Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53633

⸱

14 marca 2016

 ,  , 
1Molecular Imaging Program, National Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, jednak istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D z wykorzystaniem fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT).

Streszczenie

Najnowsze osiągnięcia w inżynierii tkankowej oferują innowacyjne rozwiązania dla wielu chorób. Na przykład inżynieria tkankowa z wykorzystaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) pojawiła się jako nowa metoda w medycynie regeneracyjnej. Chociaż ta regeneracja tkanek jest obiecująca, zanieczyszczenie niechcianymi komórkami podczas hodowli tkankowych jest poważnym problemem. Ponadto istnieje obawa dotycząca bezpieczeństwa dotyczącego rakotwórczości po przeszczepie. Dlatego istnieje pilna potrzeba eliminacji określonych komórek bez uszkadzania innych komórek, które muszą być chronione, zwłaszcza w ustalonej tkance. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórkowej 3D in vitro z fotoimmunoterapią w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) bez uszkadzania komórek niedocelowych. Technika ta umożliwia eliminację określonych komórek z mieszanych kultur komórkowych lub tkanek.

Wprowadzenie

Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, i istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. Obecnie w dziedzinie medycyny regeneracyjnej obiecującym materiałem są hodowle tkankowe z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych (ES), pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) 1-3.

Chociaż ta regeneracja tkanek jest obiecująca, zanieczyszczenie niechcianymi komórkami jest poważnym problemem. Ponadto istnieje obawa dotycząca bezpieczeństwa rakotwórczości po przeszczepieniu4,5. Chociaż wiele badań koncentrowało się na tych kwestiach w celu wyeliminowania określonych komórek, zwłaszcza w medycynie regeneracyjnej 6-8, nie opracowano żadnej praktycznej metody.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) to leczenie oparte na koniugacie przeciwciało-fotoabsorber (APC). APC składa się z swoistego dla komórki przeciwciała monoklonalnego (mAb) i fotoabsorbera IR700. IR700 jest hydrofilową pochodną krzemionki i ftalocyjaniny i sama w sobie nie wywołuje fototoksyczności9. IR700 jest kowalencyjnie sprzężony z przeciwciałem za pośrednictwem reszt amidowych w łańcuchu bocznym cząsteczek lizyny. APC wiąże cząsteczki docelowe na błonie komórkowej, a następnie indukuje niemal natychmiastową martwicę komórek po ekspozycji na światło NIR o długości fali 690 nm. Podczas ekspozycji na światło NIR błona komórkowa pęka, co prowadzi do śmierci komórki 9-14. Udowodniono, że NIR-PIT jest skuteczny w przypadku wielu przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, w tym anty-EGFR, anty-HER2, anty-PSMA, anty-CD25, anty-mezoteliny, anty-GPC3 i anty-CEA15-21. Dlatego NIR-PIT może być stosowany przeciwko szerokiej gamie cząsteczek docelowych. Co więcej, NIR-PIT jest dobrze kontrolowanym zabiegiem, który umożliwia selektywne leczenie określonych obszarów poprzez ograniczenie napromieniowania światłem NIR18,22.

Tutaj prezentujemy metodę specyficznej eliminacji komórek za pomocą NIR-PIT z mieszanych kultur 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Poniższy protokół opisuje niezbędne kroki w celu wyeliminowania określonych komórek za pomocą NIR-PIT. Kontrole i inne szczegóły dotyczące NIR-PIT i żywotności komórek można znaleźć w innym miejscu18.

