD-10 (patrz Tabela mat....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby optycznie monitorować efekt NIR-PIT, linię komórkową A431, która wykazuje nadekspresję EGFR, zmodyfikowano genetycznie tak, aby wyrażała również GFP i lucyferazę (A431-luc-GFP). Jako komórki niebędące celem NIR-PIT, linię komórkową Balb/3T3 zmodyfikowano optycznie w celu ekspresji RFP (3T3-RFP). Zsyntetyzowano APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700). Zgodnie z niniejszym protokołem przygotowano sferoidy mieszane, składające się z różnych proporcji komórek (A431-luc-GFP i 3T3-RFP) (.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Demonstrujemy metodę specyficznej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D bez uszkodzenia komórek niedocelowych za pomocą NIR-PIT. Jak dotąd nie ma praktycznej metody eliminacji komórek po ustaleniu tkanki lub po przeszczepie. Tak więc NIR-PIT jest obiecującą metodą osiągnięcia tego celu. Technika ta może być również stosowana in vivo18,22, ponieważ APC wykazują podobną farmakokinetykę jak sam mAb. Typ ogniwa docelowego można dostosować do różnych APC. Różne przeciwciała lub fragmen.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Program Badań Wewnętrznych National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| IRDye 700DX Ester Farba na podczerwień | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | Kolumna S9763 | |
| Sephadex G25 (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone) | 17-0851-01 | |
| Test białka Coomassie (Bradford) Plus | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | |
| Perfecta3D 96-Well Wiszące płyty upuszczane | 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) | HDP1096-8 | |
| Miernik mocy optycznej | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | |
| LED: L690-66-60 | Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, Stany Zjednoczone) | L690-66-60 | |
| Vectibix (panitumumab) | Amgen (Thousand Oaks, CA, USA) | ||
| 35 mm szklane dno, rozmiar naczynia 35 mm, rozmiar studni 10 mm | Cellvis (Mountain View, CA, Stany Zjednoczone) | D35-10-0-N |
Bibliografia
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- B....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