1. Koniugacja IR700 z przeciwciałami monoklonalnymi (mAb)

  1. Przygotować interesujące nas mAb w dawce 2-5 mg/ml w roztworze 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6).
  2. Zmieszać 6,8 nmol mAb z 30,8 nmol 10 mM IR700 w roztworze 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) w probówce mikrowirówkowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przykryte folią aluminiową.
  3. Przemyć kolumnę PD-10 (patrz Tabela materiałów/wyposażenia) dwukrotnie 15 ml PBS. Załaduj próbkę z kroku 1.2.
  4. Mieszaninę oczyścić za pomocą kolumny PD-10 przez elucję PBS zgodnie z instrukcjami producenta.
    Uwaga: W tym przypadku elucja przebiegała wzdłuż koloru pasma IR700. W przypadku próbki o objętości 300 μl frakcja elucyjna PBS wynosi zwykle od 2,5 ml do 4,4 ml.
  5. Oznaczyć stężenie białka za pomocą barwienia Coomassie, mierząc absorpcję przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru9. Oznaczyć stężenie IR700 z absorpcją przy 689 nm, aby potwierdzić liczbę cząsteczek fluoroforu sprzężonych z każdą cząsteczką mAb9,
    Uwaga: Ważne jest, aby określić optymalną liczbę koniugacji cząsteczek IR700 w 1 mAb za pomocą spektrofotometru. Ogólnie rzecz biorąc, około 3 cząsteczki IR700 w 1 cząsteczce mAb są optymalne zarówno do pracy in vitro, jak i in vivo. Metody HPLC i SDS-PAGE mogą być stosowane w celu potwierdzenia, czy mAb i IR700 są związane, czy nie.
  6. Przechowywać w temperaturze 4 °C po oznaczeniu stężenia białka.

2. Przygotowanie mieszanej hodowli komórkowej 3D (Mieszana sferoida)

  1. Nanieś sterylną wodę (około 1 ml) do części zbiornika na płytki wiszących płytek.
  2. Przygotuj różne proporcje typów komórek będących przedmiotem zainteresowania - komórek A431-luc-GFP i komórek 3T3-RFP - przy czym każda próbka zawiera łącznie 5 000 komórek, zawieszonych w 50 μl pożywki hodowlanej.
    Uwaga: Przygotuj proporcje 1:100, 10: 100, 25:100, 50:100 itd. typów komórek będących przedmiotem zainteresowania w pożywkach hodowlanych w zależności od typu komórki.
  3. Inkubować mieszankę przez 5-7 dni na 96-dołkowej wiszącej płytce kroplowej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni. Uwaga: Aby precyzyjnie wykonać sferoidę 3D, należy obchodzić się z płytką delikatnie, ponieważ krople zawierające komórki łatwo odpadają przed utworzeniem kształtów 3D.
  4. Obserwuj morfologię i rozmiar sferoid za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola przy powiększeniu 10X - 40X. Uwaga: Chociaż zależy to od typów komórek i wielkości wiszącej kropli, upewnij się, że średnica sferoidy wynosi około 400-600 μm po 7 dniach inkubacji w 96-dołkowej wiszącej płytce kroplowej.

3. In Vitro NIR-PIT dla mieszanej hodowli komórkowej 3D

  1. Zmienić pożywkę z wiszących płytek kroplowych na 10 μg/ml koniugat przeciwciało-fotoabsorber (APC) i inkubować przez 6 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
  2. Po 6 godzinach inkubacji przemyć sferoidę dwukrotnie świeżą pożywką hodowlaną (bez czerwieni fenolowej). Delikatnie przenieść sferoidę do naczynia o średnicy 50 mm ze szklanym dnem ze 100 μl świeżej pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej, używając sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką. Umieść jedną sferoidę w każdym naczyniu.
  3. Obserwuj sferoidę za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola, aby wykryć zmianę morfologii. Do obserwacji reporterów optycznych (np. GFP i RFP) należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z następującymi ustawieniami filtra: GFP — filtr wzbudzenia 469 nm i filtr emisyjny 525 nm; RFP — filtr wzbudzenia 559 nm i filtr emisyjny 630 nm.
  4. Umieść diodę elektroluminescencyjną (LED) nad naczyniem ze szklanym dnem w celu naświetlania.
    Uwaga: Sferoidy mogą być wystawione na działanie światła NIR zarówno pod mikroskopem, jak i w osłonie laminarnej.
    1. Zmierz gęstość mocy światła NIR za pomocą miernika mocy optycznej9. Zgodnie z tym pomiarem, naświetlaj światło NIR za pomocą diod elektroluminescencyjnych (LED), które emitują światło o długości fali od 670 do 710 nm przy 2 J/cm2,
      Uwaga: Światło LED może wniknąć na maksymalną głębokość około 5 cali. Działanie cytotoksyczne NIR-PIT jest zależne tylko od danej energii, niezależnie od gęstości mocy i czasu ekspozycji23.
  5. Po napromienieniu przenieść sferoidę na nową wiszącą płytkę kroplową z 50 μl świeżej pożywki hodowlanej i inkubować przez 1 dzień w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
  6. Delikatnie przenieść sferoidę do naczynia ze szklanym dnem ze 100 μl świeżej pożywki hodowlanej (bez czerwieni fenolowej) za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką. Obserwuj sferoidę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 1 dzień po NIR-PIT, używając ustawień filtra opisanych w kroku 3.3.
    1. Wykryć martwe komórki, dodając jodek propidyny do pożywki w końcowym stężeniu 2 μg / ml lub przez utratę cytoplazmatycznej fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Figura 2B)14,18,22.
  7. Powtórz kroki 3.1-3.6, jeśli komórki docelowe nie zostaną całkowicie wyeliminowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby optycznie monitorować efekt NIR-PIT, linię komórkową A431, która wykazuje nadekspresję EGFR, zmodyfikowano genetycznie tak, aby wyrażała również GFP i lucyferazę (A431-luc-GFP). Jako komórki niebędące celem NIR-PIT, linię komórkową Balb/3T3 zmodyfikowano optycznie w celu ekspresji RFP (3T3-RFP). Zsyntetyzowano APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700). Zgodnie z niniejszym protokołem przygotowano sferoidy mieszane, składające się z różnych proporcji komórek (A431-luc-GFP i 3T3-RFP) (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Demonstrujemy metodę specyficznej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D bez uszkodzenia komórek niedocelowych za pomocą NIR-PIT. Jak dotąd nie ma praktycznej metody eliminacji komórek po ustaleniu tkanki lub po przeszczepie. Tak więc NIR-PIT jest obiecującą metodą osiągnięcia tego celu. Technika ta może być również stosowana in vivo18,22, ponieważ APC wykazują podobną farmakokinetykę jak sam mAb. Typ ogniwa docelowego można dostosować do różnych APC. Różne przeciwciała lub fragmen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Program Badań Wewnętrznych National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IRDye 700DX Ester Farba na podczerwieńLI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011
Na2HPO4SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)Kolumna S9763
Sephadex G25 (PD-10) GE Healthcare (Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone)17-0851-01
Test białka Coomassie (Bradford) PlusThermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)PI-23200
Perfecta3D 96-Well Wiszące płyty upuszczane3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)HDP1096-8
Miernik mocy optycznejThorlabs (Newton, NJ, USA)PM100
LED: L690-66-60Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, Stany Zjednoczone)L690-66-60
Vectibix (panitumumab)Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35  mm szklane dno, rozmiar naczynia 35  mm, rozmiar studni 10  mmCellvis (Mountain View, CA, Stany Zjednoczone)D35-10-0-N

Bibliografia

  1. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  2. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  3. Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).
  4. Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).
  5. Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143 (4), 508-525 (2010).
  6. Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).
  7. Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
  8. Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).
  9. Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).
  10. Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12 (1), 345(2012).
  11. Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).
  12. Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).
  13. Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).
  14. Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).
  15. Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).
  16. Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9 (11), 113276(2014).
  17. Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).
  18. Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
  19. Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).
  20. Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).
  21. Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).
  22. Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).
  23. Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14 (1), 389(2014).
  24. Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).
  25. Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).
  26. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom rkowakoniugacja IR700przeciwcia a monoklonalnep ytka do metody wisz cej kroplimikroskopia fluorescencyjnajodek propidynypomiarowy miernik mocy optycznejdioda elektroluminescencyjna
Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.